Summary
En enkelt-molekylet magnetiske pinsett plattform å manipulere G-quadruplexes er rapportert, gir mulighet for studiet av G4 stabilitet og regulering av ulike proteiner.
Abstract
Ikke-kanoniske nukleinsyre sekundære struktur G-quadruplexes (G4) er involvert i ulike cellulære prosesser, som DNA-replikasjon, transkripsjon, RNA behandling og telomere forlengelse. Under disse prosessene, ulike proteiner binde og løse G4 strukturer for å utføre sin funksjon. Som funksjonen til G4 ofte avhenger stabiliteten i foldet strukturen, er det viktig å undersøke hvordan G4 bindende proteiner regulere stabiliteten på G4. Dette arbeidet gir en metode for å manipulere enkelt G4 molekyler ved hjelp av magnetiske pinsett, som gjør studier av regulering av G4 bindende proteiner på et enkelt G4 molekyl i sanntid. Generelt passer denne metoden for et stort spekter av programmer i studier for proteiner/ligander interaksjoner og forskrift om ulike DNA eller RNA sekundære strukturer.
Introduction
Fire-strandet DNA eller RNA G4 strukturer spille viktige roller i mange viktige biologiske prosesser1. Mange proteiner er involvert i G4 bindende og regulering, inkludert telomere bindende proteiner (telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, transkripsjonsfaktorer (nucleolin, PARP1)3, RNA behandling proteiner (hnRNP A1 hnRNP A2)4, helicases (BLM, FANCJ, RHAU, ADV, Dna2, Pif1)5og utryddelse relaterte proteiner (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Protein kan stabilisere eller destabilisere G4 strukturer; Dermed regulerer de påfølgende biologiske funksjonene. Stabiliteten på G4 ble målt ved termisk smelter bruker ultrafiolett (UV) eller sirkulær dichroism (CD) metoder7. Slike forhold er imidlertid ikke fysiologiske relevante og er vanskelig å bruke å studere virkningene av bindende proteiner7.
Den raske utviklingen i enkelt-molekylet manipulasjon teknologi har aktivert studier av folding og utfolder seg i en biomolecule, for eksempel en DNA eller en protein, på en enkelt-molekylet nivå med nanometer oppløsning i sanntid8. Atomic force mikroskopi (AFM) og optiske pinsett magnetiske pinsett er mest brukte single-molekylet manipulasjon metoder. I forhold til AFM og optisk pinsett9, tillater magnetiske pinsett stabil målinger av folding-utspiller seg dynamikken i et eneste molekyl dager ved hjelp av en anti-drift teknikk10,11.
Her er en enkelt-molekylet manipulasjon plattform ved hjelp av magnetiske pinsett for å studere regulering av G4 stabilitet ved å binde proteiner rapporterte12,13. Dette verket beskriver de grunnleggende tilnærmingene, inkludert eksempler og flyt kanal forberedelse, oppsettet av magnetiske pinsett og force kalibreringen. Styrke kontrollen og anti-drift protokollene som beskrevet i trinn 3 tillater lang tid målene under ulike force kontroller som konstant (force klemme) og konstant lasting rate (force-rampen), og styrke-hopp måling. Force kalibrering protokoll beskrevet i trinn 4 kan styrke kalibrering av < 1 µm kort festeseler over en bred styrke rekkevidde opptil 100 pN, med en relativ feil innen 10%. Et eksempel på regulering av stabiliteten av RNA Helicase knyttet til AU-rik element (RHAU) helicase (alias DHX36, G4R1) som spiller viktige roller i å løse RNA G4 brukes til å vise programmer denne plattformen13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av G4 DNA for Single-molekylet strekke
- forberede 5 '-thiol merket og 5 '-biotin merket dsDNA håndtak av PCR bruke DDNA utvalg på lambda phage DNA mal bruker 5 '-thiol og 5 '-biotin primere 14 ( figur 1). Begge dsDNA håndterer har høy GC innhold (> 60%) for å hindre DNA smelter når DNA holdes på høy styrker eller under DNA overstrekking overgang 15.
- Renser PCR produkter med en kommersiell rensing kit og fordøye BstXI begrensning enzym ifølge produsenten ' s protokollen.
- Ligate G4 danner ssDNA og flanke ssDNA og dsDNA behandler ved hjelp av T4 DNA ligase ifølge produsenten ' s-protokollen. Rense ligated produktet av gel utvinning bruker en kommersiell rensing kit ifølge produsenten ' s protokollen.
2. Utarbeidelse av flyt kanal
- dekkglassvæske rengjøring og overflate functionalization
- sted bunn coverslips (#1.5, 22 mm × 32 mm) og øverste coverslips (#1.5, 20 x 20 mm) i dekselet glass flekker glass (hver glasset kan holde 7 stykker av coverslips, volumet er ~ 20 mL). Skyll coverslips i glassene med destillert vann 2 - 5 ganger.
- Legg til ~ 20 mL 5-40% rengjøringsmiddel i hver jar og deretter sted i ultralydbad med rengjøring for 30 min. skyll med destillert vann for > 10 ganger å fjerne smuss.
- Tørr coverslips i glassene i ovnen (~ 150 ° C; Forsiktig, varmt), eller N 2 gass. Lagre den tørkede øverste coverslips i en tørr skap.
- Bruk plasma (O 2 gass) å rengjøre coverslips i glasset i 10 min. Under 10 min, forberede 20 mL 1% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) løsning i metanol (Advarsel, giftige/brannfarlige). Bruke kjemiske avtrekksvifte for å oppløse APTES i metanol.
Merk: Unngå fuktighet ved lagring APTES løsning. Gamle APTES ofte forårsaker problemet i overflaten functionalizing av coverslips. - Umiddelbart etter plasma renhold, legge til alle 1% APTES løsningen i glassene og ruge for 1 h. hell avfall i avfall flasken spesifikke for 1% APTES metanol. Utføre metanol-relaterte trinnene i avtrekksvifte for brennbare kjemikalier.
- Skyll glassene gang med metanol og > 10 ganger med destillert vann og deretter tørke av ovnen (~ 150 ° C; Forsiktig varm). Lagre APTES-belagt nederste coverslips i en tørr regjering om ikke i bruk i to uker.
Merk: Etter hvert sub trinn fra 2.1.1 2.1.4,-rengjøringen, kan pauses før neste trinn.
- Sette flyt kanalen
- forberede to " avstandsstykker ", dvs., parafilm eller dobbeltsidig tape (~ 4 mm × 20 mm) for hver kanal. Plass de to stykker av avstandsstykker på en bunn dekkglassvæske langs langsiden. Plasser en topp dekkglassvæske på avstand, danner en flyt celle i mellom (~ 10 mm × 20 mm området, figur 2A , B).
- Hvis parafilm brukes som et avstandsstykke, plassere flyt kanalen på en ovn (60-120 ° C; Forsiktig varm) for 5-10 s mens du forsiktig trykker sidene av den øverste dekkglassvæske å holde de to coverslips sammen med parafilm. Den resulterende strømmen kanalen har en høyde på ~ 100 µm, og dermed volumet av kanalen er ~ 20 µL.
- Sel langsiden av kanalen med silikon lim for å unngå. Bruker silikon for å gjøre en liten vask-lignende struktur på hver åpen kant av flyt kanalen, som fungerer som en inngang og utgang løsning.
Merk: Inn- og utreise kan også gjøres ved andre måter, f.eks av overholde liten plast ringer ved hjelp av voks. - Lagre kanaler i en tørr skap i opptil fire uker.
- Tjore DNA på undersiden av flyt kanalen
- fortynne amino-belagt polystyren perler (diameter: 3 µm) av 200 X i destillert 1 X fosfat bufret saltvann (PBS) buffer. Vortex perle løsningen og deretter strømmer inn kanaler. Inkuber perle løsningen i kanaler for ~ 30 min. fjerne alle unstuck perler ved å vaske med 200 µL 1 X PBS bufferen.
- Juster (økning/reduksjon) inkubasjon som tiden oppnå en overflate tetthet av 1-5 perler per 50 x 50 mm område. Lagre kanalene satt med referanse perler for opptil 3 dager.
- Dilute sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC) pulver til 1 X PBS løsning (~ 0,5 mg/mL). Vortex løsningen og deretter strømmer inn kanalen.
Merk: Forberede frisk Sulfo-SMCC løsning før bruk og legge det umiddelbart til kanalen å unngå hydrolyzation av SMCC. - Incubate SMCC løsningen i kanalen for 30 min. fjerne den SMCC løsningen ved å vaske med stor (1 mL, ~ 50 X kanal volumet) 1 X PBS løsning.
Merk: Vask den overskytende SMCC nøye. Dette trinnet er svært viktig for innbindingen av DNA på dekkglassvæske. - DNA tethering
- fortynne thiol-biotin merket DNA i 1 X PBS, med en resulterende DNA konsentrasjon av ~ 0,3 nM. Pipetter forsiktig å blande løsningen, flyte DNA løsningen i SMCC-belagt kanalen og ruge i 30 min ved romtemperatur (~ 23 ° C).
- Vask forsiktig bort gratis DNA med 200 µL av blokkering løsning som inneholder 1 X PBS med 10 mg/mL bovin serum albumin (BSA) og 0,01% 2-Mercaptoethanol.
- Blokkere kanal overflaten av rugende kanalen i blokkering løsning (10 mg/mL BSA, 0,01% 2-Mercaptoethanol) for > 2 h; etter dette trinnet, kanalen er klar for eksperimenter. Forberedt kanalen kan holdes på 4 ° C for ~ 1 dag.
Merk: Det blokkerende trinnet er viktig for å redusere ikke-spesifikk binding av DNA og magnetiske perler til coverslips.
3. Magnetisk pinsett oppsett og identifikasjon av enkelt dsDNA tjore
- magnetisk pinsett oppsett
- Start magnet pinsett kontrollere programmet. Her, de magnetiske pinsett var kontrollert av et i-in-House-skrevet LabVIEW program.
- Juster magnet sentrene før montering kanalen. Bruk en 4 X linsen til å justere den x - og y - aksen av magneter i den optiske aksen til mikroskopet.
- Bruker en datastyrt motorisert manipulator flytte magneter langs z-retningen ( figur 2A) og sette avstanden som d = 0 (d: avstanden mellom magneter og dekkglassvæske) når magneter kobler til en dekkglassvæske på mikroskopet.
- Program bevegelsen av magneter gjennom manipulatoren å oppnå kontroll av kraften, inkludert konstant kraft (dvs., konstant d) og tiden varierende tvinge F (t) (dvs. tid varierende d(t )).
- Bruke lyse lyskilde lysdiode (LED) for tilbake-spredt belysning av perlen gjennom målet. Samle perle bildene på en samplingsfrekvens på 100 Hz ved en kostnad - sammen enhet (CCD) kameraet. < /lJeg >
- prøve oppsett og identifisere enkelt dsDNA tjore
- tjore formasjon
- Forsiktig flyt i 200 X fortynnet M-280, spinn perler i analysen løsning (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7.4 ) inn i en kanal. Inkuber i 10 min å tillate perler å binde til biotin-merket DNA molekyler immobilisert på SMCC-belagt overflaten gjennom thiol-merket. Vask forsiktig bort un-bundet perler med 200 µL av standard reaksjon løsning.
Merk: M-280 perler vise lavere uspesifisert binding til overflaten sammenlignet med andre kommersielle magnetiske perler som M-270.
- Forsiktig flyt i 200 X fortynnet M-280, spinn perler i analysen løsning (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7.4 ) inn i en kanal. Inkuber i 10 min å tillate perler å binde til biotin-merket DNA molekyler immobilisert på SMCC-belagt overflaten gjennom thiol-merket. Vask forsiktig bort un-bundet perler med 200 µL av standard reaksjon løsning.
- Montere kanalen på mikroskopet scenen. Søk etter perlene på undersiden bruk av 100 X nedsenking oljeobjektiv.
- Velg en referanse perle på overflaten og en bevegelig bundet perle. Bygge første bildebiblioteker av både referanse perle og bundet perle på ulike defokus fly.
- Kalibrering av perler bilde
- før eksperimenter, bruke en objektiv piezo aktuator for å få bilder av både referanse og bundet perler på ulike defokus fly linjeavstand av 20-50 nm, som lagres som to separate perle bilde biblioteker og er henholdsvis indeksert med defokus avstanden ( figur 2D).
- x, y, z posisjon besluttsomhet
- under eksperimenter, bestemme plasseringen av perlen i x-y flyet ved perle centroid. Bestemme høyden endring av bundet perle ved å sammenligne gjeldende perle bilde med de som er lagret i biblioteket. Bruke auto-korrelasjon funksjon analyse av makt spekteret av Fourier-transformere perle bilder 16.
- Anti-drift feedback ved hjelp av referanse perle
- under eksperimenter, bruke piezo til " lås " avstanden mellom målet og en spesiell referanse perle bildet lagret i biblioteket gjennom en lav frekvens tilbakemelding kontroll, slik at fast perle bildet har den beste sammenhengen med et bestemt bilde lagret i biblioteket ( figur 2D).
- Finne ut om tjore er et enkelt dsDNA molekyl ved å bruke ~ 65 pN force bestemme et enkelt dsDNA molekyl hvis tjore gjennomgår karakteristiske DNA overstrekking overgang 17 , 18 , 19. Gjenta prosessen til en enkelt dsDNA tether finnes. (Se neste avsnitt for force kalibrering og DNA overstrekking overgang).
- tjore formasjon
4. Magnetisk pinsett tvinge kalibrering
- direkte bestemme styrken (opptil 100 pN) for lang DNA (48,502 bp λ-DNA) molekyler med perle svingninger gjennom:
, der k B er ladninger, er temperaturen i Kelvin skala, ses 2 y er variansen av perle svingninger i retning vinkelrett på det magnetiske feltet og force retning. I denne retningen, kan bevegelse perle beskrives som en pendel svingning med en lengde på l + r 0, der l er gjennomgående avstanden force retning (filtypen) DNA, og r 0 radius av perle 10 ( figur 3A). - Bestem kalibreringskurven styrke F som en funksjon av magneter perle stykke d, og F (d) for forskjellige perler med lang λ-DNA. Avstanden mellom magneten og dekkglassvæske er vanligvis brukt som DNA tjore lengden kan ignoreres. Passer F-d kurven av funksjonen dobbel-eksponensiell decay:
, der montering parameterne α1, α2, γ1, γ2 bestemmes av den magnetisk pinsett og parameteren C bestemmes av egenskapen heterogen av de magnetiske perlene. Av skiftende C, F-d kurve fra forskjellige perler kan være overlappende 10 ( figur 3B). - Kalibrering av parameteren C for individuelle magnetiske perler for kort DNA eksperimenter.
- å bestemme styrken basert på svingninger krever opptak perle posisjon på en frekvens som er høyere enn hjørnet frekvensen:
, der den ble er dra koeffisient av perle. For kort DNA på høy kraft, den krever registrering frekvens raskere enn 100 Hz, derfor styrken ikke kan direkte måles basert på svingninger med kameraet. Imidlertid parameteren C kan bestemmes ved å måle styrken på en lav tvinge utvalg (< 15 pN) bruker svingninger og tilpasse dataene med en kalibrert F-d kurve å få parameteren C 20. - Eventuelt for eksperimenter med dsDNA, angi parameteren C ved hjelp av DNA overstrekking overgang til en styrke på ~ 65 pN ( Figur 3 c) 21 , 22 , 23 ved d stilling til hvilke dsDNA viste forlengelsen hoppe (0,6 X lengde økning i omkrets). Etter at parameteren C, beregne for bundet perlene.
- å bestemme styrken basert på svingninger krever opptak perle posisjon på en frekvens som er høyere enn hjørnet frekvensen:
- Styre lasting hastigheten ved programmering bevegelsen av magneter gjennom den inverse funksjonen F (d). Magneten bør tilnærming prøven dobbel eksponentielt.
Merk: Relative feilen av makt bestemmes av slik en ekstrapolering metoden er ~ 10%, og er hovedsakelig forårsaket av perle radius heterogenitet 20.
5. Single-molekylet manipulasjon av G4 i tilstedeværelse og fravær av bindende proteiner
- Force-rampen eksperimenter
- etter å identifisere dsDNA tjore, skanner styrke-økning på en overføringshastighet på 0,2 pN/s etterfulgt av en Force-sykdom skanne-0.2 pN/s. Etter hver strekker syklus, holde DNA molekylet på 1 pN for 30 å tillate ssDNA å refold til G4.
- Force-hopp eksperimenter
- sykle kraft mellom 54 pN for 30 s som en foldet G4 kan foldes og 1 pN for 60-tallet som et foldet G4-15T kunne refold.
- Flytende protein løsning
- Flow protein løsningen ved ~ 20 pN force å unngå vedlegg av perler til dekkglassvæske. DEAH-boksen RHAU helicase, som viste høy spesifisitet G4 strukturen, var brukt 24. Rekombinant Drosophila melanogaster RHAU (DmRHAU) helicase ble uttrykt i Escherichia coli og renset som beskrevet tidligere 25. G4 slappe aktiviteten til DmRHAU var assayed på en tetramolecular G4 DNA substrat 13.
- Analysere unfolding makt bruker en skrevet Matlab programmet 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksperimentoppsettet for å strekke et enkelt G4 molekyl er vist i Figur 4. En enkelt-strandet G4 danner sekvens spredt mellom to dsDNA håndtak var bundet mellom en dekkglassvæske og en spinn perle. Du finner en enkelt dsDNA bundet perle ved ble en overstretching analysen utført ved å øke styrken på konstant lasting. Tre typer målinger ble ofte brukt for å studere den folding og utfoldelsen av biomolecules: (i) konstant force måling, (ii) force-rampen måling og (iii) styrke-hopp måling. På grunn av ytterst langsom unfolding utbredelsen av denne G4 strukturen likevekt folding-unfolding overgang kan bare forekomme for tiden over dager, så kraft-rampen og styrke-hopp målinger brukt for å karakterisere den unfolding kinetics og stabilitet av G4 strukturer.
Force-rampen mål for G4 utspiller seg i tilstedeværelse eller fravær av RHAU Protein:
Figur 4B viser typisk kraft-utvidelse kurver oppnås ved en styrke-økning skanne frekvensen lasting av 0,2 pN/s etterfulgt av en kraft-sykdom skanning på-0.2 pN/s. Etter hver strekker syklus, DNA molekylet holdt på 1 pN for 30 å tillate ssDNA å refold til G4. Utvidelse hoppe i styrke-økning skanningen indikerte en unfolding overgang av G4. Når du bruker en ikke-G4 danner sekvens, kan plutselig forlengelsen hoppe observeres. Unfolding force fordelingen kan hentes ved styrkene i som utspiller seg oppstod. Den unfolding tvinge distribusjon av G4-15T på 0,2 pN/s viste en enkelt peak på ~ 52 pN. Men i nærvær av 10 nM RHAU, G4-15T forble foldet under styrke-økning skanningen for opptil 60 pN, indikerer G4 stabilisering av RHAU bindingen. I nærvær av 10 nM RHAU og 1 mM ATP, ble unfolding force distribusjonen flyttet til en lavere styrke, antyder en ATP-avhengige destabilisering av G4 av RHAU.
Styrke-hopp målinger av G4 utspiller seg i tilstedeværelse eller fravær av RHAU Protein:
Figur 5 viser et representativt spor perle høyde under fire styrke-hopp sykluser (figur 5, venstre); kraften til molekylet var syklet mellom 54 pN for 30 s som en foldet G4 kan foldes og 1 pN for 60 s som en foldet G4-15T kan refold. Den gjennomsnittlige levetiden til foldet G4-15T på 54 pN var ~ 6.4 s, anslått av passende levetid histogrammet med en eksponensiell decay funksjonen13. Etter i en løsning av 10 nM RHAU helicase uten ATP, utvidelsen av bundet DNA forble på brettet nivå hele 30 s holder tiden på 54 pN, som angir at RHAU sterkt stabiliserer G4-15T strukturen mot mekanisk utspiller seg i den fravær av ATP. Etter 10 nM RHAU og 1 mM ATP, var utvidelsen av samme molekyl rett etter hoppe fra 1 pN til 54 pN på nivå med oppslåtte ssDNA, som indikerer at RHAU destabilizes G4 strukturen i nærvær av ATP.
Figur 1: Forberedelse G4 DNA for single-molekylet strekker eksperimenter.
DsDNA håndtak ble utarbeidet av PCR bruker 5-thiol og 5'-biotin primere. PCR produkter ble renset og fordøyd med BstXI begrensning enzymet og ble renset ved gel utvinning. G4 danner ssDNA, to flanke ssDNA og dsDNA håndtaket var samskrevet ved hjelp av T4 DNA ligase. Ligated produktet var renset av gel utvinning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Skisser av grunnleggende magnetiske pinsett apparater.
(A) skisse av en flyt kanal med et par magneter som er plassert over og et mikroskopi mål plassert under. (B) skisse av en samlet flyt kanal der blå farget rektangler representerer den øvre og nedre coverslips, og grå elliptiske linjene representerer inn- og utreise av flyt kanalen. (C) skisse styrkegenerering og kalibrering av magnetiske pinsett. (D) eksempler på bilder av både referanse perle og flytte perle på forskjellige de fokus posisjoner lagret i bildebiblioteker perle. Rød tegn angir perle referansebildet på en bestemt de fokus flyet brukes til fokalplanet låsing. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Tvinge kalibrering magnetiske pinsett.
(A) kalibrering av makt bruker svingninger perle langs en rotasjon-fri y-retning. X-akse er langs samme retning som det magnetiske feltet. Force er langs z-aksen og styres ved å justere avstanden, d, mellom permanent magnet paret og i dekkglassvæske. (B) kalibrering av ved hjelp av en lang 48,502 bp-DNA. Heterogen magnetiske perle eiendom kan beskrives av en enkelt-parameteren C. Dette tallet er endret fra10. (C) kalibrering av parameteren C en magnetisk perle festet på en 2 kb-DNA bruker B s overstrekking overgang. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Single-molekylet manipulering av en G4.
(A) skisse av en strekk enkelt G4 struktur og måle de unfolding begivenhetene. (B) typisk eksempel på styrke-økning (cyan) og kraft-reduksjon kurven av en bundet G4. Dette tallet er endret fra12. (C) Force-utvidelse kurven av G4 i fravær (grå) eller tilstedeværelse (rosa) RHAU protein. (D) Unfolding tvinge distribusjon av G4 i fravær (grå) (n = 140) eller tilstedeværelse (rød) av RHAU og ATP (n = 117). Dette tallet er endret fra13. Klikkher for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Styrke-hopp målinger av G4 unfolding.
(A) representant tid spor av perle høyde endringen i kraft hoppe sykluser mellom 1 pN og 54 pN målt uten DmRHAU, med 10 nM DmRHAU men uten ATP, og både 10 nM DmRHAU og 1 mM ATP, som vist i figur-panelet. (B) representant tid spor av filtypen endring av et G4 molekyl (grå data) etter hoppe til 54 pN i flere styrke-hopp sykluser tatt fra data i (A). Utvidelsene tilsvarer brettet (F) og brettet (U) G4 angis også; G4 Utfolding hendelsene angis med piler. Dette tallet er endret fra13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som beskrevet ovenfor, en plattform for studerer mekanisk stabilitet av G4 DNA og interaksjoner protein G4 bruker rapporteres single-molekylet magnetiske pinsett. Medfølgende plattformen, er høyeffektive protokoller for å finne G4 DNA tether og måling av folding-utspiller seg dynamikken og stabilitet av G4 strukturen med nanometer spesielle oppløsning utviklet. Fokalplanet låsing gjør svært stabile anti-drift kontroll, som er viktig for å oppdage en liten struktur overgang som G4 (trinn størrelse ~ 7 nm) og interaksjoner med proteiner i bufferen exchange eksperimenter. Denne plattformen har nylig vært ansatt til studier av folding og unfolding dynamikken i telomeric G414 og c-Myc formidler G412, samt studier G4 bindende protein RHAU helicase13.
En typisk eksperiment feil er uspesifisert binding av DNA og perler på dekkglassvæske eller flere DNAs binde til magnetiske perler. For å redusere ikke-spesifikk bindingen, første lagring av kjemikalier som APTES og SMCC må sjekkes rutinemessig. Det andre, er det viktig å velge en riktig magnetiske perle og blokkere ikke-spesifikk bindingen. 10 mg/mL BSA buffer eller liten DNA oligo, som poly T, kan for å blokkere hydrofobe overflaten av perlene redusere uspesifisert bindingen. Til slutt, en enkelt DNA tether kan lett skilles fra flere DNA festeseler av karakteristiske DNA overstrekking overgang17,18,19.
Foreløpig posisjon fastsettelse av plattformen er basert på perlen imaging analyse, som har en begrenset romlig oppløsning på ~ 2 nm. I tillegg har en begrenset samplingsfrekvens på ~ 100 Hz, hovedsakelig på grunn av begrenset ervervelse rate av typiske CCD kameraer og sammenheng analyse av bildene. Disse begrensningene kan overvinnes ved hjelp av totale interne refleksjon mikroskopi (TIRF) belysning. Den produserer et tynt lag av evanescent lys som eksponentielt henfaller med høyde fra overflaten, som kan brukes til å bestemme filtypen endring av kort molekyler i høy signal-til-støy forholdet, mens du unngår perle bildeopptak og analyse26 . En annen begrensning er at det er utfordrende å direkte visualisere bundet molekyl eller ligand bundet til bundet molekylet med fluorescens imaging i vertikale strekk design, som kan overvinnes ved å strekke molekyler i fokalplanet hjelp tverrgående magnetiske pinsett27. Til slutt, gjeldende utforming av reaksjon kanalen ikke tillater rask løsning exchange på grunn av flyt forstyrrelsene til molekylet. Videre kan en stor dra kraft generert på høyhastighets flyt selv bryte festeselene. Denne begrensningen kan overvinnes ved å manipulere festeseler inne microwells plassert på undersiden av kanalen28.
G4 stabiliserende forbindelser anses nå som potensielle terapeutiske mål for sykdommer, inkludert kreft, virus relaterte sykdommer og neurodegeneration sykdommer29,30,31. Protokollen kan brukes til et bredt spekter av G4 bindende proteiner2 og små ligander32. I tillegg til programmer i G4 studier, kan denne plattformen samt protokollene, i prinsippet brukes for studier av andre nukleinsyrer sekundære strukturer, inkludert DNA og RNA hårnåler, tripleks og jeg-motiv33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Meng Pan for korrekturlesing av manuskriptet. Dette arbeidet er støttet av Singapore departementet for utdanning akademisk forskning fondet Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) til J.Y.; National Research Foundation gjennom Mechanobiology Institute Singapore til J.Y.; National Research Foundation, Statsministerens kontor, Singapore, under sitt NRF Investigatorship program (NRF Investigatorship Award nr. NRF-NRFI2016-03 til J.Y.; Grunnforskning fondet for sentral universitetene (2017KFYXJJ153) til H. Y.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA PCR primers | IDT | DNA preparations | |
| DNA PCR chemicals | NEB | DNA preparations | |
| restriction enzyme BstXI | NEB | R0113S | DNA preparations |
| coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) | BMH.BIOMEDIA | 72204 | flow channel preparation |
| Decon90 | Decon Laboratories Limited | flow channel preparation | |
| APTES | Sigma | 440140-500ML | flow channel preparation |
| Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | flow channel preparation |
| M-280, paramganetic beads,streptavidin | ThermoFisher Scientific | 11205D | flow channel preparation |
| Polybead Amino Microspheres 3.00 μm | Polysciences, Inc | 17145-5 | flow channel preparation |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250-250ML | flow channel preparation |
| Olympus Microscopes IX71 | Olympus | IX71 | Magnetic tweezers setup |
| Piezo-Z Stages P-721 | Physik Instrumente | P-721 | Magnetic tweezers setup |
| Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | Magnetic tweezers setup |
| CCD/CMOS camera | AVT | Pike F-032B | Magnetic tweezers setup |
| Translation linear stage | Physik Instrumente | MoCo DC | Magnetic tweezers setup |
| LED | Thorlabs | MCWHL | Magnetic tweezers setup |
| Cubic Magnets | Supermagnete | Magnetic tweezers setup | |
| Labview | National Instruments | Magnetic tweezers setup | |
| OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | Data analysis |
References
- Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
- Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
- Gonzalez, V., Hurley, L. H. The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity. Biochemistry. 49 (45), 9706-9714 (2010).
- Wang, F., et al. telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).
- Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L.
- Schiavone, D., et al. PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells. Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).
- Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. Stability and kinetics of G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).
- Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Chen, H., et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces. J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).
- You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation. J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).
- You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis. Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).
- You, H., et al. Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension. Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).
- Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. Two distinct overstretched DNA states. Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).
- Fu, H., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Chen, H., et al. Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA. Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Fu, H. X., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
- Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
- De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).
- Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).
- Le, S., et al. Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies. Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).
- Neidle, S. Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets. J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).
- Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome. FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).
- Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy? Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).
- Amato, J., et al. Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives. J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).
- Wells, R. D. Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease. Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).
