Summary
이 문서는 빛과 곤충의 내부 및 외부 눈 해부학 공부에 전자 현미경 검사 법에 기술 제품군을 설명. 개미 눈, 상세한 문제 해결, 그리고 다른 표본 및 관심 영역에 대 한 최적화에 대 한 제안에 대 한 작업에 대 한 최적화의 전통적인 기법 여러 개 포함 됩니다.
Abstract
이 문서는 가벼운 현미경 검사 법 (LM)에서 기술의 제품군 설명 및 전자 현미경 (EM) 곤충의 내부 및 외부 눈 해부학을 공부 하는 데 사용할 수 있습니다. 전통적인 조직학 기술 작품 개미 눈에 대 한 최적화 및 전송 전자 현미경 (TEM)과 주사 전자 현미경 (SEM)과 같은 다른 기술 함께에서 작동 하도록 적응 포함 됩니다. 이러한 기술을 훨씬 유용 하지만 어려울 수 있습니다 초보자 현미경에 대 한 큰 강조 다른 표본에 대 한 최적화 및 문제 해결이 문서에서 배치 되었습니다. 우리는 (사진-현미경과 sem의) 전체 표본에 대 한 이미징 기술에 대 한 정보를 제공 하 고 그들의 장점과 단점을 토론. 우리 전체 눈 렌즈 직경 결정에 사용 되는 기술 하 고 개선에 대 한 새로운 기술에 이야기. 마지막으로, 우리는 LM 및 가장, 샘플 준비에 관련 된 기술 토론 단면, 얼룩, 및 이러한 샘플 영상. 우리는 한 때 샘플 준비와 그들을 주위에 이동 하는 최선의 방법을 모른다는 장애물 논의.
Introduction
비전 대부분의 동물에 대 한 중요 한 감각 양식 적임 이다. 시력은 정확히 파악 목표의 수립 및 노선, 준수 및 나침반 정보1,2를 얻기 위한 탐색의 맥락에서 특히 중요 합니다. 곤충 겹 눈의 쌍을 사용 하 여 시각적 정보를 감지 하 고, 경우에 따라 1 ~ 3 dorsally 배치 간단한 눈 이라고 ocelli3,,45.
개미 눈은 특정 관심의 개미 멋지고 다양 한 동안, 그들은 종에 걸쳐 몇 가지 중요 한 특성을 보존 하기 때문에. 해부학, 크기, 및 생태학에 있는 극적인 변화에도 불구 하 고 대부분의 eusocial 고 식민지;에 살고 그 결과, 다른 종 중앙 장소 및 리소스 사이 앞뒤로 탐색 하는 점에서 비슷한 시각 도전 얼굴. 개미에 걸쳐 동일한 기본적인 눈 bauplan 엄격히 야행성 종, 독점적으로 일주와 느린 시각적 포식 자6,7, 뛰어 드는 지 하 도보에서 몸 길이 0.5-26 m m에서 배열 하는 동물에서 관찰 될 수 있다 8,,910. 이러한 엄청난 차이 생태와 행동의 모든 동일한 기본 눈 구조에 맞게 다양 한 환경, 라이프 스타일, 바디 크기11,12의 무수 한 순열에 일으키. 결과적으로 개미의 시각적인 생태 공부 전함 매장 물 결정된 탐정에 게 가능성을 제공 합니다.
곤충의 시각 시스템을 이해 그들의 행동 능력에 대 한 통찰력을 확보에 필수적 이다. 이것은 명백한 멋지게 생태와 동작 몇 가지 곤충 그룹 (예를 들어, 참조13,,1415,16, 에서 큰 성공을 해부학을 결합 하는 통합 연구에서 17). 개미 탐색 및 개미 행동 분야 일반적으로 꽤 성공 했습니다, 비록 매우 작은 강조 몇 가지 선택한 종족 이외의 개미 비전에 배치 되었습니다. 여기, 우리는 개미의 눈 디자인 조사에 관련 된 기술에 정교한 것 이다. 우리는 개미에 집중할 것 이다, 하는 동안 이러한 기술은 적용할 수 있습니다, 다른 곤충에 약간의 수정도.
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Protocol
1. 견본 준비
참고: 그것은 화합물 눈 ocelli 서로 하 고 머리에의 상대 위치를 먼저 이해 하는 데 필요한. 이것은 머리의 등 쪽 보기의 이미지를 획득 하 여 얻을 수 있습니다. 이 위해, photomicrography 또는 sem의 기술을 사용 하 여 샘플을 처리 하는 것이 좋습니다. 다음 단계는 두 프로세스에 참여.
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견본 수집
- 수집 하 고 70% 에탄올으로 직접 표본 저장. 가능 하면 다른 계급을 수집 합니다.
- 시간, 날짜, 견본 고 뿐만 아니라 (예를 들어를 구하고, 하는 동안 수집 된 나뭇가지, 등내부 중첩 집계, 짝짓기) 다른 관련 관측 장소
- 각 치료에 여러 복제를가지고 충분 한 표본을 수집 합니다.
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Photomicrography 및 Z 스태킹
- 건조 표본 공기와 곤충 핀에 그리고 수용 성 접착제를 사용 하 여 삼각형 포인트 카드에 그들을 마운트. 자세한 내용은 참조18을 참조 하십시오.
- Z-스테퍼 모터와 컬러 카메라 높은 확대 stereomicroscope를 사용 하 여 이미지.
- 디퓨저를 사용 하 여 표본에 대 한 균일 한 조명.
- 다른 초점 비행기에서 이미지를 캡처하고 무손실 파일 형식 (예: tiff) 및 초점 스택 이미지를 저장 상용 소프트웨어를 사용 하 여 그들.
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스캐닝 전자 현미경
참고: 모든 도구와 먼지와 다른 입자는 시료의 오염을 피하기 위해 에탄올과 표면 작업에 철저 하 게 청소.- 밤새 표본 에탄올에서 탈수 하 고 페 트리 접시에 건조 한 공기.
- 날카로운 면도칼 블레이드를 사용 하 여 머리는 신체의 나머지 부분에서 분리.
- 필요한 각도 (예:, 등 위로 향하도록)에서 머리를 탑재 전도성 탄소 테이프 또는 탭을 사용 하 여 알루미늄 명세서에. 얇은 스트립으로 탄소 테이프를 잘라 고 머리 캡슐을 지원 하기 위해.
- 2 분 20에 견본 표면에 골드를 적용할 스퍼터 coater를 사용 하 여 회전 무대 mA. 시간 및 전류는 악기에 따라 조정 될 필요가 있습니다.
- 신선한 탄소 테이프 또는 탭 새로운 알루미늄 스텁을 표본을 전송 합니다.
참고: 비 코팅된 탄소 검은색 제공 하지만 전송 표본 골드 코팅을 손상 시킬 수 있습니다. - 표본 방향은 여전히 해 현미경을 사용 하 여 올바른 인지 확인 하 고 한 쌍의 좋은 집게 또는 유사한 도구와 필요에 따라 조정. 주의 하지 스크래치 골드 코팅; 가능 한 한 작은 핸들입니다.
- Sem의 스텁 홀더, 명세서 및 표본 서로 상대적인 위치에의 노트를 만들기에 표본 로드.
참고: 일부 SEMs는 무대 카메라를 장착 합니다 하지만 많은 되지 않으며 그것은 높은 확대에 작은 견본을 찾을 하기가 어려울 수 있습니다. - 이미지는 견본. 낮은 가속 전압을 사용 하 여 충전 및 분야의 좋은 깊이 대 한 작은 조리개.
참고: 설정을 최고의 기술자와 상담에 최적화 되어 사용 되 고 특정 악기에서 전문.
2. 측정 면 숫자와 직경
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각 막 복제본
- 사용 하 여 개미 에탄올에 보존 또는이 목적 (1.1.1 단계)에 대 한 핀에 탑재.
- 플라스 티 신 또는 곤충 핀에 동물을 탑재 합니다. 머리는 비교적 큰, 나머지 신체 부위를 제거할 수 있습니다.
- 곤충 핀 또는 고급 이쑤시개를 사용 하 여 빠른 건조 무색 매니큐어의 작은 방울을 선택 하 고 신속 하 게 눈 위에 그것을 확산. 핀 눈을 긁어 하지 않습니다 확인 합니다. 매니큐어는 전체 눈과 주변 머리 캡슐의 일부를 커버 한다.
참고: 매니큐어 눈에 걸쳐 비교적 균일 한 두께의 수는 중요 하다. - 실 온에서 설정 하려면 매니큐어를 둡니다.
- 설정 완벽 하 게 좋은 곤충 핀을 사용 하 여 부드럽게 눈 주변 머리 캡슐에서 복제를 해제.
- 깨끗 한 집게의 좋은 쌍을 사용 하 여 복제, 머리 및 눈 하지 복제의 부분을 잡고.
- 눈의 방향에 대 한 인식을 확인: 앞쪽, 후부, 등, 그리고 복 부 지역.
- 유리 슬라이드에 복제본을 놓습니다. 면도날을 사용 하 여 신중 하 게 눈 주위 초과 소재를 제거 하 여 복제를 트림. 이동에서 복제본을 바늘 또는 집게의 쌍을 사용 합니다.
- 눈은 매우 볼록, '병합' 복제 수 있도록 가장자리 주위 3-4 좋은 부분 방사형 절을 면도칼 블레이드를 사용 합니다. 눈은 상대적으로 '플랫', 같은 절 개를 할 필요가 있다.
- 부드럽게 눈 복제, 복제본의 방향을 알려져 있다 보장에 커버 슬립을 놓습니다. 이 매니큐어에 막 인상이 없앨 수로 압력을 적용 되지 않습니다.
- 아주 작은 매니큐어를 사용 하 여 4 개의 모퉁이에 coverslip 인감. 매니큐어 유리 슬라이드와 커버 슬립 흐름, 그것은 복제본을 손상 것입니다.
- 복합 현미경에 슬라이드 이미지.
참고: 경우에 일부 면 초점에는, 다음이 나왔다 눈 복제 충분히 평평 하지는. 취소 하 고 단계 2.1.3에서에서 다시 시작 합니다. - ImageJ/피지 ommatidia 수와 각 ommatidia의 크기를 측정할 수 있다 자유롭게 사용할 수 있는 프로그램으로 이미지를 가져옵니다.
참고:이 방법은 준비 ocelli의 복제도를 사용할 수 있습니다. 단일 렌즈 기 때문에, 하나의 복제본에서 모든 ocelli를 함께 유지 하는 것이 좋습니다.
3. 눈의 구조 분석
참고: 눈의 해부학을 공부 하기에 대부분의 경우 두 보완 LM 및 가장 필요 합니다. 초기 처리 단계 LM와 가장 유사한 기술이 필요합니다. 차이 이후 단면 단계에서 발생합니다. 샘플 처리는 신중 하 게 처리 되어야 하며 책임감 폐기는 유해 화학 물질의 사용을 해야 합니다. 개인 보호 장비를 사용 하 여, 연기 후드, 항상 안전 데이터 sheets(SDS) 읽기 및 시작 하기 전에 위험 평가 수행 합니다.
- 해 부
- 냉각 또는 기체 CO2에 노출에 의해 표본을 anaesthetize.
- CO2 마 취 이며 매우 빠르게 (일반적으로 미만의 1 분) 주의이 시료의 죽음에 발생할 수 있으므로 노출 과도 피하기 위해 해야 합니다. 드라이 아이스 펠 릿 (단단한 CO2)를 사용 하 여 경우 피하십시오 직접 접촉을 표본과이 찬 화상을 일으킬 수 있습니다.
- 찬 마 취가 느립니다; 4 ° C는 충분 한, 그리고 추운 온도 권장 하지 않습니다. 종족에 대 한 적절 한 냉각 시간을 설정 합니다. 대형 또는 감기 저항 개미 불 개미 등이 필요할 수 있습니다 > 10 분 작은 종만 1-2 분 과도 한 냉각 해야 하는 동안 완전히 고정 되는 견본 죽 일 것 이다 (얼음에 직접 접촉 하지 않도록). 표본 선호 작은 거품 막히고, 플라스틱 용기에서 개최 하 고 그들은 관찰 될 수 있다는 아이스 박스 보다는 전기 냉장고 또는 냉장고에 배치 해야 합니다.
- 페 트리 접시에 견본을 놓고 해 현미경에서 조정 합니다. 신속 하 게 작업 하는 것은 마 취를 유지 하 고 일단 절 개 (이 수 초 이내 발생)는 조직의 변성을 피하기 위해 중요 하다.
- 집게와 안테나를 제거 합니다. 쏘는 곤충 작동, 그것은 처음을 찔린 되는 피하기 위해 gaster 절단 하는 것이 좋습니다.
- 날카로운 면도날;를 사용 하 여 입 부분을 제거 집게는 시료를 사용할 수 있습니다. 가능 (작은 표본)이 뇌에 잡아 당 겼 없이 눈 망막 밖으로 찢 어 수 있습니다 앞쪽 부분 눈 (큰 표본)의 또는으로 주변을 통해 잘라.
- 머리 캡슐을 오픈을 준비 합니다. 첫 번째 절 개; 가리키는 있도록 표본 각도 이 할 수 있다 중 해 현미경 표본 집게 또는 시각적 컨트롤에서 엄지 및 앞 손가락 사이 견본을 잡고 잡고.
- 머리 머리;의 복 부 부분을 제거를 통해 가로 절 개를 하 게 고정 및 침투를 향상 시키기 위해 큰 종에서 복 부 눈의 일부를 제거할 수 있습니다. 머리 해야 여전히 연결할 수 시체가 시점에서.
- 그냥 화합물 눈에 후부 코로나 절 개를 하 여 몸에서 머리 캡슐을 끊다.
- 얼음 차가운 정착 액에 화합물 눈으로 해 부 머리 캡슐을 배치: 2.5%도 및 2 %paraformaldehyde 인산 버퍼 (pH 7.2-7.5).
주의: 정착 액은 부식성과 독성; 적절 한 보호를 착용 하 고 증기 두건에서 작동.
참고: 그것은 신경 조직 변성을 체포를 신속 하 게 작동 하는 것이 중요입니다. 2 분 내에 완료 또는 더 적은 해 부 해야 (효율적인 해 부 연습이 필요할 수 있습니다).
참고: 눈 밝은 또는 어두운 조건에 적응 해야 하는 경우 다음 먼저 노출 몇 시간 동안 필요한 빛 조건에 동물. 각 조명 조건에서 해 실시 합니다. 해 어둠을 시뮬레이션 하기 위해 붉은 불빛 아래에서 실행 될 수 있습니다.
- 냉각 또는 기체 CO2에 노출에 의해 표본을 anaesthetize.
- 견본 프로세싱
- 유지는 표본은 정착 액에 모션 궤도 셰이 커에 실내 온도에 2 헤 큰 표본 긴 고정 시간을 요구할 수 있습니다.
- 정착 액을 제거 하 고 적절 하 게 처분. 표본 실 온 인산 버퍼 (3 시간, 5 분 마다)에 통에 씻는 다.
참고: 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 및 0.244 g KH2포4 1 L 증류수 H2O (pH 7.2)의 인산 염 버퍼 구성 되어 있습니다. - 인산 염 버퍼를 제거 하 고 2% 추가 OsO4. 1-2 h에 대 한 증기 두건에서 셰이 커에 견본 항아리를 놓습니다. 이것은 지방을 수정 하 고 또한 가장에 대 한 대비를 제공 후 정착 단계 이다.
참고: 오스뮴 고정 시간 받습니다 견본 크기; 거친 어림짐작으로 1 m m3당 고정의 1 시간을 계산 합니다. - 오스뮴 솔루션을 제거 그것을 적절 하 게 처분. 셰이 커에 표본 실 온 버퍼 (3 시간, 5 분 마다)에 씻어.
- 표본 에탄올 또는 아세톤;의 농도 증가에 배치 하 여 탈수 예, 50, 70, 80, 및 10 분에 대 한 95% 고 마침내 100% (2 시간, 15 분 각각). 솔루션 변경 사이 셰이 커에는 표본을 놓습니다.
참고: 필요한 경우 표본 수 수 70% 에탄올에 밤새 껏 저장. - 에탄올을 배수 하 고 100% 아세톤을 추가 합니다. 셰이 커 (아세톤에 디하이드레이션 하는 경우이 단계 건너뛰기)에 20 분 동안 둡니다. 신선한 아세톤으로 교체 하 고는 추가 20 분 동안 그것을 둡니다.
- 수 지 수 지를 아세톤의 다음과 같은 비율을 사용 하 여 조직에 침투: 2:1 (3 시간), 1:1 (하룻밤), 1:2 (4 h), 및 순수한 수 지 (하룻밤). 각 단계에서 표본 증기 두건 안쪽 통에 두고 마지막 두 단계를 제외한 모든 컨테이너를 캡.
참고: 수 지 표본은 각 단계에서 새로운 일회용 용기에 이동 해야 합니다 그래서 물기를 너무 점성 이다. - 블록 탑재 샘플을 준비 합니다. 블록 작은 사각형 블록 (1.5 x 0.5 x 0.3 c m)으로 아크릴 유리 절단 하 여 만든 사용자 지정 될 수 있습니다. 블록과 실리콘 몰드에 붓는 에폭시 수 지 (많은 상용 키트 사용할 수 있습니다)에 의해 만들 수 있습니다 다음 12-14 h 60 ° c.에 오븐에서 그것을 치료합니다
주의: Uncured (액체) 수 지 발암 이며 완전히 경화 될 때까지 오븐에 반환 되어야 합니다. - 금형에 블록을 수직으로 배치 합니다. 조심 스럽게 걸릴 액체 수 지에서 표본, 드레인, 과잉 수 지를 허용 하 고 블록 위에 견본 배치. 블록에는 견본을 바인딩할 추가 수 지의 작은 금액을 사용할 수 있습니다.
- 블록 레이블. 종이 라벨을 인쇄 하 고 블록에 포함 또는 블록 얼굴에 첨부.
- 60 ° c.에 12-14 h에 대 한 오븐에서 포함 된 블록 형을 유지
- 깨끗 한 봉투에 견본 블록을 저장 합니다. 이 년 몇 개월 동안이 방식으로 저장할 수 있습니다.
- 아세톤을 완전히 증발 수 있도록 증기 두건에서 사용된 컨테이너, 더러운 장갑, 그리고 다른 오염 된 장비를 두고 (최소 12 h).
- 일회용 장비를 폐기 또는 집게 등의 다른 항목에서 수 지를 근 근이 전에 오븐에 수 지를 치료.
- 단면
- 표본 방향은 단면 평면에 적합 하도록 해 현미경 아래 블록을 관찰 합니다.
- 방향이 적절 한 경우는 보석의 보고를 사용 하 여 표본을 잘라 다시 방향을 다시 표본 좌석 설정된 수 지와 신선한 수 지의 파편을 사용 하 여. 머리도 두 눈을 별도로 섹션을 두 반쪽으로 나눌 수 있습니다. 계속 하기 전에 다시 수 지 치료.
- 이동식 톰 척에 블록을 탑재 합니다. 물림 쇠를 제거 하 고 소유자에.
- 해 현미경 면도날을 사용 하 여 수 지 블록을 잘라.
주의: 하지 마십시오이 척 팔을 충격 하 고 베어링을 손상 수 있습니다 톰 팔에 탑재 되 면. - 톰 팔에 척을 탑재 하 고 각도 견본.
- 적절 한 각도에서 보유자에 칼을 탑재 (유리 칼에 대 한 0 ° 다이아몬드 나이프에 대 한 제조업체의 지침을 참조 하십시오).
참고: 유리 칼 유리 칼 메이커 싸게 만들 수 있습니다 하지만 그들은 그들의 가장자리; 잃고 주기적으로 교체 해야 합니다. 고품질 다이아몬드 칼 구입하실 수 있습니다 하지만 비싸다, 특별 한 주의가 필요 하며 초보자에 적합 하지 않습니다. - 칼으로 배 채우기 증류수 필터 (0.45 μ m 기 공 크기)를 장착 한 주사기를 사용 하 여.
- 수 위; 칼의 가장자리에 도달할 때까지 배를 채우기 보트의 다른 영역에는 초승달을 볼록 있을 수 있습니다.
- 드레인 보트는 초승달 모양 아주 약간 오목 하지만 여전히 칼의 가장자리에 도달할 때까지. 언제 든 지 하지만 항상 칼의 가장자리에서 물의 레벨을 조정할 수 있습니다.
- 신중 하 게 표본으로 칼을가지고 블록 칼을 맞춥니다. 이것은 최고의 천천히, 정기적으로 검사 및 측면에서 접 안 렌즈를 통해 칼의 근접 이루어집니다.
참고: 악기 다 특정 지침에 대 한 악기 핸드북을 확인 하십시오. - 섹션 두께 톰에 설정 합니다. 정확한 두께 선택 하면 표본 크기, 관심 영역 및 사용 되는 칼의 종류에 의존 될 것입니다.
- 면 소재의 많은 관심의 영역에 도달 하기 전에 멀리 잘라 해야 합니다 유리 칼을 사용 하 여 (예를 들어, 4 µ m), 더 높은 설정을 선택 합니다. 다이아몬드 칼 사용 되 고 또는 표본은 매우 작은 경우 1-2 µ m 더 적절 한 수 있습니다.
- 칼은 가까이 있지만 아직 접근의 마지막 부분을 수행 하는 표본으로 절단 "절단" (톰 휠 다 오)를 시작 합니다. 섹션 내에서 몇 회전; 나타나기 시작 한다 그렇지 않으면, 중지 하 고 매우 신중 하 게가지고 칼 좀 더 가까이.
- 때 두께 (1 µ m 세미 얇은 섹션에 대 한)를 수집 하는 섹션을 조정 관심 영역을 접근.
- 속눈썹 도구를 사용 하 여 모든 섹션을 수집 합니다.
참고: 속눈썹 도구 매니큐어와 얇은 막대기에 거치 된 속눈썹을 만들 수 있습니다. - 자료를 많이 제거 한다, 축적 하 고 칼을 제거 하 고 물으로 그것을 밖으로 홍 조 하 여 한꺼번에 제거할 섹션을 허용 합니다. 유리 칼을 사용 하는 경우이 새로운 칼 또는 칼의 신선한 섹션을 변경 하는 적절 한 시간 수 있습니다.
- 장소는 파스퇴르 피 펫 또는 이상적으로, 필터를 사용 하 여 슬라이드에 증류수의 작은 작은 물방울의 시리즈 주사기를 장착.
- 조심 스럽게 물 방울에 속눈썹에 수집된 섹션 부동.
- 단면 깊이 확인 하기에 적합 한 때까지이 같은 섹션을 수집 합니다.
참고: 비록 지루한 수 있습니다, 그것은 항상 자주 좋습니다. - 60 ° c.로 설정 하는 열판에 슬라이드를 배치 모든 물이 증발 하는 슬라이드에 섹션을 허용 합니다.
- 톨루이 섹션 10-60 s 블루 염색 (섹션 두께가 달라 집니다 시간 얼룩). (위와) 필터를 장착 한 주사기와 염료를 분배.
- 슬라이드의 한쪽 끝에 염료의 한 방울을 놓고 만지거나 긁는 섹션 없이 바늘의 측면을 사용 하 여 그것을 확산. 약 10-20 대에 대 한 열판에 슬라이드를 놓습니다.
- 세척 병에 증류수를 분사 하 여 슬라이드를 헹 구 고 건조 뜨거운 접시에 놓습니다.
- 복합 현미경 확인 하 고 그들을 이미지.
- 관심 영역에이 때까지 반복 합니다.
- 울트라 얇은 섹션에 대 한: 가장 섹션 수집을 40-60 nm 사이 절단 두께 설정.
- 컷에 대해 3-5 섹션 및 검사 두께 간섭 색 차트를 사용 하 여. 섹션 각도에서 볼 때 밝은 회색을 반영 해야 합니다.
참고: 클로 프롬 가스 모든 주름을 긴장을 섹션에 pipetted 수 있습니다. 이것은 숙련 된 사용자와 가장 관련이 고 초보자 걱정할 필요가 없습니다. 너무 많은 클로 프롬 섹션에 너무 가까이 발표 섹션을 손상 수 있습니다. - Formvar 측면으로 겸 함께 개최 Formvar 코팅, 구리, 슬롯 그리드를 선택 합니다. 하지 Formvar 코팅 펑크에 주의 해야 합니다.
- Edgeways 보트에 그리드와 섹션에서 다음 섹션에서 표면에 평행 하 게 위로 표를가지고. 필요한 경우에 속눈썹을 사용 하 여 그리드를 통해 섹션을 안내.
- 신중 하 게 소량을 팔 사이 갇혀 물 필터 종이 집게 끝 주위. 이렇게 하지 물 긴장 팔 사이 표를 올려 하거나 한쪽에 충실 그것을 만들 수 있습니다. 이 오염 또는 기계적 손상 될 수 있습니다.
- 신중 하 게 edgeways 필터 종이에 그리드를 서 서 그리드 자체에서 초과 물을 제거 합니다.
- 표 홀더에 그리드를 배치 합니다.
- 충분 한 섹션이 수집 될 때까지 반복 합니다.
- 세미 얇은 섹션 카메라를 갖춘 어떤 화합물 현미경으로 직접 몇 군데 될 수 있습니다. 침수 기름 섹션에 직접 배치할 수 있습니다. 변색을 방지 하기 위해 슬라이드 상자에 슬라이드를 저장 합니다.
- 얼룩 가장 대비를 위한 울트라 얇은 섹션
참고: 다음 단계에 따라 수행 되어야 합니다 밖으로 커버 아래 염료는 빛과 CO2 민감한. 또한, EM 염료 중 금속을 사용 하 여 대비를 생산 하 고 그러므로 유해 물질. 이 얼룩을 처리 하는 경우 적절 한 배려를가지고 한다.- 커버 알루미늄 호 일로 빛을 차단 하는 몇 가지 큰 접시. 이 대 한 다음 단계에서 작동 합니다. 부분적으로 작업 공간을 허용 하지만 다시 커버를 가능 한 한 빨리 배치를 발견.
- 왁 스의 조각을 잘라 하 고 신중 하 게 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 그것에 6% 포화 uranyl 아세테이트의 5 방울을 배치.
- 솔루션을 준비 하려면 2 세대 uranyl 아세테이트 100 mL 50% 메탄올, 증류수에 혼합 하 고 사용 하기 전에 솔루션을 필터링 합니다. 솔루션은 저장할 수 없습니다 하 고 여야 한다 신선한 각 시간19.
- 신중 하 게 가장 격자 데리 집게와 염료 방울 아래 섹션 측을 위에 균형. 25 분 동안 둡니다.
- 빠르게 증류수; 밖 그들을 담거 서 격자를 개별적으로 린스 증류수의 4 개의 다른 튜브를 통해 진행입니다.
- 영화의 신선한 조각에 리드 시트르산의 5 방울을 배치 합니다. 염료 방울 주위 몇 NaOH 펠 릿을 정렬 (이 리드 탄산의 강 수를 방지 하기 위해 대기 CO2 흡수).
- 리드 시트르산 솔루션으로 만들기 위해 끓는 증류수에 의해 이중 증 류 물 0.5 헤 허용 냉각 하 고 접착성 컨테이너에 추가할 0.3 g 리드 시트르산 이중 증 류 물 100 mL 물에 대 한 준비. 추가 1 mL 10 M NaOH, 단단히, 컨테이너를 봉인 하 고 녹아19까지 흔들.
- 4.3와 표지에 설명 된 대로 염료 방울에 격자를 놓습니다. 5 분 동안 얼룩입니다.
- 찍기 증류수와 격자 20 번에 의해 앞으로 증류수에 씻어. 증류수의 3 배를 통해 진행입니다.
- 격자 격자 상자에 건조를 허용와 필터 종이 초과 물을 담근 다.
- 가장 낮은 가속 전압에 이미지입니다.
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Representative Results
여기에 설명 된 방법을 사용 간단한의 상세한 연구와 개미의 겹 눈. Z-스택 photomicrography 기술을 사용 하 여 머리의 등 쪽 보기 이미징 비주얼 시스템 (그림 1)의 레이아웃에 대 한 개요를 얻을 수 있습니다. 이것은 좋은 준비 해 필요한 단면 각도 결정 하 고입니다. 이 기술은 머리 폭, 눈 길이, ocellar 렌즈 직경 등 측정에 유용 합니다. SEM 이미지 또한 상세한 개요 이미지를 제공 하지만 또한 높은 배율과 높은 해상도 이미지의 수집을 허용 한다. 눈에 대 한 관심의 특정 영역 상세 검사 수 및 렌즈 모양에 변화 될 수 있습니다 (그림 2)를 식별. SEM 이미지는 작은 눈과 ocelli 개미를 해결 하는 데 특히 유용 합니다. 각 막 복제본 모양, 크기, 그리고 각 눈 (그림 3)에 렌즈의 수에 정보를 제공합니다. LM 기술을 사용 하 여 몇 군데 반 얇은 섹션 허용 (그림 4 및 그림 5); 눈의 심한 내부 해부학의 조사 렌즈, 결정 콘의 직경, 결정 원뿔 관, 모양, 너비, 및 매핑 등 림 지역, 및 기본 및 보조 색소 세포의 위치는 rhabdom의 길이의 존재의 두께 포함 됩니다. 이 기술은 멋지게 열 대권 외의 특히, microvillar 방향 (그림 4)를 결정할 수 있는 가장을 사용 하 여 몇 군데 울트라 얇은 섹션에 의해 보충 될 수 있다 및 더 작은 (예: 너비의 구조는 측정 죄이 고 결정 콘 요로, 그림 5).
그림 1: 호주 설탕 개미, Camponotus consobrinus의 세 계급의 Z-스택 photomicrographs. 이 모든 세 계급에 비주얼 시스템의 레이아웃에 대 한 개요를 제공합니다. 참조20에서 적응. 눈금 막대 = 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2:이 기법의 이미징 기능을 보여주는 개미 비주얼 시스템의 전자 현미경 스캐닝. 위쪽 행에 표시 다른 눈 위치와 눈 크기에: (A) Myrmecia nigriceps; (B) Opisthopsis pictus; 그리고 (C) Amblyopone australis (아주 작은 눈, 흰색 화살표 참고). 이미지를 보여주는 높은 확대에 인수: Myrmecia nigriceps; 다른의 근로자에 (D) 3 개의 간단한 눈 크기 (E) Rhytidoponera 메탈 리카 (참고 다른 모양에서 ommatidia에서에서 화합물 눈 다른 지역 노란색에서 眼), (F) Amblyopone australis, (G) (H) Myrmecia pyriformis, Orectognathus clarki, 그리고 (나) Pheidole 종. 스케일 바 1 m m (A-C), 100 µ m (d 조-h 조), 10 µ m (I) =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 개미 눈과 ocelli의 각 막 복제본. (A) Myrmecia nigriceps의 작업자의 화합물 눈의 복제본입니다. 볼록 복제 절 개 하 여 결합 했다. 삽입 된 후부 (p), 앞쪽 (a), 고 등 (d), 복 (v) 부 축을 나타냅니다. (B) Myrmecia tarsata의의 ocelli의 복제본입니다. 스케일 바 = 0.5 m m (A), 10 µ m (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: rhabdom 횡단면의 LM 및 EM 이미지. 원형 또는 사각형 모양에 있는 rhabdoms를 구별 하는 것 Myrmecia nigriceps 블루 톨루이에 얼룩진 원심 rhabdoms의 (A) 단면을 사용할 수 있습니다. 전송 전자 현미경 쇼: (B) 원형 rhabdom에 microvilli 및 (C) microvilli 여러 방향을 지향 직사각형 모양된 rhabdom에 2 개의 반대 방향에서. (D) 사용 하 여 가벼운 현미경, 사각형 rhabdoms의 긴 축 Camponotus consobrinus;의 여왕에서 눈의 등 쪽 지역에는 팬 같은 단체를 표시에 매핑됩니다 삽입 된 후부 (p), 앞쪽 (a) 및 측면 (l), 중간 (m) 축 나타냅니다. 패널 D 참조20에서 적응입니다. 스케일 바 = 10 µ m (A), 1 µ m (B-C), 100 µ m (D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: LM 및 그들의 이미지를 Myrmecia tarsata의 빛에 적응 눈에 ommatidium. (A) 경도 섹션 각 막 (C), 결정 콘 (CC), 콘 지역 (ct), rhabdom (Rh) 및 기본 보기는 ommatidium의 색소 세포 (PPC). (B) 파선 사각형 상자 패널 A 원뿔 관의 좁은 폭 척도를 가장 아래 본 다른 단면도에서. 참조21에서 적응. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 일반적인 문제와 반 얇은 초박형 섹션과 (고정 및 침투, 절단 및 얼룩이 지기). (A) 가난한 고정 Pheidole 종; 반 얇은 섹션에서 부적절 한 침투 (화살표)으로 인해 조직의 (B) Iridomyrmex 칼 (반 얇은);에 단면 동안 리핑 (C) (왼쪽) 얼룩 편안 하 고 (오른쪽) 톨루이와 얼룩에 Myrmecia croslandi;에 블루 (D) 안료 (원) 및 조직 때문에 수 지와 조직 밀도 (너무 부드러운 수 지)의 가난한 일치 (화살표)를 구분 하는 동안 리핑 칼 보트;에서 섹션을 수집 하는 때 발생할 수 있습니다 섹션 (별표)의 폴딩 (E) 가난한 대비 부족 한 얼룩 (비교 삽입)으로 인해, CO2, 그리고 수직 칼에 노출에서 리드 시트르산 크리스탈 (흰색 화살표) 표시 (검은 화살표); (F) 구멍 Melophorus hirsutus 화합물 눈;에서 가난한 고정으로 인 한 조직 (흰색 화살표) (G) 수 지 너무 부드러운 때 단면 chitter 리드 섹션;에 수직 파문으로 본 너무 두께 (H) 섹션 (~ 100 nm) 귀착되 었 다 불 쌍 한 대비와 어두운 이미지, 박테리아와 미 립 자 물질에 오염 된 증류수 리드 전역에 흩어져 섹션 (흰색 화살표) Pheidole 종에서. 눈금 막대 = 25 µ m (A-B), 10 µ m (C H). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
위에서 설명한 방법 중 스위트 개미와 다른 곤충의 광학 시스템에 대 한 효과적인 조사에 대 한 수 있습니다. 이러한 기술을 샘플링 해상도, 광학 감도 및 공부 되 고 눈의 잠재적인 분극 감도 대 한 우리의 이해를 게 알립니다. 이 지식은 그들의 시각적인 기능에 생리 및 행동 조사에 대 한 중요 한 기초를 제공합니다. 또한, 여기서 설명 하는 방법 개미 영상 시스템에 초점을 맞춘, 하는 동안 이러한 기술은 사용할 수 있습니다 다른 곤충에 이기는 하지만 프로토콜 (예를 들면, 기간 고정 및 두꺼운 조직에 침투를 증가)에서 약간의 수정 . 약간 수정 된 프로토콜 매미22, 파리14, 꿀벌23, 말 벌24, 나비25,26나 방 등 곤충의 다양 한 영상 시스템의 특성에 사용 되었습니다. 대부분의 기술 설명 하는 있지만 여기 얼마 동안 사용 되었습니다, 그리고이 글은 개미의 광학 시스템의 맥락에서 그들을 함께 대체 기법을 비교 하 고 일반적인 함정을 설명 기회.
많은 이미징 기술이 현재 사용할 수 있는 응용 프로그램을 중복 하 고는 기술은 손을 작업에 대 한 적절 한 평가 하는 것이 어려울 수 있습니다. 여기에 관련 된 예제는 개요 이미징 기술을 선택 하 고 있다. 머리와 눈의 외부 형태와 머리에 광학 시스템의 상대 위치를 할 수 있는 sem의 또는 photomicrography를 사용 하 여. 그러나 이러한 기술의 장단점 검토27,, 몇 가지 특별 한 고려 때 눈 영상. 상대 위치와 눈의 크기, 이미징 때 두 기술을 자신의 장점과 단점이 있다. SEM 이미지 색상 정보 부족과 따라서 착 색 성이 어디 photomicrography은 좋습니다. 그러나, SEM 이미지 수 간 ommatidial 머리카락 등 자세히 면 경계 미세 구조를 설명 하 고 심지어 통해 표면 기능 photomicrography 기법 (예를 들어, ocellar 렌즈의 조각 표면에서 보이지 않는 화합물 눈 렌즈)입니다. SEM는 탐험 이미징 및 여전히이 범위에 걸쳐 매우 높은 해상도 유지 하면서 표본 크기의 큰 범위에 작동할 수 있기 때문에 관심의 기능을 식별에 올 때 다재 다능 한 기술입니다. 그러나, 해 부 현미경으로 널리 액세스할 수 하 고 전문의 높은 수준이 필요 합니다. 종종 한 필요한 정보를 얻는 단일 안돼가 있다. 이러한 시나리오에서 사용할 수 있는 가장 중요 한 리소스를 투자 하는 것은 고려에 유용 합니다.
각 막의 매니큐어 복제본 면 숫자와 면 직경의 가장 정확한 측정을 얻기에 가장 유용 하 게 입증 했습니다. 이것은 지금 다양 한 곤충11,22,,2829에 사용 되었습니다. SEM에서 획득 한 이미지의 품질은 훨씬 우수, 눈의 곡률 전체 면 배열의 정확한 측정을 방지 합니다. 면 크기와 면 분포를 매핑 또한 마이크로 단층5에서 인수 검사에서 실현 되어야 한다.
LM 및 가장 기술에 자주 어렵습니다 샘플 준비 되 고 영상의 마지막 단계까지 잘 처리 여부를 알아야. 합병증을 피하기 위해, 그것은 깨끗 한 작업 공간 및 도구, 정기적으로, 새로운 솔루션을 준비 하 고 철저 하 게 필터링 물 유지 같은 좋은 사례를 확립 하는 것이 중요. 맨 눈에 보이지 않는 오염 물질 EM 샘플을 망칠 수 있습니다. 이러한 이유로, 그것은 표면 및 악기 용 매, 에탄올 또는 아세톤, 비 린 트 생산 지우기 등을 사용 하 여 아래로 닦아 유용할 수 있습니다. 이것은 가장 관련성이 높은 단면, EM 섹션, 얼룩 때 sem의 샘플을 준비할 때입니다. 마찬가지로, 증류수 소스 수 있습니다 문제를 제시 하 고 그래서 그것은 항상 최선을 필터 확인 하 고, 정기적으로, 그들을 변경 하 고 항상 갓 필터링 된 물을 사용 하 여 오염 물질을 소개 (저장 하지 않습니다). 대부분의 fixatives, 얼룩, 및 포함 자료는 무기한으로 저장할 수 없습니다 하 고 준비의 날짜와 모든 솔루션을 분류 하는 것이 중요 하다. 그것은 체계적인 접근 및 프로토콜 중단 없이 수행 하기 위해 충분 한 시간을 따로 설정 해야 합니다.
다른 종에 기술을 적응 하는 것은 항상 시행 착오의 문제입니다. Formicidae 내에서 작동, 주요 차이점은 동물과 머리 내 근육 질량의 크기에 거짓말. 그들의 머리에 더 많은 근육으로 개미는 일반적으로 해결 하는 데 시간이 오래 걸릴 것입니다. 매우 큰 개미,이 신경 조직으로 최소 간섭 하면서 mandibular 근육, 기관, 및 악의 땀 샘 제거 하 좋습니다. 작은 개미와 그 몇 mandibular 근육, 그것이 단지는 mandibles를 제거 하 고 clypeal 영역을 노출 하 여 적절 한 고정을 얻을 수 있습니다. 이러한 경우에는, 고정을 개선 하기 위해 머리에 사소한 핀을 사용 하 여 작은 구멍을 만들 수 있습니다.
환경 준비에 영향을 또한 수 있다 중요 하다. 덥고 습 한 환경 (특히 열 대 지방에서 필드 역) 침투 단계에서 어려울 증명할 수 있습니다. 따뜻한 조건 부분적으로 점점 더 점성 되 고 사용 되지 않는 수 지 중간 결과 유해를 수 지 될 수 있습니다. 이 경우 최선의 선택 컨테이너 냉장고 또는 냉장고에서 소형, 단일 사용, 수 지를 저장 하는. Fixatives 냉각 수 따뜻한 조건에서 카운터 빠른 조직 붕괴에 유용 합니다. 그러나, 치료 시간 적절 한 침투를 보장 하기 위해 확장 해야 하는 것이 즉 냉각된 솔루션 더 느리게 분산 됩니다.
마음에 이러한 주의와 개미와 다른 곤충의 광학 시스템에 대 한 조사는 매우 보람 증명할 수 있다. 비주얼 시스템을 공부 하 고 시각 필드, interommatidial 각도, 광학 감도 및 샘플링 해상도의 크기를 예상할 수 있습니다. 눈의 해부학을 이해 우리의 이해 및 동물 행동의 해석에 알립니다. 예를 들어 해부학 여부는 일주 또는 야행성, 같은 동물의 시각 기능에 예측을 만들 수 있는 수는 이전 문서화 되지. 소수의 개미의 영상 시스템에 대 한 현재 정보를 감안할 때, 우리는 우리의 방법을 생물학과 myrmecologists 우리의 이해를 심화 조사 화합물 눈과 개미에 ocelli 영감을 것입니다 바랍니다.
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Disclosures
저자 아무 경쟁 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 곤충 해부학에 그들의 지식을 공유 하기 위한 감사 Jochen 제일, 폴 쿠퍼와 Birgit 발전 하 고 여러 기술을 위한 우리는 여기에 설명 된. 우리는 ANU에서 고급 현미경 및 현미경 검사 법 단위 MQU에 센터에서 재능과 지원 직원에 게 감사입니다. 이 작품은 호주 연구 협의회 (DE120100019, FT140100221, DP150101172)에서 보조금을 FRE 대학원 장학금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ant | Myrmecia midas | ||
| Stereomicroscope | Leica M205 FA | ||
| Sputter coater | Pro Sci Tech | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Petri dish | ProSciTech | ||
| Dissecting microscope | Leica MZ6 | ||
| Insect Pin | ProSciTech | ||
| Colourless nail polish | Non branded: from any cosmetic store | ||
| Glass slide | ProSciTech | ||
| Razor blade | ProSciTech | ||
| Foreceps | ProSciTech | ||
| Cover slip | ProSciTech | ||
| Compound microscope | Leica DM5000 B | ||
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | ||
| Paraformalydehyde | Sigma Aldrich | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | ||
| di-Sodium Hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | ||
| Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | ||
| Osmium tetroxide | Sigma Aldrich | ||
| Acetone | Sigma Aldrich | ||
| Araldite Epoxy Resin | Sigma Aldrich | ||
| Pasteur pipette | Sigma Aldrich | ||
| Toluidie Blue | Sigma Aldrich | ||
| Hotplate | Riechert HK120 |
References
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