Summary
Vi presenterer en protokoll for å analysere hypofysen kjertler og forberede hypofysen framskaffet fra utviklingsland mus.
Abstract
Hypofyse eller hypofysen er en viktig endokrine organ sekresjon hormoner avgjørende for homeostase. Det består av to kjertler separat embryonale opprinnelse og funksjoner-neurohypophysis og adenohypophysis. Utvikle musen hypofysen er liten og delikat med en langstrakt oval form. En koronale delen er foretrukket å vise både adenohypophysis og neurohypophysis i et enkelt stykke musen hypofysen.
Målet med denne protokollen er å oppnå riktig hypofysen framskaffet med velbevarte vev arkitekturer fra utviklingsland mus. I denne protokollen beskrive vi i detalj hvordan å dissekere og behandle hypofysen kjertler riktig fra utviklingsland mus. Først repareres mus av transcardial perfusjon av formaldehyd før disseksjon. Tre ulike dissecting teknikker brukes deretter for å få intakt hypofysen kjertler avhengig av alderen på mus. For fosterets mus alderen embryonale dager (E) 17,5-18,5 og nyfødte opp til 4 dager, er hele sella områdene inkludert sphenoid bein, kjertel og trigeminal nerve dissekert. For pups er alderen postnatal dager (P) 5-14, hypofysen kjertler knyttet trigeminal nerve dissekert som helhet. For mus over 3 uker gamle, er hypofysen kjertler omhyggelig dissekert gratis fra omkringliggende vev. Vi viser også hvordan å bygge hypofysen kjertler i en riktig retning ved hjelp av omkringliggende vev som landemerker for å oppnå tilfredsstillende framskaffet. Disse metodene er nyttige i å analysere histologiske og utviklingsmessige funksjoner i hypofysen kjertler utvikle mus.
Introduction
Hypofyse eller hypofysen er en viktig endokrine organ sekresjon hormoner nødvendig for homeostase1,2. Anatomisk, er hypofysen en '' to-i-ett '' struktur bestående av neurohypophysis og adenohypophysis. Disse delene har forskjellige embryonale opprinnelse og funksjonen veldig annerledes. Neurohypophysis er avledet fra den nevrale ektoderm og utskiller oksytosin og antidiuretic hormon. Adenohypophysis kommer fra Rathkes pose og er ansvarlig for utgivelsen av hormoner, inkludert veksthormon, prolaktin, skjoldbrusk - stimulerende hormone, follicle - stimulerende hormone, luteiniserende hormon, adrenocorticotropic hormon, og melanocyte - stimulerende hormone3,4,5.
Hypofysen hviler på dorsal overflaten av sphenoid benet (sella turcica) av musen skallen, og er festet til gulvet i hjernen av en skjør stilk. Det ligger lateralt ved trigeminal nerve og peke optikk chiasm6,7. Kjertel har en langstrakt oval form med sin lange akse vinkelrett med hodet. På dorsal overflaten, kan neurohypophysis og adenohypophysis lett bli grenser, med tidligere opptar dorsal mediale regionen og den sistnevnte utvide lateralt og ventrally. Under postnatal utvikling øker størrelsen på hypofysen raskt i den første måneden etter fødselen8,9. Likevel er musen hypofysen fortsatt svært små i størrelse med en gjennomsnittlig vekt på 1,9 mg og lang-aksen diameter på ~ 3 mm voksen10, lang-aksen diameter 2-2.5 mm på postnatal dag 21 (P21) og bare 1-1,5 mm på P0.
En koronale delen er foretrukket å vise både adenohypophysis og neurohypophysis i et enkelt stykke musen hypofysen. Noen tekniske ferdigheter kreves imidlertid å oppnå tilfredsstillende framskaffet hypofysen kjertler fra utviklingsland mus på grunn av den usedvanlig lille størrelsen og distinkte anatomi. I denne videoen artikkelen viser vi hvordan å dissekere musen hypofysen kjertler og forberede hypofysen framskaffet på ulike stadier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL/6 mus er avlet i bestemte patogen uten betingelser. Alle dyr eksperimentelle metoder er fulgt retningslinjene godkjent av Animal Care og etikk på andre militære medisinske universitet.
1. Disseksjon av Postnatal utvikling hypofysen
- utføre anestesi: plassere neonatal mus (P0 - P5) på knust is å indusere nedkjøling. For mus eldre enn 5 dager gammel, injisere 5% uretan (30 µL/g kroppsvekt) intraperitoneally for å indusere anestesi. Vurdere reaksjoner på halen/toe pinches. Fortsette etter at musen er ikke svarer til skadelige stimuli.
- Sikrer musa i supine posisjon (liggende på baksiden med ansikt oppover) ved forsiktig taping av forepaws og hindpaws til en arbeidsflate som kan være festet (dvs., Styrofoam) innenfor kjemisk avtrekksvifte.
- Utføre transcardial perfusjon.
- Kutt musen brystkasse med kirurgisk saks å avsløre hjertet (og andre thorax organer).
- Sikrer det bankende hjertet med sløv tang og en 26G (0,45 mm) nål inn venstre ventrikkel. Nålen er knyttet til en 10 mL sprøyte fylt med heparinized fosfat bufret saltvann (PBS, supplert med 5 mg/mL natrium nitrite og 10 U/mL heparin, pH 7.4, varmt 37 ° c før bruk). Umiddelbart klippe høyre atriet med fine saks og begynner å perfuse kroppen med varm PBS til væsken avslutter riktig atrium er klart.
Merk: Omtrentlig 5-10 mL PBS kreves for neonatal mus og 10-20 mL PBS for voksen mus. - Holde nålen på plass og endre til en annen sprøyte fylt med 4% paraformaldehyde (PFA, pH 7.4). Perfuse 10 mL og 20 mL bindemiddel for nyfødte og P21 mus, henholdsvis.
Forsiktig: PFA er giftig. Det kan føre til hud og luftveier irritasjon og øyeskade. Bruk hansker og arbeide under kjemiske hette.
- Halshugge PFA-fast musen og klippes hodeskallen bein med saks.
- Løft hindbrain fra bunnen av skallen med liten tang. Ved første tegn på sella turcica, stopp løfte men hold hindbrain, klippe hypofysen stilken og nerve fiber tilkobling til bunnen av hjernen med fine saks. Dette er avgjørende for å sikre at hypofysen ikke løftes bort med hjernen.
- Deretter holde løfte hjernen og fjerne hele hjernen for å avsløre hypofysen fullt. Kutte hele sella regionen inkludert hypofysen, lateral trigeminal nerver, og under sphenoid bein med saks (ca 3 x 5 mm 2).
- Sette dissekert vevet i en 35 mm rett eller en brønn av en 6-vel plate som inneholder 2 mL kaldt 4% PFA (pH 7.4). Fastsette vev ved 4 ° C i 40 min for P0 - P7 pituitaries, 1 h for P14 pituitaries, 1,5 t for P21 - P28 pituitaries og 3t for voksen pituitaries.
- Videre avstandtagen for hypofysen
- vask fast vev med 10 mL PBS, 5 endringer, 15 minutter hver. Neonatal hypofysen sammen med sine omkringliggende vev og under sphenoid bein kan behandles direkte til dehydrering. Imidlertid hypofysen kjertler fra mus eldre enn 5 dager bør bli atskilt videre under stereo mikroskop.
- Inn et 35 mm fat som inneholder 1 mL PBS fast vev. P5 - P14 pituitaries, fjerne connective membraner mellom nervene og bein med fine tang og saks og forsiktig isolere hypofysen sammen med lateral trigeminal nerver som helhet, men la sella turcica. Den isolerte kjertel og nerver er forbundet med connective membraner med en " H "-lignende utseende ( figur 1B).
- For P21 og voksen pituitaries, fjerne nerver og connective membraner rundt hypofysen og gratis kjertel fra omkringliggende vev. Vikle hypofysen vevet med linse rengjøring papir og legg den i en innebygging kassett.
Merk: Innpakning lille hypofysen med linsen rengjøring papir hjelper å forhindre potensielle tap av prøver og bevare vev integritet i fremgangsmåten parafin-innebygging. Det kan ikke være nødvendig å bryte hypofysen hvis den er behandlet i en liten flaske i cryo-innebygging prosedyren.
2. Parafinen innebygging og Sectioning
- tørke eksemplarer i embedding kassetter med 50%, 65%, 75% og 95% etanol løsninger i 15 min. Deretter tørke med 3 endringer av ren etanol, 3 min hver for P0 - P4 kjertler, 4 min hver for P5 - P14 kjertler og 5 min hver P21 og eldre kjertler. Klart med xylen, 3 endres, 3 min hver for P0 - P4 kjertler, 4 min hver for P5 - P14 kjertler og 5 min hver for P21 og eldre kjertler. Infiltrere med flytende parafin voks, 3 endringer, 7 min hver for P0 - P4 kjertler, og 8 min to ganger etterfulgt av 6 min en gang for P5 og eldre kjertler.
Merk: Optimale parametere for vev behandling empirisk justeres. For å oppnå høy kvalitet deler, bør utilstrekkelig eller over dehydrering unngås. Det samme gjelder for å fjerne vevet bruker xylen. - Retning ved innebygging av
- på en vev innebygging konsollen system, ta prøven ut kassetten og sett den i en base mold halv fylt med flytende parafin voks. Riktig retning av innebygging hypofysen er avgjørende for å oppnå framskaffet.
- For P21 og voksen hypofysen kjertler, plasser hypofysen med sin korte akse vinkelrett til bunnen av en base mold (inndelingsplanet). Bruk sphenoid bein og trigeminal nerver som anatomisk landemerker for P0 - P4 og P5 - P14 pituitaries, henholdsvis. Orientere prøver med deres trigeminal nerve eller tverrgående lamina av sphenoid bein vinkelrett til bunnen av en base mold.
- Hold vevet i ønsket posisjon med varmet fine tang til voksen blir halvfaste på en kjøleplate. Fylle opp formen med flytende parafin voks. La parafin blokken avkjøles før voksen er fullt befestet.
Merk: Hypofysen på embryonale dag 18,5 (E18.5) kan behandles på samme måte som neonatal hypofysen. Men pituitaries (Rathke ' s poser) yngre enn E16.5 bør være integrert med hele hodet og orientert med sagittal aksen (fra munn til bakhodet) vinkelrett til bunnen av en base mold.
- Chill parafin blokken på 20 ° C i 10-20 minutter og deretter skjære den i tynne skiver (4 µm tykkelse foretrekkes) med en mikrotom. For å få tilfredsstillende framskaffet, finjustere plasseringen av parafinblokkene under snitting. Montere vev skiver på polylysine-belagt glass lysbilder å hindre avdeling av sektorer i følgende.
Merk: Alternativt prøver kan bli dehydrert i 15%, 30% (W/V) sukrose løsninger (i PBS) på 4 ° C før de synke å bunnen, innebygd i cryo-innebygging sammensatte med samme retning, og raskt frosset på tørris. Skjær frossent blokkene i skiver av 8-10 µm ved hjelp av en kryostaten. Morfologi av cryo-deler, men er ofte underlegne parafinen delene.
3. H & E flekker og Immunofluorescence merking
- varm lysbilder på en varme blokk 55 ° C og dewax med xylen, 2 endringer, 4 min hver. Tørke prøvene med 95% etanol to ganger og 75% etanol to ganger, 3 minutter hver. Vask lysbildene med destillert vann i 5 min på en shaker.
- For H & E flekker, beis delene i Alun hematoxylin løsning for 6 min, skyll i running vann i 2 minutter, skille med 0,2% ammoniakk vann til 45 s, og nytt skyll i rennende vann i 2 minutter. Deretter tørke delene med 95% etanol for 1 min og beis med eosin for 2 min. sekvensielt tørke, Fjern, og montere.
- Immunofluorescence merking
- Behandle delene med metanol som inneholder 3% H 2 O 2 og 0,01% NaN 3 for 20 min ved romtemperatur å Deaktiver endogene peroxidases. Hente antigener ved koking inndelinger i henting bufferen (1 mM EDTA og 1 mM Tris-HCl, pH 7.4) i en trykkoker for 2 min. Incubate delene med blokkering buffer (5% geit serum i PBS) i 30 min på 37 ° C.
- Ruge seksjoner med kanin anti-veksthormon (GH) antistoff (1:2, 000) eller kanin anti-glial fibrillary Sure protein (GFAP) antistoff (1:2, 000) utvannet blokkerer buffer overnatter 4 ° C.
- Ruge seksjoner med sekundær antistoff (geit anti-kanin IgG-HRP, 1:300 i blokkering buffer) for 35 min på 37 ° C.
- Forsterke signaler med Biotinyl Tyramide (1:50 i Tris bufret saltvann med 0,3% H 2 O 2) i 15 min ved romtemperatur og visualisere med Streptavidin-Alexa594 eller 488 (1:300 i blokkering buffer, 30 min, 37 ° C).
- Counterstain kjerner med DAPI (50 mg/L i PBS) i 5 minutter ved romtemperatur.
Merk: Det kan ikke være nødvendig å forsterke signalet bruker Tyramide Signal forsterkning (TSA) system. Alternativt en sekundær fluorescens-konjugerte antistoffer kan brukes å visualisere signalet.
- Hent bilder fluorescens mikroskop utstyrt med DAPI, Texas rød og FITC filteret sett × 4/0,13 til × 40/0,75 mål og 5,0 megapikselkamera. Bruke 360, 488 og 594 nm laser bølgelengder for bildebehandling DAPI, Alexa 488 og Alexa 594-farget deler, henholdsvis. Optimalisere laser makt (0,8 brukte generelt) og eksponeringstid til ønsket nivå for hver kanal. Opprette en avbildning under kontroll av image oppkjøpet programvare og overlegg fluorescens bildene deretter bruke bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen gir en metode for å analysere hypofysen kjertler fra utviklingsland mus. Neonatal musen, hele sella områdene inneholder hypofysen, trigeminal nerver og undersiden sphenoid bein ble dissekert ut fra skull base. Hypofysen lille og delikat forblitt intakt i løpet av prosessen (figur 1A). Mus eldre enn 5 dager, hypofysen kjertler knyttet til laterale trigeminal nervene var så isolert. Brutto strukturen til hypofysen isolert fra P7 musen var godt bevart (figur 1B). P21 musen økt størrelsen på hypofysen bemerkelsesverdig sammenlignet med neonatal musen. Hypofysen var med hell isolere med usynlige skade under fjerning sine omkringliggende vev (figur 1 c).
Vil vise maksimal regionen både adenohypophysis og neurohypophysis i et enkelt stykke hypofysen, er en koronale delen foretrukket. Dissekert hypofysen kjertler var riktig orientert å oppnå tilfredsstillende framskaffet. H & E flekker viste godt bevart morfologi av både adenohypophysis og neurohypophysis i P0 og P7 P21 hypofysen kjertler (figur 2).
Bearbeidede skiver var også kompatibel med immunofluorescence merking. Som et eksempel, adenohypophysis og neurohypophysis viste bestemte immunolabeling av GH og GFAP, henholdsvis (Figur 3).
Figur 1: Disseksjon av postnatal utvikling hypofysen kjertler. Dorsal over dissekert hypofysen kjertler og omkringliggende vev fra P0 og P7 P21 mus. A, anterior; P, bakre; L, venstre; R, rett; SB, sphenoid benet; TN, trigeminal nerve; AH, adenohypophysis; NH, neurohypophysis. Skalere barer, 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Histology av musen hypofysen kjertler. Representant H & E flekker på hypofysen framskaffet fra P0 og P7 P21 mus. (A, Bog C) er lav forstørrelse visninger av koronale pituitaries. (D, Eog F) er utvidelsen av de innrammede områdene i (A, Bog C) henholdsvis. Skalere barer = 1 mm i (A, B og C); og 20 µm (D, E og F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representative immunofluorescent flekker på hypofysen kjertler. (A) GH (rød) var spesielt uttrykt i adenohypophysis fra P7 mus. (B) Magnified bildet av området innrammet i A. (C) GFAP (grønn) var spesielt uttrykt i neurohypophysis fra P21 mus. (D) Magnified bildet av området innrammet i C. kjerner var farget med DAPI (blå). Skala bar = 300 µm (A og C); og 30 µm (B og D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utvikle murine pituitaries, har det vært teknisk vanskelig å få riktig framskaffet sine små og skjøre og unike Anatomiske egenskaper6,8. Noen forskningsgrupper derfor valgte midt-sagittal deler analysere morfologi av embryonale og neonatal hypofysen11,12. Skjønt den midt-sagittal delen av hypofysen er likeledes dugelig av viser fremre, middels og bakre fliker i et enkelt stykke, den koronale delen er sterkt foretrukket som kan vise en maksimal visning av disse tre lobes. Spesielt for kvantifisering studier, som fastsettelse av volumet og hypofysen og telle antall apoptotisk og voksende celler, er framskaffet overlegen til midt-sagittal deler i sine. Her presenterer vi en metode nyttig å dissekere hypofysen kjertler og forberede hypofysen framskaffet fra utviklingsland mus.
For å unngå skade hypofysen kjertler under prosessen, er flere teknikker brukt i denne protokollen. Først repareres mus av transcardial perfusjon av formaldehyd før disseksjon. Denne bindemiddel ikke bare hjelper å bevare orgel arkitektur, men også å fjerne røde blodceller som ofte resulterer i automatisk fluorescens13. Andre er hele sella regionen dissekert for å unngå å berøre hypofysen med hard-kirurgisk verktøy. Det omringer tissues hjelp hypofysen utgangsstillingen og også tjene som landemerker for innebygging orientering. Disse metodene ansatt, kan mindre postnatal pituitaries fra yngre dyr dissekert mens redusere sannsynligheten for uønskede skade.
Disseksjon fremgangsmåten i denne protokollen gjelder også isolere murine hypofysen som ikke er pre fast av perfusjon. I så fall bør være plass til mer forsiktig å unngå uønskede skade og kjertel bør også være dissekert så raskt som mulig.
Siden utvikle murine pituitaries er svært små i størrelse, har det vært svært vanskelig å orientere dem riktig under innebygging. Denne protokollen bruker trigeminal nerve eller sphenoid bein som landemerker, gjør retning trinnene mye enklere. Riktig orientert pituitaries er avgjørende for å oppnå tilfredsstillende framskaffet.
I sammendraget gir vi en forbedret hypofysen disseksjon og innebygging protokollen, som er egnet for mus på ulike stadier. Anvendelsen av disse prosedyrene kan få tilfredsstillende framskaffet murine hypofysen kjertler brukes til analyse av rutine histology, immunohistochemistry, i situ hybridisering og utviklingsmessige forskning14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation i Kina (31201086, 31470759 og 31671219) og Shanghai Natural Science Foundation (12ZR1436900).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools/Equipment | |||
| Surgical scissors-straight | JinZhong | J21010 | can be purchased from other vendors |
| Fine scissors-strainght | JinZhong | WA1010 | can be purchased from other vendors |
| Blunt forceps | JinZhong | JD1020 | can be purchased from other vendors |
| Fine forceps | Dumont | RS-5015 | for isolation of the pituitary |
| 26G (0.45mm) needle | HongDa | for transcardial perfusion | |
| Syringe (1 mL) | BD | 300841 | can be purchased from other vendors |
| Syringe (10 mL) | BD | can be purchased from other vendors | |
| 35mm dish | Corning | 430165 | can be purchased from other vendors |
| Lens cleaning paper | ShuangQuan | can be purchased from other vendors | |
| Anatomical microscope | OLYMPUS | SZX-ILLB2-200 | can be purchased from other vendors |
| Embedding cassette | Thermo Fisher | 22-272423 | can be purchased from other vendors |
| Tissue embedding console system | KEDEE | KD-BM11 | can be purchased from other vendors |
| Microtome | Thermo Fisher | HM315R | can be purchased from other vendors |
| Superfrost-Plus slides | Thermo Fisher | 22-037-246 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Thermo Fisher | 12-543 | can be purchased from other vendors |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | BH2-RFCA | can be purchased from other vendors |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Urethane | BBI | EB0448 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | for PBS |
| KCl | Sigma | P9541 | for PBS |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | for PBS |
| K2HPO4 | Sigma | P2222 | for PBS |
| NaNO2 | Sigma | 237213 | |
| Heparin Sodium Injection | SPH | H31022051 | for perfusion saline |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Xylene | SCR | 10023418 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 8330 | |
| Hematoxylin | Sigma | H9627 | for H&E staining |
| Eosin Y | Sigma | E4009 | for H&E staining |
| rabbit anti growth hormone (GH) | National Hormone | for immunostaining | |
| antibody | Pituitary Program | ||
| Rabbit anti-mouse GFAP antibody | Sigma | G9269 | for immunostaining |
| Goat anti-rabbit IgG, HRP | Jackson | 111-035-003 | for immunostaining |
| TSA system | NEN Life Science Products | NEL700 | for immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | S32356 | for immunostaining |
| Anti-FITC Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11090 | for immunostaining |
References
- Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P.
- Haedo, M. R., et al. Regulation of pituitary function by cytokines. Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).
- Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks. Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).
- Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. Pituitary gland development: an update. Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).
- Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse. Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).
- Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa. Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).
- Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland. AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).
- Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period. Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).
- Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification. Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).
- Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis. J Vis Exp. (46), (2010).
- Budry, L., et al. Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).
- Wilson, D. B., Wyatt, D. P. Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice. Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).
- Cao, D., et al. ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification. Nat Commun. 7, 11121 (2016).
