Summary
Dit protocol bestudeert efficiënt zoogdieren celdeling in 3D collageen matrices door de integratie van de synchronisatie van de celdeling, toezicht op divisie gebeurtenissen in 3D-matrices met behulp van live-cel beeldvormende techniek, time-resolved confocal reflectie microscopie en kwantitatieve analyse van beeldvorming.
Abstract
De studie van hoe zoogdieren celdeling wordt geregeld in een 3D omgeving blijft grotendeels onontgonnen ondanks de fysiologische relevantie en therapeutische betekenis. Mogelijke redenen voor het ontbreken van exploratie zijn de experimentele beperkingen en technische uitdagingen die de studie van celdeling in 3D cultuur inefficiënt. Hier beschrijven we een imaging gebaseerde methode om te studeren efficiënt zoogdieren celdeling en cel-matrix interacties in 3D collageen matrices. Cellen die zijn gelabeld met de fluorescerende H2B worden gesynchroniseerd met behulp van de combinatie van thymidine blokkeren en nocodazole behandeling, gevolgd door een mechanische schok-off techniek. Gesynchroniseerde cellen worden vervolgens ingebed in een 3D collageen-matrix. Celdeling wordt gecontroleerd met behulp van live-cel microscopie. De vervorming van de collageenvezels tijdens en na de celdeling, die een indicator van cel-matrix interactie is, kan worden gecontroleerd en gekwantificeerd aan de hand van kwantitatieve confocal reflectie microscopie. De methode biedt een efficiënte en algemene aanpak om te bestuderen van zoogdieren celdeling en cel-matrix interacties in een fysiologisch relevante 3D-omgeving. Deze aanpak biedt nieuwe inzichten in de moleculaire basis van de ontwikkeling van normale weefsel en ziekten, maar voorziet ook in het ontwerp van nieuwe diagnostische en therapeutische benaderingen.
Introduction
Cel mitose is een kritieke gebeurtenis in het cellulaire leven, de verordening die cruciale rol bij weefsel- en orgaanbanken ontwikkeling speelt. Abnormale mitose is betrokken bij de natuurlijke genetische variaties, menselijke veroudering processen en de progressie van kanker1,2,3,4,5. Het toegenomen tempo van de verspreiding van tumorcellen in vergelijking met normale cellen is één van de kenmerken van de kanker, ondanks het feit dat cel gedragingen vrij heterogene tussen verschillende soorten tumoren en zelfs patiënten zijn. Ondanks veelbelovende preklinische resultaten, hebben sommige nieuw ontwikkelde antimitotische geneesmiddelen niet aangetoond effectief te zijn in klinische proeven6,7,8,9,10 ,11. De relevantie van experimentele en preklinische modellen moet worden beschouwd. Vele soorten normale zoogdier- en kanker cellen verdelen in driedimensionale (3D) matrices, zoals fibroblasten en cellen van de fibrosarcoma in de collageen-rijke bindweefsels 3D metastatische kankercellen in de 3D stromale extracellulaire matrix (ECM). Echter, de overgrote meerderheid van zoogdieren celdeling experimenten en testen zijn uitgevoerd op cellen gekweekt op tweedimensionale (2D) substraten. Een gemanipuleerde 3D matrix kan beter recapituleren de microstructuur, mechanische eigenschappen en biochemische signalen voor de 3D ECM van beide normale en pathologische weefsels12,13,14, 15,16,17.
De studie van hoe zoogdieren celdeling wordt geregeld in 3D omgevingen blijft grotendeels onontgonnen ondanks de zowel de fysiologische relevantie en het belang van de therapeutische18,19. Mogelijke redenen zijn de technische problemen en experimentele uitdagingen in verband met het bestuderen van de celdeling in 3D-matrices. Cel mitose vormt een kleine tijdelijke breuk in de celcyclus20. Eerdere werkzaamheden is gebleken dat het tempo van de proliferatie van veel cellen van zoogdieren, zoals menselijke borst adenocarcinoom MCF-7, menselijke Osteosarcoom U2OS en menselijke lever HepG2, is veel lager in 3D-matrices in vergelijking met hun tegenhangers op 2D substraten21, 22. Bovendien verplaatsen cellen ingebed in 3D-matrices in en uit focus tijdens live-cel imaging. Al deze factoren bijdragen tot de extreem lage efficiëntie van het vastleggen van de celdeling gebeurtenissen in 3D cultuur met behulp van beeldvormende technieken.
Interacties tussen de ECM en cellen spelen een belangrijke rol bij het reguleren van celdelingen. Hier beschrijven we een aanpak efficiënt studeren zoogdieren celdeling in 3D collageen matrices. De methode omvat de opname van de mitotische markeringen aan de cellen, synchronisatie van celdeling, evenals de controle van de divisie gebeurtenissen in 3D-matrices met behulp van de live-cel beeldvormende techniek, time-resolved confocal reflectie microscopie, en kwantitatieve analyse van beeldvorming. Fluorescentie-geëtiketteerden Histon eiwit H2B is het eerst geïntroduceerd in de cellen als een marker te differentiëren mitotische interfase cellen. De cellen worden vervolgens gesynchroniseerd met de combinatie van thymidine blokkeren en nocodazole behandeling, gevolgd door een mechanische schok-off techniek. Gesynchroniseerde cellen worden vervolgens rechtstreeks ingekapseld in 3D collageen matrices. Celdeling gebeurtenissen van meerdere cellen worden gecontroleerd efficiënt met lage-vergroting time-lapse live-cel imaging. De vervorming van collageenvezels, die een indicator van cel-matrix interactie is, wordt gecontroleerd met behulp van de reflectie van de confocal microscopie bij high-vergroting.
We hebben eerder deze techniek gebruikt om te controleren en te kwantificeren van cel-matrix interactie vóór, tijdens en na de mitose van twee metastatische kanker cellijnen, menselijke invasief ductaal carcinoma MDA-MB-231 en menselijke fibrosarcoma HT1080 cellen, in 3D collageen matrices19. De hier gepresenteerde methoden bieden een efficiënte en algemene aanpak om te studeren zowel zoogdieren celdeling in een 3D omgeving en cel-matrix interacties. De MDA-MB-231 cellenvariëteit wordt gebruikt als een voorbeeld in het papier. Dit protocol biedt nieuwe inzichten in de moleculaire basis van de ontwikkeling van normale weefsel en ziekten, en kan ook leiden tot het ontwerp van nieuwe diagnostische en therapeutische benaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol geboden volgt de richtsnoeren van The Homewood institutionele Review Board (HIRB).
1. stabiele uitdrukking van H2B-mCherry als een Marker voor cel mitose
-
Generatie van lentivirale deeltjes uit menselijke embryonale nier 293T (HEK 293T) cellen
- Plaat van de HEK 293T cellen op een 10 cm op de dichtheid van 5 x 106 cellen/schotel in cel kweekmedium (Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM) met hoge glucose (4.5 g/L), natrium pyruvaat 10% foetale boviene Serum (FBS) en 1% aan de cel cultuur schotel penicilline-streptomycine (Pen/Strep)). Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% kooldioxide (CO2). De gewenste confluentie van de cellen op de dag van transfectie is ongeveer 70-80%.
Opmerking: HEK 293T cellen worden hier gebruikt voor het produceren van virale deeltjes, die zal later worden gebruikt om te transduce van MDA-MB-231 cellen om te genereren een cellijn stabiel uiten H2B-mCherry. Zorg ervoor dat de cellen zijn gelijkmatig verdeeld in de plaat. Toevoeging van de cellen drop verstandig aan de plaat, en zachtjes bewegen de plaat heen en weer kan steun in gelijkmatige verdeling. Cellen kunnen ook worden overgeënt in platen of maatkolven van andere maten, die in de collectie van verschillende volumes van virale deeltjes resulteren zal. - Transfect de HEK 293T cellen met behulp van een transfectiereagens met drie plasmiden (lentivirale vector, CMV ΔR 8.91 en pMDG-VSVG). Het plasmide H2B-mCherry-codering wordt gekloond in een lentivirale vector met fosfoglyceraat kinase promotor (PGK). CMV ΔR 8.91 bevat drie vereist HIV genen, gag, polen rev. pMDG-VSVG bevat het VSV-G envelop gen.
Opmerking: Er zijn meerdere transfectie agenten om uit te kiezen.- Laat de flacon van transfectiereagens tot kamertemperatuur (RT) vóór gebruik. Omkeren of vortex de flacon kort.
- Mix 16 µg van DNA, die uit 6 µg H2B-mCherry plasmide, 8 µg CMV ΔR 8.91 en 2 µg pMDG-VSVG, in 1 mL verminderde serum media bestaat. Incubeer bij RT gedurende 5 min.
Nota: Het bedrag en de verhouding tussen de drie vectoren is gevarieerd en geoptimaliseerd voor verschillende lentivirale overdracht vectoren. - Voeg 48 µL (1:3 verhouding van DNA gebruiken: transfectiereagens) van het transfectiereagens in de bovenstaande DNA-oplossing, en vervolgens uit te broeden op RT gedurende ten minste 15 minuten.
Opmerking: De verhouding van het DNA vs. transfectiereagens is gevarieerd en geoptimaliseerd voor verschillende lentivirale overdracht vectoren. Zorg ervoor dat de transfectiereagens geen contact op met de kant van de centrifugebuis 1,5 mL. - De DNA-lipide complexe oplossing gemaakt in stap 1.1.2.3 drop-wise aan de cellen toevoegen. Zachtjes swirl de plaat om ervoor te zorgen de gelijkmatige verdeling van het complex in de plaat.
- Ongeveer 6 uur na de transfectie, gecombineerd het medium en toevoegen van verse cel kweekmedium (DMEM met hoge glucose (4.5 g/L), natrium pyruvaat 10% FBS en 1% Pen/Strep).
- Oogst de supernatant 24, 48 en 72 uur na transfectie. Vervangen van het medium na elke oogst (DMEM, 4.5 g/L glucose, natrium pyruvaat, met 10% FBS, en 1% Pen/Strep).
- De lentivirale deeltjes wordt gefiltreerd door een 0,45 µm filter te verwijderen van de cellulaire puin. Als alternatief, spin down het supernatant te scheiden van het puin van de cel. Het supernatant kan worden gebruikt voor signaaltransductie meteen, of kan worden opgeslagen bij-80 ° C.
- Plaat van de HEK 293T cellen op een 10 cm op de dichtheid van 5 x 106 cellen/schotel in cel kweekmedium (Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM) met hoge glucose (4.5 g/L), natrium pyruvaat 10% foetale boviene Serum (FBS) en 1% aan de cel cultuur schotel penicilline-streptomycine (Pen/Strep)). Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% kooldioxide (CO2). De gewenste confluentie van de cellen op de dag van transfectie is ongeveer 70-80%.
-
Generatie van cel lijnen stabiel waarin H2B-mCherry
Opmerking: Dit protocol wordt beschreven in detail voor MDA-MB-231 cellen. Voor gebruik in de experiment, menselijke borst carcinoom cellen MDA-MB-231 (Physical Sciences oncologie Center, NIH) worden gekweekt in DMEM met hoge glucose (4.5 g/L), natrium pyruvaat 10% FBS en 1% Pen/Strep.- Plaat de MDA-MB-231-cellen in de dichtheid van 1 x 105 cellen in een 35 mm cultuur schotel.
Opmerking: De dichtheid van beplating voor verschillende cellijnen moet worden geoptimaliseerd, en daarom kan afwijken van de optimale dichtheid voor de MDA-MB-231-cellen. - 24 h na plating de cellen, voeg 1 mL van virus en 1 mL verse voedingsbodem (DMEM, hoge glucose (4.5 g/L), natrium pyruvaat, 10% FBS, en 1% Pen/Strep).
- Incubeer de cellen gedurende een periode van 6 h tot 's nachts.
Opmerking: Zowel het volume van het virus en de incubatietijd moet worden geoptimaliseerd voor verschillende cellijnen. Bijvoorbeeld, als de cellen niet gezonde enkele uren na de toevoeging van het virus kijken, gebruik 1 mL virus en 2 mL verse voedingsbodem (DMEM, hoge glucose (4.5 g/L), natrium pyruvaat, 10% FBS, en 1% Pen/Strep) voor stap 1.2.2. De lengte van de incubatietijd in stap 1.2.3 kan ook worden verminderd. - Het medium gecombineerd en voeg toe 10 mL verse voedingsbodem (DMEM, hoge glucose (4.5 g/L), natrium pyruvaat, 10% FBS en 1% Pen/Strep). Incubeer gedurende tussen 24 tot 72 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Controleer de expressie van H2B-mCherry in cellen met behulp van een microscoop met epifluorescence.
Opmerking: Als de signaaltransductie-efficiëntie laag in de cellen is, de hoeveelheid virus in stap 2.2 en de incubatietijd in stap 2.3 kan verhoogd.
- Plaat de MDA-MB-231-cellen in de dichtheid van 1 x 105 cellen in een 35 mm cultuur schotel.
2. de synchronisatie van de cellen stabiel uiten H2B-mCherry
- Plaat de cellen bij 50 tot 60% confluency, d.w.z. plaat 2 x 104 MDA-MB-231 cellen in elk putje van de plaat van een 24-well.
- Incubeer de cultuur bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Vervang het groeimedium met 0,5 mL van medium (DMEM, hoge glucose (4.5 g/L), natrium pyruvaat, 10% FBS, en 1% Pen/Strep) met 2 mM thymidine en laat in de incubator gedurende 24 uur.
Opmerking: Cellen blootgesteld aan thymidine zijn gearresteerd in de fase van de celgroei (G1) / DNA synthese (S) overgang en in de gehele S-fase als gevolg van de remming van de DNA synthese. De lengte van de incubatietijd moet worden gevarieerd en geoptimaliseerd voor verschillende cellijnen. - Ontgrendel de cellen van thymidine blootstelling door wassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) drie keer. Vervolgens, incubeer cellen in normale cel kweekmedium (DMEM, hoge glucose (4.5 g/L), natrium pyruvaat, 10% FBS en 1% Pen/Strep) voor 5 h.
Opmerking: De versie van de cellen van de blootstelling van thymidine maakt het mogelijk de cellen naar de celgroei (G2) / mitotische (M) fase voor cellen eerder gearresteerd bij de G1/S-fase, en naar de G1-fase voor cellen eerder gearresteerd op de S-fase. De lengte van de release tijd moet worden gevarieerd en geoptimaliseerd voor verschillende cellijnen. - Het blokkeren van de cellen met 250 ng/mL nocodazole voor 12u.
Opmerking: Alle cellen blootgesteld aan nocodazole worden gearresteerd op de G2/M-fase. Nocodazole is cytotoxische. Langdurige blootstelling aan nocodazole kan leiden tot apoptosis. Pas de periode of de concentratie van blootstelling voor verschillende cellijnen als cel sterfgevallen in acht worden genomen. Cellen die met succes zijn gesynchroniseerd zal vertonen een sferische morfologie. - Schud de cellen voor 45 s tot 1 min met behulp van een roteerschudapparaat bij 150 tot 200 omwentelingen per minuut.
Opmerking: Mitotische cellen, die weinig hechting aan de ondergrond hebben, zal worden geschud uit tijdens het proces. - Verwijder het medium om uit te pakken van cellen, waarbij het medium in een centrifugebuis, eveneens en voeg toe 0,5 mL verse voedingsbodem (DMEM, hoge glucose (4.5 g/L), natrium pyruvaat, 10% FBS, en 1% Pen/Strep) aan elk putje van de plaat.
- Herhaal stap 2.6 en 2.7 driemaal.
- Centrifugeer het verzamelde medium met de mitotische cellen bij 800 x g gedurende 3 minuten.
Opmerking: Deze stap wordt gebruikt om de nocodazole van het medium van de cel.
3. opneming van de gesynchroniseerde cellen in het collageen ik Matrices
Opmerking: Type I collageen is de meest voorkomende eiwitten in het menselijk lichaam en in de ECM van bindweefsel, en dus wordt veel gebruikt om te onderzoeken hoe eukaryotische cel functies gemoduleerd worden door een 3D-omgeving17,23,24 . Collageen is oplosbaar in azijnzuur. Na neutraliseren en opwarming van de aarde de collageen-oplossing voor 20-37 ° C, polymeriseren collageen monomeren in een gevlochten van collageen fibrillen.
- Bereid de 10 x DMEM-oplossing door het oplossen van een pakje DMEM poeder, 3,7 g natriumbicarbonaat (NaHCO3) en 1 g 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) in 50 mL gedestilleerd water. Filtreer de oplossing, en vervolgens 1 M natriumhydroxide (NaOH) worden bereid door oplossing van 2 g NaOH pellets in 50 mL gedestilleerd water. Filter en aliquot de oplossing in 1,5 mL centrifuge buizen.
Opmerking: Normale DMEM oplossing moet niet worden gebruikt in deze stap. De toevoeging van aanzienlijke omvang van de collageen-oplossing verdunt het medium. De geconcentreerde oplossing van de DMEM is daarom bereid om ervoor te zorgen dat de uiteindelijke concentratie van DMEM in de collageen-matrix hetzelfde als de normale DMEM. - Blijven werken met de cellen die zijn verzameld vanaf stap 2.9. Gecombineerd het medium, en resuspendeer cellen in ongeveer 0,25 - 0,5 mL verse cel kweekmedium (DMEM, hoge glucose (4.5 g/L), natrium pyruvaat, 10% FBS, en 1% Pen/Strep).
Opmerking: Om te bereiken een specifieke celdichtheid in de collageen-matrix, de oorspronkelijke dichtheid van de cellen in de opschorting mag niet te laag. Het volume van het medium gewend resuspendeer de cellen zal dus afhangen van het totale aantal beschikbare cellen. - Plaats 10 µL van het opnieuw gesuspendeerde cell oplossing uit stap 3.2 op een hemocytometer en de graaf de dichtheid van de cellen in de oplossing.
-
De volumes die nodig zijn voor alle onderdelen om de 3D collageen matrix te bepalen. 500 µL van 2 µg/µL collageen gel wordt gebruikt als een voorbeeld.
- Bereken het volume van de oplossing van de cel die nodig zijn voor het verkrijgen van 40.000 cellen/mL (of 20.000 cellen voor de 500 µL van collageen gel). Dit nummer in µL is X. 50 µL van 10 x DMEM nodig zullen zijn. 50 µL van FBS nodig zullen zijn.
- Bereken de hoeveelheid collageen die ik voorraad nodig. De concentratie van collageen is ik rond 4 µg/µL. Het bedrag van collageen vereist in µL is Y.
- Bereken het volume van natriumhydroxide-oplossing wilt neutraliseren het azijnzuur in de collageen-oplossing: Y µL collageen * 0.023 * 1000 = Z µL NaOH nodig.
- Vastgesteld wat de omvang van de vuller oplossing: (500 µL totale gel - X µL cellen - 50 µL 10 X DMEM - 50 µL van FBS - Y µL collageen - Z µL NaOH) = R µL
Opmerking: De vuller oplossing wordt gedistilleerd water. Als de berekende volume worden gecontroleerd van de vuller oplossing een negatief getal is, wordt de oorspronkelijke celdichtheid in de celsuspensie is te laag. De cellen moeten worden gesponnen beneden opnieuw en opnieuw gesuspendeerd in een kleiner volume medium (DMEM, hoge glucose (4.5 g/L), natrium pyruvaat, 10% FBS, en 1% Pen/Strep).
- De onderdelen in de volgende volgorde toevoegen aan een schoon 1,5 mL centrifugebuis: cellen in medium, 10 x DMEM, FBS, gedeïoniseerd water (DI), collageen, NaOH. Plaats alle componenten op ijs te vertragen de gelering van de collageen-oplossing. Gebruik juiste pipetting technieken de vorming van luchtbellen te voorkomen.
- Meng de oplossing na het toevoegen van de NaOH, zorgvuldig met een pipet 1 mL.
Opmerking: Gelering van de collageen zal rechts starten onmiddellijk na toevoeging van NaOH. Mengen moet worden zorgvuldig en snel. - Zodra de oplossing is goed vermengd zijn, voeg 500 µL van de oplossing aan elk putje van de plaat 24-well. Plaats de 24-well plaat in de 37 ° C incubator. Plaats verse cel kweekmedium in het waterbad 37 ° C.
Opmerking: Plastic bodem platen worden gebruikt voor lage-vergroting live-cel microcopy waarin de afstand van de lens is boven 1 mm. glazen bodem platen worden gebruikt voor high-vergroting live-cel microscopie als gevolg van de korte afstand van de hoge vergroting lens. - Voeg 500 µL voorverwarmde medium (DMEM, hoge glucose (4.5 g/L), natrium pyruvaat, 10% FBS en 1% Pen/Strep) naar de top van de gel 30 min na het voltooien van stap 3.7.
4. levende cel beeldvorming van de cellen verdelen in de 3D collageen Matrices (lage vergroting)
Opmerking: Afbeeldingen van cellen worden verzameld op 2 min tijdstippen met behulp van een gratis gekoppelde apparaat (CCD) camera gemonteerd op een fasecontrastmicroscoop die is uitgerust met een 10 X doelstelling en bestuurd door beeldbewerkingssoftware.
- Schakel de levende cel-eenheid die zich bovenop het objectief. Wacht tot de temperatuur bij 37 ° C stabiliseert, de concentratie van CO2 op 5 is % en de luchtvochtigheid 75 bedraagt %.
- Zet de plaat 24-well voor gels in de levende cel-eenheid van de Microscoop. Vinden van de onderkant van de plaat en verplaats vervolgens de objectief tot de Microscoop richt zich op ongeveer 500 µm vanaf de onderkant van de plaat.
Opmerking: Cellen in de collageen-matrix die te dicht bij de bodem van de plaat niet volledig zijn ingesloten in de 3D-matrix. Imaging cellen die 500 µm weg van de onderkant van de plaat zal ervoor zorgen dat de cellen worden niet beïnvloed door randeffecten16,17,25. - Naar het podium om te vinden van de cellen, en selecteren van meerdere posities voor imaging.
- Zet de time-lapse experiment 2-min tussenpozen.
Opmerking: Het maximum aantal posities die kunnen worden genomen tijdens de 2 min interval wordt beperkt door de bewegende snelheid van de gemotoriseerde fase, en de lengte van de belichtingstijd voor het vastleggen van beelden.
5. collageen netwerk vervorming tijdens de celdeling (hoge vergroting microscopie)
- Schakel de levende cel-eenheid die zich bovenop het objectief. Wacht tot de temperatuur bij 37 ° C stabiliseert, de concentratie van CO2 op 5 is % en de luchtvochtigheid 75 bedraagt %.
- Om te visualiseren collageenvezels in onbevlekt 3D collageen matrices, configureert u een confocal microscoop om vast te leggen alleen gereflecteerde licht (488-nm) van de laser van de 488-nm gebruikt voor het verlichten van het monster. De laser maakt gebruik van een 60 X water-onderdompeling doelstelling, NB = 1.2, WD = 200 µm, en wordt beheerd door de beeldbewerkingssoftware.
- Het monster (cellen in collageen matrices) gestoken in de levende cel-eenheid. Vinden van de onderkant van de plaat en verplaats vervolgens de objectief tot de Microscoop richt zich op ongeveer 100 µm vanaf de onderkant van de plaat. Imaging cellen die 100 µm weg van de onderkant van de plaat zal ervoor zorgen dat de cellen worden niet beïnvloed door de randeffecten.
Opmerking: Hier een water-onderdompeling doelstelling wordt gebruikt in plaats van een olie-immersie objectief omdat de afstand van de werken van het olie-immersie objectief slechts ongeveer 100 µm is. Het gebruik van het olie-immersie objectief vormt een probleem, zoals de dikte van het glas aan de onderzijde van de plaat normaal gesproken ongeveer 100 µm is. - Naar het podium om te vinden van de cellen, en selecteren van meerdere posities voor imaging.
Opmerking: Confocale microscopie optisch de afdelingen van het monster en alleen signalen van het brandvlak vastlegt. Levende cellen mogelijk bewegen in en uit focus tijdens het time-lapse experiment. Opdat het vastleggen van beelden van de cel gedurende lange perioden van tijd, wordt Z-stack gebruikt voor het verzamelen van beelden van opeenvolgende segmenten 5 µm tussenpozen. Een totaal van 5 segmenten verspreid over 25 µm zijn beeld. - Zet de time-lapse experiment 5 min tussenpozen.
Opmerking: 5 minuten wordt gebruikt als het interval in plaats van 2 min gebruikt in sectie 4, omdat meerdere scannen wijzen, met inbegrip van fluorescentie scannen voor H2B-mCherry, reflectie scannen voor collageen en Z-stack scannen, worden toegepast op elke positie. Het gebruik van meerdere modi van scannen vermindert de snelheid van het scannen van een positie in vergelijking met de lage vergroting beeldvorming. - Kwantificeren van de vervorming van de collageen-matrix in de nabijheid van een cel als gevolg van de door die cel met behulp van deeltje imaging velocimetry (PIV) met sub-pixel resolutie20uitgeoefende krachten. Deze analyses uitvoeren met 2D-afbeeldingen mogelijk maakt voor de duidelijke visualisatie van zowel de signalen van de H2B-mCherry en de collageenvezels. Het anisotrope low-pass filter om het signaal van de collageen netwerk20van toepassing.
- Om te meten de lokale verplaatsing van een sub afbeelding regio van belang vinden op (x,y) van frame naar frame k+ 1, uittreksel van een regionale venster van 15 × 15 k pixels gecentreerd op (x,y) bij frame k. Vervolgens het identificeren van de beste locaties (x,y) overeenkomende * via de vestigingen die zijn voorzien van een maximale genormaliseerde cross-correlatie coëfficiënt in de afbeelding verkregen bij frame k+ 1. De vervorming vector wordt berekend als (x,y) *-(x,y).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van dit artikel is te presenteren van een imaging-gebaseerde methode om zoogdieren celdeling processen in 3D-matrices te bestuderen en te kwantificeren van de interacties tussen de cel en de 3D extracellulaire matrix tijdens en na de celdeling. Ter vergemakkelijking van de beeldvorming van cel mitose, verwerkt we in MDA-MB-231 cellen met behulp van lentivirale transductie H2B-mCherry. H2B geconjugeerd met fluorescerende eiwitten wordt gebruikt als een mitotische marker te onderscheiden van de mitotische cellen in de interfase cellen, en te bepalen van verschillende stadia tijdens cel mitose19,20,26. Met behulp van deze methode, konden we controleren de hele divisie proces van MDA-MB-231 cellen stabiel uiten H2B-mCherry in 3D collageen matrices (figuur 1A). Mitotische fasen begon met de ontbinding van het kernmembraan (profase; frame 1, figuur 1A); de nieuwe organisatie van de chromosomen (prometaphase: frame 2); de uitlijning van de chromosomen in het midden van de cel lichaam (metafase; frame 3); de scheiding van de chromosomen (anafase; frame 4); de reorganisatie van de chromosomen en kernmembraan en de scheiding van de organen van de twee dochtercellen (telofase/cytokinese, frame 5).
Het tarief van de proliferatie van cellen in een 3D matrix is meestal veel lager dan hun tegenhangers op een 2D drager vervagen, waardoor de monitoring van celdeling in 3D minder efficiënt19. Het vergroten van de efficiëntie van het bestuderen van 3D celdeling, werkzaam we een methode voor het combineren van thymidine, nocodazole en een shake-off techniek te synchroniseren en selecteer MDA-MB-231-cellen die zich in de mitotische fase. Gesynchroniseerde cellen werden vervolgens ingesloten in collageen matrices. De divisie proces van meerdere cellen werd gevolgd in het gebruik van real-time live-cel beeldvorming op 10 X vergroting. Ongeveer 70% van de cellen verdeeld binnen de eerste 2 uur na de vorming van collageen matrix (Figuur 2), waardoor voor de efficiënte bewaking van mitose in 3D (Figuur 2).
Als u wilt controleren van de interactie tussen cellen en hun omliggende collageen matrices, gecombineerd we reflectie van de confocal microscopie aan afbeelding collageenvezels en fluorescentie microscopie om het imago van de cellen. Een 60 X lens zorgt voor de inname van hoge kwaliteit beelden van collageenvezels. Imaging met behulp van een high-vergroting lens, die minder cellen in elke gezichtsveld vangt, is veel lager-doorvoer in vergelijking met het gebruik van lage-vergroting op 10 X en 20 X. Succesvolle synchronisatie van de cellen verbetert sterk de efficiëntie en de productie van dergelijke een experiment, aangezien de meeste van de gesynchroniseerde cellen binnen de eerste 2 uur na de vorming van de collageen-matrix verdelen. De vervorming van de matrix tijdens en na de celdeling is gevisualiseerde (vertegenwoordiger momentopnamen worden weergegeven in figuur 1B) en gekwantificeerd aan de hand van een aangepaste PIV-software. We gekwantificeerd en matrix vervorming tijdens de interfase en mitotische fase voor cellen gesynchroniseerd in de mitotische fase vergeleken. We hebben vastgesteld dat de vervorming van de matrix zeer weinig veranderd tijdens de mitotische fase (figuur 3A), en is minder dan de vervorming waargenomen in post mitotische fasen (figuur 3B). Dit resultaat blijkt dat cellen van zoogdieren hebben minimale gehechtheid en interacties met de omliggende matrix, terwijl zij in de mitotische fase.
Figuur 1: vertegenwoordiger microfoto verkregen uit een high-vergroting live-cel imaging video van een MDA-MB-231 cel ingesloten in een matrix van collageen die stabiel H2B-mCherry uitdrukt. (A) verschillende fasen van de mitotische progressie van de MDA-MB-231-cel worden gedefinieerd door H2B-mCherry zoals aangeduid in het rood. (B) de collageenvezels (wit) tijdens de mitotische worden gevisualiseerd door tijd-afhankelijke confocal reflectie microscopie. Schaal bar = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: verdeling van de gesynchroniseerde cellen in 3D collageen matrices. Cellen werden gesynchroniseerd met G2/M fase en ingesloten in een matrix van collageen. Ongeveer 70% van gesynchroniseerde cellen verdelen binnen de eerste 2 h, overwegende dat de controle cellen zonder synchronisatie kloof willekeurig. Foutbalk = SEM (standaardfout van het gemiddelde). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: kwantificering van de vervorming van de matrix voor MDA-MB-231 cellen tijdens de interfase en mitose. (A) de wijziging in de omvang van de matrix vervorming voor matrix-embedded MDA-MB-231 cellen. De groene pijl duidt profase en rode pijl duidt telofase. (B) kwantificering van vervorming van de matrix voor MDA-MB-231 cellen tijdens de interfase en mitotische fase, die aangeeft dat de vervorming van de matrix minimaal tijdens de celdeling is. Foutbalk = SEM (standaardfout van het gemiddelde). * p < 0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De eerdere studie van celdeling in 3D was niet efficiënt als gevolg van experimentele beperkingen en technische uitdagingen18,19. De kritische stappen voor efficiënte studie van zoogdieren celdeling in 3D collageen matrices zijn: (1) de opneming van fluorescentie-geëtiketteerden mitotische markeringen aan de cellen; (2) de synchronisatie van de afdeling van de cel; en (3) de bewaking van de divisie gebeurtenissen in 3D-matrices met behulp van live-cel beeldvormende techniek, time-resolved confocal reflectie microscopie en kwantitatieve analyse van de beeldvorming.
Mitotische cellen op 2D substraten kunnen worden onderscheiden van de interfase cellen op basis van hun morfologie, d.w.z. mitotische cellen zijn rond en nauwelijks hechten op de ondergrond overwegende dat interfase cellen verspreid en stevig op de ondergrond. In 3D-matrices, echter de morfologie van de cel is niet een betrouwbare markering voor mitotische cellen sinds sommige cellen nauwelijks verspreid en blijven in de matrix27,28-ronde. Het is dus essentieel om een mitotische markeerdraad aan de cellen voor de studie van celdeling in 3D-matrices. We stabiel H2B-mCherry in MDA-MB-231 cellen, die als een betrouwbare markering voor verschillende mitotische fasen diende, met inbegrip van de profase, prometaphase, metafase, anafase, en telofase/cytokinese uitgedrukt. Wij vroeger deze aanpak onderscheid mitotische cellen in de interfase cellen in 3D-matrices. Met de hulp van deze markering konden we ook voor het meten van de lengte van de mitotische fase voor een andere cellijn, HT1080 cellen, verdelen op substraten 2D en in 3D-matrices19.
Er zijn meerdere manieren om te synchroniseren van cellen, met inbegrip van serum honger29, mitotische shake-off30,31, dubbele thymidine blokkeren van32, en nocodazole32. We de thymidine-behandeling en de nocodazole behandeling efficiënt synchroniseren MDA-MB-231 cellen naar de G2/M fase gecombineerd. Cellen die zijn blootgesteld aan thymidine zijn gearresteerd bij de G1/S overgang en gedurende de S fase als gevolg van de remming van de DNA synthese door thymidine. De release van de cellen van de blootstelling van thymidine laat de voortgang van de cellen G2/M fase voor cellen gearresteerd in G1/S-fase, en G1 voor cellen gearresteerd bij de S-fase. Alle cellen die blootgesteld aan nocodazole worden gearresteerd op de G2/M-fase. De cellen van de afgerond-up mitotische fase werden vervolgens geschud-off van de plaat en direct ingekapseld in de collageen-matrices. We toonden aan dat ongeveer 70% van de cellen binnen 2 uur verdelen nadat ze zijn opgenomen in de collageen-matrices (Figuur 2). Anderzijds cellen kunnen worden ingesloten in collageen matrices voor synchronisatie, echter het kruislings gekoppelde netwerk van de collageen-matrix presenteert een fysieke barrière en vermindert het aantal biomoleculaire diffusie en convectie33, 34. inderdaad, we geprobeerd om te synchroniseren van cellen in collageen matrices met behulp van thymidine en nocodazole, maar verkrijgen van efficiëntere synchronisatie is mislukt. Dit resultaat zou kunnen te wijten zijn aan de inefficiënte diffusie en convectie van de drugs door middel van de collageen-matrix.
Reflectie is een intrinsieke optische eigenschap van vele biopolymeren, met inbegrip van collageen. De reflectie van de confocal microscopie techniek visualiseert en kwantificeert de microtopography van poreuze biomaterialen bereid uit synthetische polymeren en 3D collageen matrices23,24,35,36 ,37. In ons lab, hebben we technieken voor het controleren van wijzigingen in collageen vezels polariteit, aangezien de concentratie van collageen38 verschiltopgericht. Hier beschrijven we de methode voor het controleren van de vervorming van de collageenvezels op basis van de time-lapse-video van de reflecterende confocal afbeeldingen ter aanduiding van de cel-matrix interactie. De representatieve resultaten hier laten zien dat de vervorming van de matrix voor de mitotische MDA-MB-231 cellen aanzienlijk kleiner zijn dan de cellen in de interfase, die suggereert dat cellen van zoogdieren minimale gehechtheid en interacties met hebben de omliggende matrix bij het invoeren van de mitotische fase19.
Wij vroeger reflectie van de confocal microscopie controleren en cel-matrix interactie vóór, tijdens en na de mitose van HT1080 cellen te kwantificeren. Wij ook bewaakt de vervorming van de matrix door β1-integrine knock-down HT1080 cellen tijdens de interfase zowel mitotische fase. Afbreken β1-integrine aanzienlijk vermindert de vervorming van de matrix door de cel in interfase. Er is echter geen verschil in matrix vervorming tijdens de mitotische fase van de ronde β1-integrine knockdown (KD) cellen en het HT1080 wild type cellen19.
Een alternatieve benadering te visualiseren van collageenvezels is dienst fluorescentie-geconjugeerde controletype I collageen. Wij vroeger deze aanpak naar afbeelding tracks in de collageen-matrices gegenereerd door cellen19. Deze aanpak, echter, vereist de labeling van collageen met fluorescente kleurstof zoals fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC), die zowel tijdrovend minder en efficiënt. Aan de andere kant, kan reflectie van de confocal microscopie rechtstreeks worden toegepast op ongewijzigde collageen tijd en middelen besparen, en de kwesties in verband met fluorescentie photobleaching uitsluiten. Bovendien, deze methode hoeft niet een afzonderlijk fluorescerende kanaal, en is derhalve verenigbaar met alle fluorescente kleurstoffen.
De methode die in dit document gepresenteerd kan potentieel worden toegepast op elk type van zoogdiercellen die in een 3D collageen-matrix verdelen. De opneming van de markering H2B-mCherry in andere zoogdiercellen door lentivirale signaaltransductie zullen volgen precies dezelfde procedures zoals beschreven in het papier, hoewel verschillende soorten cellen kunnen hebben uiteenlopende efficiëntie voor transductie door lentivirus 39. de dichtheid van de cellen op transductie zowel de titer van het virus kunnen worden geoptimaliseerd voor efficiëntie. Indien hoge transductie efficiëntie kan worden bereikt, kunnen cellen worden geselecteerd door fluorescentie geassisteerde cell sorting (FACS). Blokkeren van thymidine en nocodazole worden toegepast om diverse andere typen cellen van zoogdieren, zoals HeLa40zijn gesynchroniseerd. Mechanische schok-off kan worden toegepast op alle celtypes die ronden en nauwelijks hechten op de ondergrond tijdens de mitotische fase30,31. Bovendien, de beeldvorming van collageenvezels met behulp van de reflectie van de confocal microscopie, en de kwantificering van de matrix vervorming rechtstreeks kan worden toegepast op alle andere soorten verdelen van zoogdiercellen.
De methode die hier gepresenteerd is een efficiënte en algemene aanpak te onderzoeken zoogdieren celdeling en cel-matrix interacties in een 3D omgeving. De benadering ons sonde naar de moleculaire basis van de ontwikkeling van normale weefsel en ziekten vergemakkelijkt en potentiates van het ontwerp van roman diagnostische en therapeutische benaderingen in de toekomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de NIH grants R01CA174388 en U54CA143868. De auteurs wil erkennen de PURA award van de Johns Hopkins University voor ondersteuning van Wei-tong Chen. Dit materiaal is gebaseerd op werk gesteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship onder Grant nr. 1232825.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human embryonic kidney 293T | ATCC | ||
| MDA-MB-231 | Physical Sciences Oncology Center, NIH | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM powder | ThermoFisher Scientific | 12100-046 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin-Streptomycin 100X | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Lipofectamine 2000 | Life technologies | 11668-07 | |
| Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector | Addgene | plasmid 21217 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Sodium bicarbonate | GibcoBRL | 11810-025 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 113375-100 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| NaOH | J.T. Bake | 3722-01 | |
| Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm | Millipore | SLHVM33RS | |
| Nikon TE2000E epifluorescence microscope | Nikon | TE2000E | |
| Cascade 1K CCD camera | Roper Scientific | ||
| NIS-Elements AR imaging software | Nikon | ||
| Nikon A1 confocal microscope | Nikon | A1 |
References
- Ly, D. H., Lockhart, D. J., Lerner, R. A., Schultz, P. G. Mitotic misregulation and human aging. Science. 287 (5462), 2486-2492 (2000).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
- Brinkley, B. R. Managing the centrosome numbers game: from chaos to stability in cancer cell division. Trends Cell Biol. 11 (1), 18-21 (2001).
- Phillip, J. M., Aifuwa, I., Walston, J., Wirtz, D.
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Martin, M. D., et al. Effect of ablation or inhibition of stromal matrix metalloproteinase-9 on lung metastasis in a breast cancer model is dependent on genetic background. Cancer Res. 68 (15), 6251-6259 (2008).
- Knox, J. J., Hotte, S. J., Kollmannsberger, C., Winquist, E., Fisher, B., Eisenhauer, E. A. Phase II study of Triapine in patients with metastatic renal cell carcinoma: a trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group (NCIC IND.161). Invest New Drugs. 25 (5), 471-477 (2007).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D. L., Fojo, A. T. Inhibitors targeting mitosis: tales of how great drugs against a promising target were brought down by a flawed rationale. Clin Cancer Res. 18 (1), 51-63 (2012).
- Tong, W. G., et al. Phase I and pharmacologic study of SNS-032, a potent and selective Cdk2, 7, and 9 inhibitor, in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma. J Clin Oncol. 28 (18), 3015-3022 (2010).
- Matulonis, U. A., et al. Phase II study of MLN8237 (alisertib), an investigational Aurora A kinase inhibitor, in patients with platinum-resistant or -refractory epithelial ovarian, fallopian tube, or primary peritoneal carcinoma. Gynecol Oncol. 127 (1), 63-69 (2012).
- Boss, D. S., et al. Clinical evaluation of AZD1152, an i.v. inhibitor of Aurora B kinase, in patients with solid malignant tumors. Ann Oncol. 22 (2), 431-437 (2011).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 211-224 (2006).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
- Giri, A., et al. The Arp2/3 complex mediates multigeneration dendritic protrusions for efficient 3-dimensional cancer cell migration. FASEB J. 27 (10), 4089-4099 (2013).
- Fraley, S. I., Feng, Y., Giri, A., Longmore, G. D., Wirtz, D. Dimensional and temporal controls of three-dimensional cell migration by zyxin and binding partners. Nat Commun. 3, 719 (2012).
- Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. J Cell Biol. 205 (2), 155-162 (2014).
- He, L., et al. Local 3D matrix confinement determines division axis through cell shape. Oncotarget. 7 (6), 6994-7011 (2016).
- Held, M., et al. CellCognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7 (9), 747-754 (2010).
- Fallica, B., Maffei, J. S., Makin, G., Zaman, M. Alteration of cellular behavior and response to PI3K pathway inhibition by culture in 3D collagen gels. PLoS One. 7 (10), e48024 (2012).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-20 (2010).
- Gunzer, M., Kampgen, E., Brocker, E. B., Zanker, K. S., Friedl, P. Migration of dendritic cells in 3D-collagen lattices. Visualisation of dynamic interactions with the substratum and the distribution of surface structures via a novel confocal reflection imaging technique. Adv Exp Med Biol. 417, 97-103 (1997).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. J Vis Exp. (80), e50763 (2013).
- Lleres, D., James, J., Swift, S., Norman, D. G., Lamond, A. I. Quantitative analysis of chromatin compaction in living cells using FLIM-FRET. J Cell Biol. 187 (4), 481-496 (2009).
- Poincloux, R., et al. Contractility of the cell rear drives invasion of breast tumor cells in 3D Matrigel. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (5), 1943-1948 (2011).
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods Mol Biol. 761, 75-83 (2011).
- Jackman, J., O'Connor, P. M. Methods for synchronizing cells at specific stages of the cell cycle. Curr Protoc Cell Biol. 8, (2001).
- Zwanenburg, T. S. Standardized shake-off to synchronize cultured CHO cells. Mutat Res. 120 (2-3), 151-159 (1983).
- Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol Biol. 296, 157-166 (2005).
- Kihara, T., Ito, J., Miyake, J. Measurement of biomolecular diffusion in extracellular matrix condensed by fibroblasts using fluorescence correlation spectroscopy. PLoS One. 8 (11), e82382 (2013).
- Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys J. 83 (3), 1650-1660 (2002).
- Harjanto, D., Maffei, J. S., Zaman, M. H. Quantitative analysis of the effect of cancer invasiveness and collagen concentration on 3D matrix remodeling. PLoS One. 6 (9), e24891 (2011).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
- Petroll, W. M. Differential interference contrast and confocal reflectance imaging of collagen organization in three-dimensional matrices. Scanning. 28 (6), 305-310 (2006).
- Fraley, S. I., et al. Three-dimensional matrix fiber alignment modulates cell migration and MT1-MMP utility by spatially and temporally directing protrusions. Sci Rep. 5, 14580 (2015).
- Ikeda, Y., Collins, M. K., Radcliffe, P. A., Mitrophanous, K. A., Takeuchi, Y. Gene transduction efficiency in cells of different species by HIV and EIAV vectors. Gene Ther. 9 (14), 932-938 (2002).
- Ma, H. T., Poon, R. Y.
