Summary
現在の二層文化モデルは模倣する生体内微小機能の in vitro研究できないようにします。ポリエチレング リコール、酸化亜鉛テンプレート メソッドを使用してこのプロトコル記述する可変剛性、気孔率、体内によく似た成分と、極薄のバイオミメティック基底膜の開発細胞外マトリックス。
Abstract
基底膜は、剛性、組成、アーキテクチャ、および気孔率で変わることができる細胞膜の重要なコンポーネントです。内皮細胞上皮膜のin vitro研究伝統的二層文化を有効にすると透過性のサポート モデルに依存しているが、透過性のサポート、人間の基底膜の多様性を複製する能力に制限が。対照的に、化学合成を必要とするハイドロゲル モデル高調整可能、素材の剛性とバイオミメティック ペプチッドまたは蛋白質の定款による生化学的組成の両方の変更を可能にします。ただし、従来のハイドロゲル モデルは、細胞間の接触と移民研究機能の in vitroの毛穴がないため機能に制限されます。さらに、伝統的なゲルの厚さによるハイドロゲルの全体の厚さにまたがる毛穴定款は挑戦されています。本研究で我々 は生体模倣ヒドロゲルの以前の欠点に対処するのに poly-(ethylene-glycol) (PEG) ゲルおよび亜鉛酸化物テンプレート メソッドを使用します。その結果、可変間隙のアーキテクチャ、機械的性質、成分とカスタマイズ可能な足場にコンフルエントの細胞膜の文化を可能にする極薄、基底膜のようなハイドロゲルを提案します。
Introduction
細胞外マトリックス (ECM) は細胞接着をサポートし種類の異なる細胞の間の障壁として機能および複雑な組織や臓器の重要なコンポーネントは、タンパク質の足場を作る。間質結合織と対照をなして基底膜 (BM) は互いから組織のコンパートメントに分割するバリアとして機能する ECM の特殊な型です。BMs は約 100 μ m、厚さ、従ってどちらかの側の細胞間の直接的および間接的な通信を可能にします。BMs の 2 つの一般的な例は、ペリサイトおよび内皮細胞間の血管壁は、血管の BMs と内皮細胞および上皮細胞の間にある気道 BMs です。BMs は役立つ細胞極性や移行などの細胞機能の調節に、健康および病気の重要な役割です。1構成、剛性、アーキテクチャ、および BMs の気孔率は、異なる生理機能を容易にする器官システムによって異なります。たとえば、BM 毛穴は感染時に炎症や細菌中の免疫細胞の移動、細胞間コミュニケーション、可溶性分子拡散を維持するために重要です。気道で毛穴は直径 0.75 から 3.86 μ m2に至るまでの BM の完全な厚さにまたがる
BM の薄い性質が細胞の種類は、1 つの別から物理的に分離、パラクリンと連絡先を介したシグナルを介した細胞間コミュニケーションが維持されることを保証します。したがって、人間の病気のin vitro での研究に研究者は培養細胞膜に多孔質の透水性サポート挿入に頼ってきました。3これらのモデルは、重要な健康および病気の役割を果たしている細胞のコミュニケーションを理解するためにされています。3,4,5,6,7透水性サポート挿入白血球動員や細菌浸潤; などの生理学的プロセスを調節する細胞シグナリング方法を理解するための基本的な要件を満たすただし、挿入の重要な制限があります、人間点換気サポートを模倣する失敗挿入機械的および生化学的な可変性がないし、単純な多孔質構造が不規則な毛穴を作成する線維状構造を模倣していませんBMs の典型的です。したがって、細胞プロセスに影響を与える固有の BM プロパティを再作成することができます可変システムの成長の必要性があります。
ポリマー ベースの基板は、バイオミメティック体内環境をもっと密接に模倣するコンテキストで細胞膜を研究する BMs の開発のための理想的な候補です。8,9,10,11,12ポリマーが機械的に可変、バイオミメティック ペプチド断片.を組み込むこと化学的に変更することができます。11,12,13不活性ポリマー, ポリエチレング リコール (PEG) バイオミメティック BMs を作成する使用することができます、最近の作品の詳細な細胞の成長をサポートする多孔質ネットワークと機械的に可変のペグ アルギニン-グリシン-アスパラギン酸 (RGD) ゲルの合成・炎症細胞走化性。14公開ペグ ベースが基板は、透過性のサポートする範囲よりヒトの ECM のより現実的なモデルを提供、これらのモデルの多くは細胞膜の文化を作成する能力を制限する約 775 μ m の深さを持つ、非常に厚い、連絡先。14
現在の細胞膜培養技術の制約の多くを克服するペグのポリマー ベース BM 模倣を作成するためのプロトコルを紹介します。ポリマーの合成と架橋は、その後、選択的にから削除中に酸化亜鉛微結晶生産の製造に広く使用された材料を組み込んだテンプレート メソッドを開発している、結果として得られるバルク高分子。このプロセスは、人間の BMs の蛇行と相互接続の細孔ネットワークを模倣したランダム多孔性ネットワークを生成します。さらに、気孔率はサイズと針生産時に反応の化学量論の変更を介して酸化亜鉛微結晶の形状を変更することによって変更できます。ここで開発した技術は人間の点最後に、力学、気孔率、厚さを模した超薄ハイドロゲルを作成し、これらの BM のような構造の生化学的組成はほとんどは微小環境を生成する簡単に変更できます。その見られる生体内に似ています。
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Protocol
回使用し、すべての安全上の注意を使用する前すべての材料の材料安全データ シート (MSDS) をお読みください。
1. 酸化亜鉛針の合成
- 0.04 M Zn (3)2の 250 ml * 6 H2O ソリューション硝酸亜鉛の 2.9749 g を 250 mL の水に追加することによって。
- 6 g の水酸化ナトリウムを 150 mL の水に追加することによって 1 M NaOH の 150 mL を準備します。
- 攪拌器、ホット プレートに鉱物油浴を設定し、常温で油浴に 500 mL の丸底フラスコを水没します。
- 亜鉛 (3)2の 250 mL を追加 * 6 H2O、フラスコに反応を攪拌を開始。
- 150 mL の NaOH 溶液 (白色沈殿物が簡単に形成および 2 つのソリューションがミックスするのにつれ消えてしまう) を追加します。発見 2 時間攪拌します。
- 55-60 ° C に、フラスコの熱し、24 h の攪拌を続行します。
- 熱をオフし、ソリューションを撹拌しながら室温に冷却します。
- 11 μ m の細孔を Büchner 漏斗にソリューションをフィルター、乾燥させて一晩、覆いを取られました。フィルター ペーパーが注がれたソリューションから濡れているもはや漏斗穴上に白い粉が形成されたと、粒子は完全に乾燥させます。
- ZnO 針を収集し、針のような形態を確認する走査電子顕微鏡 (SEM) の準備します。簡単に、ピン スタブにカーボン テープをマウントし、ZnO 針をカーボン テープを中傷する金属のヘラを使用します。22.4 g/cm3の密度で 8 mm イリジウム コートをスパッタし、10 に画像を取得する kV。
2 HCl の顕微鏡のスライド犠牲亜鉛層の添加による PEG のリリース
- メタノール 200 mL に酢酸亜鉛の 1.756 g 溶解して酢酸亜鉛溶液を準備します。
- 70% のエタノールと使い捨てワイプ 3"× 1" プレーン顕微鏡スライドをきれいに。乾いた空気で 10 分間乾燥させて。
- 150 mm ガラス ホット プレート上にペトリ皿を置くし、150-160 ° C に予熱
- ピペット電球ガラス ピペットを使用して、酢酸亜鉛、スライド上に分散した薄層を形成の 5 滴を適用することでピンセットとコートのスライドとスライド ガラスを保持します。原液を滴下させる余分なソリューションを許可します。
- 亜鉛アセテート コーティング面を上に向けて事前に加熱されたペトリ皿 (150-160 ° C) にスライドを配置します。15 分ホット プレートに残します。
- ピンセットでスライドを削除し、室温に冷却します。白の縞を持つコーティングするスライドが表示されます。
- 使い捨て可能なワイプを使用して顕著な白い縞を削除するスライドの残りは任意の余分な亜鉛を削除します。表面を均一にする必要があります。
- 公開、無菌性を確保するため、少なくとも 1 時間のためのバイオ セーフティ フードの光の紫外線に準備されたスライド。
注意: 紫外光は目に有害であるし、肌を露出しました。目や皮膚への直接露出を避けるため、使用していないときに電気供給をオフにします。
3. シリコーン アイソレータの作製
- 正方形よりも小さい 1"× 1" にカット シリコン シート (アイソレータは 6 よく皿に収めることができるである必要があります)。
- 生検パンチで正方形の中心に 8-12 mm の穴をパンチします。
- 20 分間のオートクレーブ シリコーン絶縁 121.0 ° C および 1.12 kg/cm で。
4. PEG 溶液及びゲル合成のペグの準備
注: 機能化・重合 PEG の検討されている広範囲と前述の研究室や他の人によって。8,10,11,13,14,15,16,17
- RGD 細胞接着ペプチドを組み合わせてアクリロイル-ペグ-NHS 50 mM 炭酸水素ナトリウム (pH 8.5) のアクリル部分は、以前にされている生化学的反応とペプチドのアミン末端官能基化を有効にする 1:1 のモル比で効率 85% 以上を生成するために特徴付けられます。17
- 300 mg/mL の濃度で 1-ビニル-2-ピロリドンと 2, 2-ジメトキシ-2-phenylacetophenone の混合光開始剤を準備します。
- 1.5 mL チューブを別個で、以下重量を量り: ZnO 針 20 mg、ペグ-DA の 12.5 mg と 2.5 mg ペグ RGD の。
- 270 μ 10 %fbs/PBS 溶液で酸化亜鉛針の 20 mg を中断します。ミックスする渦 (約 15 秒)。
- 簡単に (< 1 s) スピン チューブのベースに、ZnO 凝集体を持ってベンチトップ ミニ遠心分離機のソリューション。
- 集計をチューブの底におく、ZnO ソリューションの上から 250 μ L を収集します。約 2.5 mm RGD 止め釘の解決を作成するペグ DA とペグ RGD と組み合わせます。ミックスする渦 (約 15 秒)。
- アセトフェノン/n ‐ ビニルピロリドン写真ハブと簡単にミックスする渦の 2 μ L を追加 (約 5 秒)。
- ZnO コーティング スライドの中央に沿って高分子溶液 20 μ L を追加します。
- ZnO コーティング面を上の 2 番目のスライドをゆっくりと下げるダウン (止め釘の解決は 2 つの ZnO 被覆層の間する必要があります)。空気の泡の形成を防止しようとします。任意の気泡を脱出し、薄い層にソリューションを普及するように主要な軸に沿って横にスライドを移動します。ポリマー溶液を使用してスライドの大部分をカバーします。後の手順でスライドを引き離すにことができることを確保するため一番上のスライドとわずかなオーバー ハングを作成します。
- 架橋 15 分 365 nm の紫外線ランプ (約 10 mW/cm2) の下でスライド。
5. ペグのリリースがスライド ガラスからゲルします。
- 張り出したスライドと手動でスライドを割ることを避ける 2 つのスライドを順番にゆっくりとしたペースで離れてプルに圧力を適用されます。少なくとも 5 分間乾燥一晩ゲルを許可します。
- 滅菌 25 ミリメートルのガラス シャーレにスライドを配置し、優しくスライド (約 10-20 mL) をカバーする十分なだけを使用してスライドに 1 M 塩酸溶液を注ぐ。シャーレ; がみ合うゲルは、HCl 溶解亜鉛コーティングや針、スライドを持ち上げますが開始されます。ゲルはスライドから無料で、一度は、原液に HCl を注ぐ。
- スライドとゲルが水中に沈むまでゆっくりペトリ皿に約 25 mL の 1x PBS を注ぐことによって、ジェルを洗い流してください。
6. 細胞膜の播種
- A549 細胞の播種を備えます。簡単に言えば、5 mL の 1x PBS で 75 cm2フラスコを洗い流し、0.25% の 3 mL を加えるトリプシン-EDTA と 37 ° C で 2 〜 3 分に座ってみましょう
- 機械的にフラスコを扇動、10% 胎仔ウシ血清および 1% ペニシリン-ストレプトマイシン、3 mL ダルベッコ変更イーグル媒体との反応を抑制し、15 mL の三角フラスコに収集します。完全なダルベッコ変更イーグル メディアの追加 4 mL で洗い、同じ円錐形にまとめます。6 分の 475 x g でセルをスピンします。
- セルを回転している中、6 ウェル プレートの各ウェルに完全なダルベッコ変更イーグル中の小滴を追加します。ゲルはメディアのドロップの休憩など、新しい 6 ウェル プレートにゲルにシリコーン アイソレータを転送するのにピンセットを使用します。今では、ゲルは、薄層に広がっている、目に見えない大きな穴がないことを確認します。これは直前の細胞播種乾燥ゲルの割れを避けるためにされるべきであります。
- 10% 胎児牛血清および 1% ペニシリン-ストレプトマイシン 6 × 105セル/mL の濃度でダルベッコ変更イーグル培地で細胞を再懸濁します。パンチで抜いたシリコン膜部のメニスカスを維持しようとして、ゲルの中央に賢明な細胞懸濁液の滴を加えます。4 h の付着する細胞を許可します。
- 4 h 後もダルベッコ変更イーグル完了の中の 0.5 mL を追加し、可能にする、完全密着の 37 ° C で一晩インキュベートします。、
- 次の日に備える細胞播種 Huvec。
- 5 ml の 1x PBS の 75 cm2フラスコを洗い流し、0.25% の 3 mL を加えてトリプシン-EDTA と 37 ° C で 2 〜 3 分に座ってみましょう
- 機械的にフラスコを扇動、3 mL 20% 牛胎児血清、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、1% の成長サプリメントと M199 メディアとの反応を抑制し、15 mL の円錐形に収集します。
- M199 完全なメディアの 4 mL で洗い、同じ円錐形にまとめます。6 分の 475 x g でセルをスピンします。
- 下セルを回転している間は、新しい 6 ウェル プレートの各ウェルに完全培地 199 の小滴を追加します。シリコーンのセンターでメディアのドロップによく新しいシリコーン アイソレータを配置します。
- 新しい 6 ウェル プレートのアイソレータに A549 細胞を PEG ゲルを支えるシリコーン アイソレータを反転慎重にピンセットを使用します。
- 6 × 105セル/mL の濃度で比較を再懸濁します、シリコン膜の打ち抜き領域内のゲルのメニスカスを維持しようとして、賢明な反転ゲル ドロップの中央に細胞懸濁液を追加します。2 h の付着する細胞を許可します。
- 2 時間後優しく M199 完全なメディアの 2 mL を各ウェルに追加します。
7. 蛍光抗体法
- 慎重に手動ピペットとゲルからメディアを削除し、セルのシード、ゲルの中央に 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の約 500 μ L を追加します。室温で 30 分間座ってみましょう。
注意: PFA は有毒な化学薬品;保護具を着用し、生物学的安全キャビネットで処理を行うようにします。 - 慎重に PFA を削除し、PBS で 2 %bsa の約 500 μ L をゲルに追加します。室温で 1 時間放置します。
- BSA を慎重に取り外します。Pbs は、2 %bsa で 1: 100 希釈で一次抗体を準備、500 μ L をゲルに追加します。室温で 1 時間放置します。500 μ L の 1x PBS で優しくすすぎます。
- 二次抗体と同じプロセスを繰り返します。以下の抗体: 1) 抗ひと CD144 (VE カドヘリン) クローン 16B1;2) 抗ひと CD324 (E-カドヘリン) クローン 6714;3) 抗ひと CD31 (PECAM-1) クローン C-20;4) アンチ A549;5) 抗マウス FITC;6) Alexa Fluor 647 の反やぎ。F-アクチンを可視化、ファロイジン 500 μ L を追加 (PBS で 10 μ g/mL) 20 分。
- 慎重に二次抗体またはファロイジンを削除し、DAPI を 500 μ l 添加 (0.1 μ g/mL) 20 分の DAPI ソリューションを慎重に取り外し、ゲルが懸濁液で優しく各ウェルに 1.5 mL の 1x PBS を追加。
- ピンセットやシリコーン絶縁を使用して、スライド ガラスに 1 つのゲルを転送します。イメージング、直前にゲルのとイメージング後 PBS ソリューションにゲルを交換します。
- また、DAPI マウント媒体を使用してゲルをマウントします。シールもマニキュアとサンプル、乾燥とゲルの割れを防ぐために 2 日以内の画像を取得します。トラブルシューティングには、表 1 を参照してください。
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Representative Results
ペグ RGD ヒドロゲルは、2 つの犠牲酸化亜鉛層間高分子溶液を挟むと酸化亜鉛の針で毛穴テンプレートの作成によって形成されました。いけにえの亜鉛酸化物は塩酸、連続気孔 (図 1) と極薄のペグ ゲルを生成し取り外しました。酸化亜鉛針の形態を走査型電子顕微鏡 (SEM)、確認したし、それぞれ 3.92 ± 0.089 μ m および 0.43 ± 0.02 μ m にする平均の長さと幅を求めた (図 2A ・ 2 b)。酸化亜鉛針の除去、ハイドロゲル毛穴 SEM によって想像されたもの、(図 2C - 2E) が特徴します。ヒドロゲルの細孔の平均密度は、176,863 ± 49,532 毛穴でした。SEM を視覚化し、標準 3 μ m 孔ポリカーボネート透サポート挿入の気孔密度の計算に使用されたもと気孔密度は平方ミリメートル (図 2D、1 約 2.51 ± 0.05 孔、有意に低いことが判明しました表 2)。平均孔径亜鉛酸化をテンプレート ペグ ハイドロゲル 0.19 ± 0.01 μ m をされ (図 2E,表 2) 透水性サポート挿入観察 3.47 ± 0.21 μ m 孔よりも有意に大きかった。光干渉断層計は、両方の 2 および 3 次元画像を取得し、1 × PBS (図 3A ~ 3 b) に浮かぶヒドロゲルの厚さを決定する使用されました。平均ゲル厚は μ m ± 3.47 18.89 (表 2)。ゲルの力学も前述したように、弾性率を測定することによって評価したし、平均のヤングは 96.78 ± 23.92 kPa (表 2) に発見されました。14
蛍光顕微鏡は、内皮細胞、上皮細胞が極薄のペグ RGD ゲル上で培養後形質身元を維持を示しています。内皮細胞は、アンチ A549 抗体 (図 4A ・ 4 b) に染色 PECAM-1、および上皮細胞の発現を維持されます。両方のセルのタイプには、タイトな接合を形成する能力も維持されます。血管内皮細胞は、細胞間のジャンクションで VE カドヘリンを表現し、上皮細胞表現 E-カドヘリン (図 4C 4 D)。ペグ RGD ヒドロゲルはまた細胞膜をサポートして、ファロイジン染色サンプル (図 4E) 蛍光イメージングによる実証として、多孔質構造内のフォームに細胞間の接触を可能にします。
図 1.ゲルの準備のプロトコルの概要。A)合成と ZnO 針のコレクション。B)スライド ガラスの作製犠牲酸化亜鉛層を作成します。C)準備とシリコーン型アイソレータの滅菌。D) PEG の準備により、ZnO 針。E)スライド ガラス被覆 ZnO 間ゲルの重合のペグします。白い線は、いけにえの ZnO 針とコーティングを表します。F)針の取り外しとスライドからゲルのリリースの HCl リンス。濃い線は、溶存 ZnO 針によって作成された毛穴を表しています。G)細胞の播種に備えて 6 よく皿にシリコーン絶縁とゲルの転送。H)細胞播種します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.亜鉛針特性とゲルの気孔率。A)亜鉛針 (スケール 5 μ m バー) の SEM 像。B)の長さと幅は、針を亜鉛します。ドットの測定を表す個々 の針;線は、平均値と標準誤差を表しています。C)多孔性ハイドロゲル (スケール 2 ミクロン バー) の SEM 像。D)気孔密度およびE)ポリカーボネートの透過性のサポート、ペグ ヒドロゲルの平均細孔径。バーは、平均値と標準誤差を表しています。p < T 検定経由で 0.0001。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.ハイドロゲルの厚さ。光コヒーレンストモグラフィを示しますA) 3 次元とB) PBS に浮かぶヒドロゲルの 2 次元の画像。アスタリスクは、ハイドロゲル、矢印は液体表面を表します。スケール バーは 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.ヒドロゲル サポート単層および二層文化。両方内皮細胞と上皮細胞が PEG ヒドロゲルの合流の単分子膜を形成することができる蛍光染色によって示されるように) CD31 (DAPI 青赤、CD31) とB) A549 (A549 赤、青 DAPI)、それぞれ。そのままカドヘリン接合の形成で例示C)血管内皮細胞 (DAPI 青い緑、VE カドヘリン) とD)上皮細胞 (DAPI 青い緑、E カドヘリン) (スケール バー 100 ミクロン)。E)ファロイジン染色 (ファロイジン赤、青 DAPI) (スケール バー 10 μ m)、細胞膜の 2 つの例を示した。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 問題 | 潜在的なソリューション |
| ゲルには、大きな穴があります。 | 亜鉛針がそれらを使用する前に十分壊れているかどうかを確認します。 |
表 1。問題のトラブルシューティングのためのソリューションを提案しました。
| ハイドロゲル | Transwell | 細胞外マトリックス | |
| 孔密度 (毛穴/mm2) | 105 ± 4.9 x 104 x 1.77 | 2.51 ± 0.05 | 8.50 × 102 7.0 × 104 2, 14 |
| 孔径 (μ m) | 0.19 ± 0.01 | 3.47 ± 0.21 | 0.47 に 3.86 2, 14 |
| 厚み (μ) | 18.89 ± 3.47 | 10 | 0.05、0.10 17 |
| ヤング係数 (kPa) 5 | 96.78 ± 23.92 | > 1000 | 3.5 14 |
表 2。標準透過性サポート挿入し細胞外マトリックス ヒドロゲルの物性の比較 (値が平均を表す ± 標準誤差)
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Discussion
ここで詳細なプロトコルをバイオミメティック BM 足場として機能する可変ペグ ハイドロゲルを作成できました。具体的には、さまざまな PEG 分子量、ペプチドの活用戦略と酸化亜鉛微結晶構造や濃度、弾性率、生化学的性質と、ヒドロゲルの細孔構造変更できます、それぞれ。極薄のペグ足場は高い気孔密度と基底膜標準透過性のサポート モデル (表 2) と比較して体内で見つかった機能のより擬態は小さい孔径を備えています。さらに、このメソッドを介して平均厚さ 20 μ m 以下の極薄構造を実現しました。ポリカーボネートの透過性のサポート モデルは、我々 の知識のちょうど 10 μ m の極薄層を既に達成している間この厚さを達成するために最初の浮遊と可変ハイドロゲル システムです。最後に、ペグ ヒドロゲルある桁違いに少なく伝統的な透過性のサポート、組織培養プラスチック、ガラス、すべては弾性率 GPa の範囲に、したがってより多くのよりも硬いは約 100 kpa の空気の弾性係数低に匹敵する (< 10 kPa) の生体内の細胞外マトリックス (表 2) 弾性率。
低弾性率を達成するため、ここで提示された作業の主な目標の 1 つだったし、伝統的なポリカーボネートの使用に制限の 1 つは、透過性のサポート モデル。作業は基板剛性が分化細胞の細胞運命を導くことができることを示しているし、基板剛性はセルの動作を指定することが知られています。12硬い基板模倣する病気の状態、線維組織や悪性腫瘍などにも使われている、そのために正確に健康な組織の代表ではないです。18,19,20,21静止細胞表現型と機能を研究するために重要です関連する生体内である弾性率を模倣する基板を使用します。このシステムの主要な利点の 1 つは、異なる分子量のペグを使用して達成することができますゲルの力学を調整する能力です。多くの病気は ECM 硬直に関連付けられて、このシステムは病気 BM 対健康の細胞機能に及ぼす影響を研究するためバイオミメティック プラットフォームを提供します。このシステムのそれ以上の変更は含まれて細胞接着ペプチド フラグメントを変えることによっても実現できます。本研究の目的の RGD はしっかり細胞付着を容易にする多くの BM 蛋白質とその能力でそのユビキタス式のために使用されました。RGD、に加えて頂基底細胞の極性形成を導くラミニン上皮性の相互作用を促進するラミニン フラグメントを組み込むこともできます。1同様に病気で BM の剛性を変更すると、基底膜の組成は病理学の条件に改造されました。アミン反応性 PEG NHS 前駆体を使用して、さまざまなペプチドおよびタンパク質をペグ ポリマー ベースを共役することが可能です。11,14,15これは異なるインテグリン受容体インテグリンの関与の効果を調査するため特に有利です。たとえば、コラーゲンとフィブロネクチンの発現 RGD 配列は複数のインテグリンを従事がインテグリン αvβ3 の高い特異性。具体的にはフィブロネクチンの豊富な基質を模倣、ロイシン アスパラギン酸バリン (LDV) シーケンスを組み込むことができるインテグリンを従事するアスパラギン酸グリシン グルタミン酸酸アラニン (DGEA) を追加でした α4β1 に従事するまたは膠原線維膜を模倣するためには、Α2Β1。8
内皮上皮膜は、ここで提示されたモデルで作成できます細胞膜のほんの一例です。自然は体内に存在薄い BM や ECM、のみで区切られた他の膜内皮周皮細胞と内皮細胞-平滑筋細胞膜があります。したがって、このメソッドのアプリケーションは、広範な呼吸器から血管生物学に拡張します。さらに、これらのゲルのユニークな気孔率のため、彼らは以前のハイドロゲルのモデルをサポートすることができるされていない機能の研究を実施する能力を提供します。毛穴を超薄ハイドロゲル体制に組み込む、作成できました、透過性のサポート モデルの強化されたバイオミメティック交換細菌浸潤、肺全体の一般的な発生の調査を有効にします。結核で上皮内皮バリア。3,6,14,22同様に、輪廻や培養血管細胞に炎症性細胞の走化性を調べられることが示したように、ゲルの RGD 機能性細胞接着表面にセルの捕獲率を測定することによって16これはカプセル化で共培養条件を達成している以前のハイドロゲルによる方法と比べて有利です。このようなシステムは、近接とセルを 2 つの細胞のタイプ間の接触および血管新生、血管などの機能を測定するために成功している多くを提供する二次元のシステムによって提供されるユーザー補助が足りないが共培養細胞の境界を越えたリーク、浸潤、またはアクティブな移行を測定するための単純なプラットフォームです。17
したがって、ここで紹介する方法は、複数の分野でさまざまな研究のためのプラットフォームを提供しています、さらに体内の病態を理解するin vitro研究から関連性の高いデータの生成に向けた足掛かりを提供しますメカニズム。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、彼らの思慮深い会話と材料科学の専門知識の教授ポール ・ ヴァン ・ タッセルと教授 Chinedum ・ オスジを感謝したいです。この仕事のための資金は、ライアンキャラハン新しいイニシアティブ賞、国立機関の健康 NIBIB BRPR01 EB16629 01A1 によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Hydrogel Chloride (HCl) | EMD | HX0603-75 2.5L | Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| 1X PBS | Gibco | 14040-133 500 mL | None |
| Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 228737-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Macron Chemicals | 278408-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) | Fisher Scientific | AC45180010 1 kg | Use with eye protection and gloves. |
| Methanol (CH3OH) | J.T. Baker | 9070-05 4L | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS | VWR | 97068-085 | Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS |
| Mineral oil | CVS | PLD-B280B | None |
| Round bottom flask | ChemGlass | N/A | |
| Thermometer | N/A | ||
| Stir bar | N/A | ||
| Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick | Thermo Scientific | 420-004T | Spray with ethanol and let dry prior to use. |
| Glass pasteur pipets | N/A | ||
| 1 mL rubber bulbs | N/A | ||
| Plastic 100 mm petri dishes | N/A | ||
| Sterile forceps | N/A | ||
| Silicone isolators | 0.8 mm thick | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) punches | N/A | ||
| Glass bottles | N/A | ||
| 6 well plates | Cellstar | 657 160 | N/A |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Stirrer-hot plate | VWR Dya-Dual | 12620-970 | Use with eye protection and gloves. |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 | Sigma-Aldrich | 24650-42-8 | Use with eye protection and gloves. |
| 1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) | Aldrich | Use with eye protection and gloves. | |
| Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) | Fluka | 81280-1kg | Use with eye protection and gloves. |
| RGDS | Life Tein | 180190 | Use with eye protection and gloves. |
| Blak-Ray long wave UV lamp | UVP | Model B 100AP | N/A |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | N/A |
References
- Domogatskaya, A., Rodin, S., Tryggvason, K.
- Howat, W. J., Holmes, J. A., Holgate, S. T., Lackie, P. M. Basement membrane pores in human bronchial epithelium: a conduit for infiltrating cells. Am J Pathol. 158, 673-680 (2001).
- Lauridsen, H. M., Pober, J. S., Gonzalez, A. L. A composite model of the human postcapillary venule for investigation of microvascular leukocyte recruitment. FASEB J. 28, 1166-1180 (2014).
- Mul, F. P., et al. Sequential migration of neutrophils across monolayers of endothelial and epithelial cells. J Leukoc Biol. 68, 529-537 (2000).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84, 736-752 (2004).
- Birkness, K. A., et al. An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection. Infect Immun. 67, 653-658 (1999).
- Wang, L., et al. Human alveolar epithelial cells attenuate pulmonary microvascular endothelial cell permeability under septic conditions. PLoS One. 8, 55311 (2013).
- Pellowe, A. S., Gonzalez, A. L. Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8, 5-22 (2016).
- Peyton, S. R., Raub, C. B., Keschrumrus, V. P., Putnam, A. J. The use of poly(ethylene glycol) hydrogels to investigate the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells. Biomaterials. 27, 4881-4893 (2006).
- West, J. L. Protein-patterned hydrogels: Customized cell microenvironments. Nat Mater. 10, 727-729 (2011).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J Control Release. 109, 139-148 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Taite, L. J., et al. Bioactive hydrogel substrates: probing leukocyte receptor-ligand interactions in parallel plate flow chamber studies. Ann Biomed Eng. 34, 1705-1711 (2006).
- Lauridsen, H. M., Walker, B. J., Gonzalez, A. L. Chemically- and mechanically-tunable porated polyethylene glycol gels for leukocyte integrin independent and dependent chemotaxis. Technology. 02, 133-143 (2014).
- DeLong, S. A., Moon, J. J., West, J. L. Covalently immobilized gradients of bFGF on hydrogel scaffolds for directed cell migration. Biomaterials. 26, 3227-3234 (2005).
- Lauridsen, H. M., Gonzalez, A. L. Biomimetic, ultrathin and elastic hydrogels regulate human neutrophil extravasation across endothelial-pericyte bilayers. PLOS one. 12, 0171386-0171405 (2017).
- Peters, E. B., Christoforou, N., Leong, K. W., Truskey, G. A., West, J. L. Poly(Ethylene Glycol Hydrogel Scaffolds Containing Cell-Adhesive and Protease-Sensitive Peptides Support Microvessel Formation by Endothelial Progenitor Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 9, 38-54 (2016).
- Schwartz, M. P., et al. A synthetic strategy for mimicking the extracellular matrix provides new insight about tumor cell migration. Integr Biol (Camb). 2, 32-40 (2010).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. Am J Respir Crit Care Med. 186, 866-876 (2012).
- Kalluri, R. Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nat Rev Cancer. 3, 422-433 (2003).
- Roudsari, L. C., Keffs, S. E., Witt, A. S., Gill, B. J., West, J. L. A 3D Poly(ethylene glycol)-based Tumor Angiogenesis Model to Study the Influence of Vascular Cells on Lung Tumor Cell Behavior. Scientific Reports. 6, 1-15 (2016).
- Bermudez, L. E., Sangari, F. J., Kolonoski, P., Petrofsky, M., Goodman, J. The efficiency of the translocation of Mycobacterium tuberculosis across a bilayer of epithelial and endothelial cells as a model of the alveolar wall is a consequence of transport within mononuclear phagocytes and invasion of alveolar epithelial cells. Infect Immun. 70, 140-146 (2002).
