ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
במחקר זה, אנו מציגים הליך קל ויעיל להערכת שיבוש מחסום הדם - מוח ניווניות בתנאים. כדי להשיג את המטרה שלנו, אנחנו חדורים משקל מולקולרי גבוה fluorescein isothiocyanate מתויג (FITC)-אלבומין לתוך וריד הצוואר העכבר הווריד וההערכה שלה דליפה לתוך parenchyma המוח על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.
Abstract
שיבוש שלמות מחסום הדם - מוח (BBB) היא תכונה נפוצה עבור נוירולוגיות ומחלות ניווניות שונות. למרות יחסי הגומלין בין הומאוסטזיס BBB מודאג בפתוגנזה של הפרעות מוח צריך חקירה נוספת, פיתוח, אימות של שגרה אמין במדויק לזהות שינויים BBB עשוי להיות מכריע ומייצגים כלי שימושי פוטנציאל לחיזוי מחלות התקדמות, פיתוח ממוקד אסטרטגיות טיפוליות.
כאן, אנו מציגים את הליך קל ויעיל להערכת BBB דליפה לידי מצב ניווניות כאלה המתרחשים במודל של עכברים פרה של מחלת הנטינגטון, שבה פגמים החדירות של BBB הם בבירור לזיהוי precociously ב המחלה. באופן ספציפי, משקל מולקולרי גבוה fluorescein isothiocyanate מתויג (FITC)-אלבומין, אשר מסוגל לעבור BBB רק כאשר האחרון הוא לקוי, הוא בחריפות מוחדר לתוך וריד הצוואר העכבר והפצתם המחוזות לכלי הדם או parenchymal לאחר מכן נקבע על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.
הצטברות של פלורסנט-אלבומין ירוק ב- parenchyma המוח מתפקד בתור אינדקס של חדירות BBB סוטה ו, כאשר quantitated באמצעות תוכנת עיבוד תמונה J, המדווח עוצמת קרינה פלואורסצנטית ירוק.
Introduction
הומאוסטזיס בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא תנאי מוקדם תקשורת מתאימה והתפקוד של תאים עצביים. CNS parenchyma בחוזקה סגור מהפריפריה מאת אנדותל מחסום הדם - מוח (BBB), אשר מייצג את הממשק בין מחזור הדם ההיקפיים המוח ממלא תפקיד מרכזי ב- cross-השיחה בין ברבעים אלה שני1 ,2. BBB היא מורכבת, דינמי המבנה התלת-ממדי מורכב בעיקר כלי מיקרו אנדותל תאים מיוחדים (ECs) קשורות זו לזו דרך מכלולי המערכת מהחיבור - צמתי צר (TJs) - והיא מוקפת pericytes, תא עצב סופים, אסטרוציט רגל תהליכים1,2.
בתנאים פיזיולוגיים, החדירות נמוך ביותר של BBB שלם מבטיחה ברגולציה קפדנית של הובלת חומרים מזינים ומולקולות אחרות החוצה את המוח, ומספק מערכת העצבים ייחודי להגנה מפני שינויים המתרחשים הרכב הדם אשר עשויים להשפיע על פעילות עצבית ונגד פוטנציאל היקפיים מעליב1,2,3.
שיבוש שלה חדירות משופרת של BBB תקינות יש כבר זמן רב ידוע מהווה תכונה מרכזית עבור רבים נוירולוגי ו4 כולל מחלת הנטינגטון (HD)5,6, אולם הפרעות ניווניות , אם תפקוד לקוי שכזה היא תופעה סיבתי או אירוע propagative במהלך המחלה עדיין לא ברור. העיתוי של BBB התמוטטות גם שרידים חמקמק, עם זאת, ראיות על ידי הקבוצה שלנו ואחרים המתעוררים מציין כי שלמות BBB שיבשו אינו מייצג מאוחר אירוע התקדמות המחלה, אבל מעדיף שלב מוקדם6,7 , 8, אשר עשויות להיות השלכות לטווח ארוך.
עם זאת, חשוב לחשוף התמוטטות BBB הקשורים ניוון מוחיים precociously כדי לפתח אסטרטגיות שימושית כדי לחזות את התקדמות המחלה, נזק מוחי או לפתח התערבויות אלטרנטיביות וממוקדות יותר מסוגל בהצלחה מקלים את ההשלכות כגון הפרעה קלינית. הדמיה אמין של BBB ליקוי הוא, לכן, חשיבות רבה במחקר ניסיוני והן ניהול קלינית של מחלות המוח.
בנייר זה, אנו מתארים הליך מוצלח ופשוט על ההערכה של BBB חדירות במודל של עכברים HD באמצעות את משקל מולקולרי גבוה fluorescein isothiocyanate מתויג-אלבומין (FITC-אלבומין). Extravasation של FITC-אלבומין, אשר בדרך כלל לא יכול לחצות את המחסום, אל parenchyma המוח נמדדה כמו אינדקס של BBB דליפה. טכניקה זו ניתנת להתאמה בקלות חולדות, מצבים פתולוגיים אחרים מאופיין cerebrovasculature ליקוי9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי IRCCS Neuromed חיה אכפת לי ועדת הבדיקה, על-ידי " Istituto סופריורה די Sanità " (היתר מספר: 1163/2015-PR) היו בהתאם לקווים המנחים של האיחוד האירופי דירקטיבה 2010 / 63/האיחוד האירופי לניסויים בבעלי חיים-
1-הכנת FITC-אלבומין פתרון כדי להיות מוזרק לתוך עורק הצוואר
הערה: כל הניסויים היו הבקרה מבוצעת במקום מניפסט עכברים HD R6/2 (11 - בן שבועיים), בעידן ותואמים מין פראי-סוג (WT) הארנבונים מאותה.
- התמוססות FITC-אלבומין לפדר (ראה טבלה של חומרים) בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS) ב 10 mg/ml-
הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, זה צריך להיות מוכן טרי עבור כל תגובה labelling.
2. הכנת הציוד כדי להיות בשימוש במהלך הניתוח
- לפרוס מכשירי הניתוח בלוק בעבר (ראה טבלה של חומרים).
- לנקות את הספסל כירורגית באלכוהול (70% אתנול פתרון). להכין את האזור הכירורגי (45 ס"מ על 45 ס"מ) עם תלוי כירורגי סטרילי מגבות חד פעמיות, להגדיר את ההפעלה stereomicroscope.
3. הליך כירורגי עבור FITC-אלבומין עירוי לווריד הצוואר
- להקליט את העכבר משקל הגוף על הרדמה.
- Anesthetize עכבר עם זריקה בקרום הבטן (מקומות) של המינון המתאים של קטמין (100 מ ג/ק ג) - פתרון חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג).
- צג הרגעה בבעלי חיים על ידי הבוהן עדין קמצוץ לסגת רפלקס כפי שמתואר ב. Walantus et al. 11 , 12.
- הנח את העכבר anesthetized במצב פרקדן הפנים למעלה ולתקן את ארבע רגליים וזנב על עבודה, שעליו מונחים כירורגית עם דבק.
- אחרי העכבר הוא מאובטח, השליטה בקפידה לגלח את השוליים המתאימים כירורגי בצוואר עם מכונת גילוח חשמלית (ראה טבלה של חומרים) ולחטא אותו עם povidone יוד פתרון ו- 70% אתנול.
- יבש השטח החשוף מגולח עם ספוגיות כותנה-
- בעדינות למשוך את העור מגולח ולגרום 1.5 ס מ האורך זמן חתך, באמצעות אזמל, ב- midclavicular קו מתחיל באמצע הדרך על בית החזה ולהרחיב עד מתחת לצוואר.
- בקפידה למתוח ביניהם רקמת חיבור עם מלקחיים בהסתכלות מיקרוסקופית (5 X הגדלה) לחשוף את עורק הצוואר.
- להבטיח רווח מספקת מצד הימין, בצד השמאל של ומוחלף על כדי להקל על החדרת המחט 30½ G עבור העירוי של הפתרון FITC-אלבומין.
- להזריק לווריד החיה (נכון ולפגוע) לאט לאט (יותר מ- 3 דקות) עם 100 µL של 10 מ"ל/ק"ג FITC-אלבומין באמצעות המחט 30½ G.
- אחרי 15 דקות, המתת חסד העכבר ע י עריפת ראשו במהירות להסיר במוח הגולגולת כפי שתואר לעיל 13, לטבול אותו למשך 15 דקות לפחות 10 x הנפח של המוח עצמו של איזופנטאן טרום מקורר.
- להזיז את איזופנטאן קפוא המוח לתוך צינור צוננת מראש ולאחסן אותו בפריזר-80 ° C עד חלוקתה היסטולוגית.
4. היסטולוגית חלוקתה של המוח רווי FITC-אלבומין
- Embed קפוא המוח בטמפרטורה האופטימלית חיתוך (אוקטובר) במתחם קודם (ראה טבלה של חומרים) חלוקתה cryostat.
- באופן סדרתי לחתוך את המוח למקטעים 20 מיקרומטר עבה, עם cryostat (ראה טבלה של חומרים), והר אותם על גבי שקופיות זכוכית מיקרוסקופ.
- לבצע FITC-אלבומין/laminin משותפת ההכתמה על-ידי שימוש ספציפי של נוגדן anti-laminin כאמור (ראה טבלה של חומרים) תיאר 6.
- בקצרה, דגירה מקטעים עם ראשי נוגדן האנטי-laminin (pAb 1:1000) במשך הלילה ולהמשיך עם נוגדן המשני המתאים מצומדת כדי Cy3.
- Coverslip שקופיות עם הרכבה בינונית המכיל 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) (שיא ספיגת = 360 ננומטר; פליטת שיא = 460 nm (ראה טבלה של חומרים).
- להשאיר את השקופית לילה יבש ב 4 ° C בחושך.
- להתבונן על קרינה פלואורסצנטית מכתים תחת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (ראה טבלה של חומרים) בהגדלה X 20 מצויד בשני FITC (שיא ספיגת = 495 ננומטר; פליטת שיא = 525 ננומטר) ומסננים Cy3 (שיא ספיגת = 550 ננומטר; פליטה שיא = 570 ננומטר).
- כדי להציג את הדגימות מיד לאחר ההכתמה, לאבטח את coverslip בפינות באמצעות לק ולבחון אותם תחת המיקרוסקופ כמו לעיל (4.3.3).
5. הגדרת את המיקרוסקופ פלורסצנטיות, רכישה של תמונות
- להגדיר את המיקרוסקופ פלורסצנטיות כדלקמן.
- הפעל המנורה פלורסצנטיות כ- 10 דקות לפני השימוש. הפעל את המיקרוסקופ, המחשב מחובר למצלמה דיגיטלית. להפעיל את תוכנת ניתוח התמונה (ראה טבלה של חומרים).
- המטרה המתאים לשימוש אופטימלי איתות אוסף והרזולוציה המרחבית, ובחר את המסננים המתאימים.
- רכישה של תמונות
- בחר בפקודה [חי] על תוכנת ניתוח התמונה (ראה טבלה של חומרים), הגדר את פרמטרי תאורה אופטימלית עבור כל מסנן.
- בחר בפקודה [להקפיא] לקחת את תמונת צבע של ערוץ אחד, להוסיף את סרגל קנה מידה (' לערוך > סולם לצרוב ')
- שמור כל תמונה ב- ' .tiff ' תבנית.
- למזג ערוצי תמונה בודדת על-ידי בחירה ' קובץ > מיזוג ערוץ ' ולשמור אותו ב
- tiff ' תבנית.
- ברכישת מינימום של ארבע 24 bit צבע תמונות (2200 מיקרומטר x 3400 מיקרומטר) לחתיכה המוח (6 סעיפים לכל שקופית).
6. הערכה של FITC-אלבומין Extravasation
- לנתח את עוצמת קרינה פלואורסצנטית לכל ערוץ יחיד באמצעות ה 14 , זמינה בחופשיות ImageJ 15-
- לנרמל את עוצמת אות ניאון הכולל FITC-אלבומין באינטנסיביות סה כ CY3-Laminin פלורסנט לכל כל תמונה ולדווח על אלבומין extravasated בחוץ בכלי הדם כמו עוצמת קרינה פלואורסצנטית ירוק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
העירוי הנכון של FITC-אלבומין לתוך בתוצאות ולפגוע extravasation של רכיב המעקב פלורסצנטיות ירוק מזרם הדם לתוך parenchymawhen מוח ש-BBB היא נפגעת6. בתנאים פיזיולוגיים, הפצה של אלבומין פלורסנט חדורים הוא מוגבל הפנימי של כלי הדם במוח והוא אין קליטה שמסביב perivascular באזור ו/או המוח parenchyma לזיהוי (איור 1A, micrographs- למעלה). לעומת זאת, כאשר BBB זה נפגע בנסיבות נוירו-פתולוגיים, FITC-אלבומין מציג תבנית פלורסצנטיות מפוזר לאורך perivascular רווחים, ב- parenchyma המוח (איור 1A, micrographs על החלק התחתון). צביעת שיתוף עם הסמן וסקולרית, laminin, משמש למקם בבירור FITC-אלבומין מקום ההצטברות (איור 1 א'). עוצמת קרינה פלואורסצנטית ירוק מוגברת הנפלטת FITC-אלבומין ב BBB פרוץ הוערך על-ידי שימוש בתוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלה של חומרים) ודיווח כמו עוצמת קרינה פלואורסצנטית ירוק (N = 3; 0.3112 לעומת 0.5765; * * *, p = 0.0004, אינטראקצית T-test) (איור 1B). FITC-אלבומין בעוצמה היה מנורמל כפי שדווח לעיל.
איור 1: extravasation FITC-אלבומין כסמן של BBB נזק. (א) micrographs זריחה נציג של המוח cryosections מציג חלוקה דיפרנציאלית של אלבומין ניאון ירוק תחת הן פיזיולוגיות (למעלה) ומצבים פתולוגיים (למטה). צביעת אדום מייצג את laminin סמן כלי הדם. פעמים חשיפה: דאפי 20 ms, FITC 500 ms, גב' Tx אדום 60 סולם בר = 100 מיקרומטר (מונוגרפיה מיזוג). (B) הגרף הזה מציג כימות של ירוק ידי קרינה פלואורסצנטית הנפלטת FITC-אלבומין, על-פי דיווחים כמו עוצמת קרינה פלואורסצנטית ירוק (ראה שלב 6.2), פיזיולוגיים (BBB בריא) והן מצבים פתולוגיים (BBB פרוצים). N = 3. הנתונים מוצגים כפי מתכוון ± SD, * * * p = 0.0004 (אינטראקצית T-test). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נתאר כאן את הטכניקה שימושית בעיקר לגילוי BBB זליגת בתנאים מחלת מוח. תפקוד לקוי של BBB הוא צובר תשומת לב כמו תכונה נפוצה של הפרעות רגשיות ונוירולוגיות שונות4. בעבר השתמשנו בגישה זו כדי לתאר את בלבול מוקדם של BBB שלמות במודל של עכברים של מחלה נדירה ניווניות כמו HD6.
בשיטה זו לוקח היתרון היחסי הפשטות והיעילות של ההליך, אשר מספק תוצאות מדויקות ואמינות. זה מייצג כלי מחקר פרה רגישה מאוד, שימושי עבור המהירות ואת המיידיות שהוא מציע בהערכת איכותית BBB הפרעה על ידי הדמיה פשוטה של זריחה ירוק בתוך רקמת המוח המחולקת למקטעים. עם זאת, בשילוב עם ניתוח הביוכימי והמולקולרי, הטכניקה מוצלחת במתן מידע כמותי אודות שלמות מבנית ופונקציונליים של TJs אנדותל כלי הדם וההיתרים ניתוח של הקורלציה של BBB הפרעה עם המוח הומאוסטזיס.
למרות שזה לא יכול לספק לכם מידע אודות ultrastructure BBB, הפרוטוקול המתואר כאן עלולה לגרום בהליכים פחות יקר ודורש זמן לעומת שיטות אחרות כגון מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה16, 17. יתר על כן, בשל יישום קל שלה הפארמצבטית, ההליך עשוי להיות שימושי עבור ניטור נגעים מתקדמת של המוח להערכת המאפיינות מודלים קליניים של הפרעה ניווניות.
כוח גדול של הערכת BBB הפרעה על ידי בגישה מבוססת על-ידי קרינה פלואורסצנטית טמון הפוטנציאל לחקור את התפקיד של שינויים עדינים בתפקוד BBB במשותף, הפרעות נוירולוגיות נדירות ובסופו של דבר כדי לבדוק ישירות בזמן אמת את השפעת סמים המשפיעים על BBB או מולקולות אנדוגני בעת החלתם של תא דם או המוח. למרות הנוהל עדיין שאי אפשר לתרגם לבני אדם, יש לו פוטנציאל לספק אינדיקציות לפיתוח של המשדרים המוח חדשות שישמש הקלינית בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף
Acknowledgments
העבודה הזאת הייתה הנתמך על-ידי "דל'אנג'לו Neuromed", במימון משרד הבריאות "החיפוש אחר Corrente" כדי V.M. איטלקית
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
| iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health & Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
| Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medical patch | Medicalis | 34788 | |
| Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
| Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
| Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
| Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
References
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M.
- Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A.
- Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40 (2015).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V.
- Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington's disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
- Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316 (2017).
- Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
- van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615 (2017).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
- Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
- Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).
- Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F.
Tags
מדעי המוח גיליון 129 מחסום הדם - מוח (BBB) BBB פרמאביליות FITC-אלבומין הקשורים ניוון מוחיים הזרקה תוך ורידי דגם העכברErratum
Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione
