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Summary
Dans cette étude, nous présentons une procédure simple et efficace pour l’évaluation de la rupture de la barrière hémato - encéphalique au titre de maladies neurodégénératives. Pour atteindre notre objectif, nous avons infusé de haut poids moléculaire isothiocyanate de fluorescéine étiqueté (FITC)-albumine dans la jugulaire de souris de la veine et évalué sa fuite dans le parenchyme du cerveau par microscopie à fluorescence.
Abstract
Perturbation de l’intégrité de la barrière hémato - encéphalique (BHE) est une caractéristique commune de différentes maladies neurologiques et neurodégénératives. Bien que l’interaction entre perturbée BBB homéostasie et la pathogenèse des maladies du cerveau a besoin d’une enquête plus approfondie, le développement et la validation d’une procédure fiable pour détecter avec précision les modifications BBB peuvent être crucial et représentent un outil utile pour prédire la maladie potentiellement la progression et le développement ciblé des stratégies thérapeutiques.
Nous présentons ici une procédure simple et efficace d’évaluation de fuite BBB dans une affection neurodégénérative comme ça qui se produisent dans un modèle murin préclinique de la maladie de Huntington, dans lesquels tout défaut de la perméabilité du BBB est clairement décelable précocement dans la maladie. Plus précisément, le poids moléculaire élevé l’isothiocyanate de fluorescéine étiqueté (FITC)-albumine, qui est capable de traverser la BHE uniquement lorsque ce dernier est altérée, est parfaitement infusée dans une veine jugulaire de souris et de sa distribution dans les districts de vasculaires ou parenchymateuses est alors déterminé par microscopie à fluorescence.
Accumulation du vert fluorescent-albumine dans le parenchyme du cerveau fonctionne comme un indice de perméabilité BBB aberrant et, lorsque quantifiée à l’aide de logiciels de traitement d’Image J, est signalée comme l’intensité de Fluorescence verte.
Introduction
L’homéostasie dans le système nerveux central (CNS) est une condition sine qua non pour la bonne communication et la fonction des cellules neuronales. Le parenchyme de la CNS est hermétiquement bouclé de la périphérie de l’endothéliale – barrière hémato encéphalique (BHE), qui représente l’interface entre le cerveau et le sang périphérique et joue un rôle essentiel dans la diaphonie entre ces deux districts1 ,2. La BHE est un complexe et dynamique structure tridimensionnelle composée principalement de spécialisées micro-navire cellules endothéliales (CE) reliés entre eux par l’intermédiaire de complexes de jonction intercellulaires - jonctions serrées (TJs) - et entouré de péricytes, neurone terminaisons et astrocyte pied processus1,2.
Dans des conditions physiologiques, la très faible perméabilité de la BHE intacte assure le strict règlement du transport des nutriments et autres molécules dans et hors du cerveau et fournit le système nerveux central avec une protection unique contre les changements qui se produisent dans la composition du sang susceptibles d’influencer l’activité neurale et contre potentiel périphérique insulte1,2,3.
Perturbation de l’intégrité BBB et sa perméabilité améliorée sait depuis longtemps pour constituer un élément clé pour beaucoup neurologiques et neurodégénératives troubles4 , y compris la maladie de Huntington (MH)5,6, toutefois , si un tel dysfonctionnement est un phénomène causal ou un événement de propagation au cours de la maladie est encore peu clair. Le moment de la rupture BBB aussi reste insaisissable, cependant, des preuves de notre groupe et autres nouvelles indique que perturbé BBB intégrité ne représente pas un événement tardif dans la progression de la maladie, mais plutôt une étape précoce6,7 , 8, qui peut avoir des conséquences à long terme.
Dans cette optique, il est important de révéler précocement rupture de BBB neurodégénérescence afin d’élaborer des stratégies utiles pour prédire la progression de la maladie et des lésions cérébrales et de développer des interventions alternatives et plus ciblées capables d’avec succès atténuer les conséquences cliniques de cette perturbation. L’imagerie fiable de déficience de BBB est donc d’une importance majeure dans la recherche expérimentale et prise en charge clinique des maladies du cerveau.
Dans cet article, nous décrivons une procédure simple et efficace pour l’évaluation de la perméabilité BBB dans un modèle murin de HD à l’aide de la masse moléculaire élevée fluorescéine isothiocyanate-albumine marquée (FITC-albumine). Extravasation de FITC-albumine, qui normalement ne peut pas traverser la barrière, dans le parenchyme du cerveau a été mesurée comme indice de fuite BBB. Cette technique est facilement adaptable à des rats et d’autres pathologies caractérisées par cerebrovasculature déficience9,10.
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Protocol
toutes les procédures sur les animaux ont été approuvées par le Conseil d’examen du soin de Animal IRCCS Neuromed et " Istituto Superiore di Sanità " (numéro de permis : 1163/2015-PR) et étaient conformes aux lignes directrices de l’Union européenne Directive 2010 / 63/EU pour l’expérimentation animale.
1. préparation de la Solution FITC-albumine pour être injecté dans la veine jugulaire
Remarque : toutes les expériences ont été contrôle réalisé dans manifeste (11 - semaine vieux) HD R6/2 souris et en âge et sexe assortie sauvage (WT) littermates.
- Dissoudre FITC-albumine poudre (voir la Table des matières) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 10 mg/ml.
Remarque : Pour des résultats optimaux, cela doit être préparée fraîche pour chaque réaction étiquetage.
2. Préparation de l’équipement à être utilisé pendant l’intervention
- énoncent les instruments chirurgicaux préalablement stérilisés à l’autoclave (voir Table des matières).
- Nettoyer le banc chirurgical avec de l’alcool (70 % de solution d’éthanol). Préparer la zone chirurgicale (45 x 45 cm) avec un drap serviette jetable stérile chirurgicale et mis en place le fonctionnement stéréomicroscope.
3. Une intervention chirurgicale pour perfusion FITC-albumine dans la veine jugulaire
- enregistrer le poids de la souris pour l’anesthésie.
- Souris anesthésier avec une injection intrapéritonéale (i.p) d’une dose appropriée de la kétamine (100 mg/kg) - solution de xylazine (10 mg/kg).
- Moniteur animale sédation par pinch doux orteil retirer réflexe, comme l’a démontré en Walantus et al. 11 , 12.
- Placer la souris anesthésiée en position couchée face vers le haut et fixer les quatre pattes et la queue sur le workbench chirurgical avec du ruban adhésif.
- Après que la souris est sécurisée, soigneusement raser la marge chirurgicale appropriée sur le cou avec un rasoir électrique (voir Table des matières) et les désinfecter avec de l’éthanol 70 % et de solution de povidone-iode.
- Sécher la surface exposée rasée avec des cotons-tiges.
- Doucement tirer la peau rasée et faire une incision longue longitudinale de 1,5 cm, par scalpel, dans la claviculaire ligne à mi-chemin sur le thorax et de son prolongement pour juste en dessous du cou.
- Soigneusement étirer dehors du tissu conjonctif avec une pince sous observation microscopique (grossissement de X 5) pour exposer la veine jugulaire externe.
- S’assurer un espace suffisant sur la droite et à gauche de la veine jugulaire pour faciliter l’insertion de l’aiguille de 30½ G pour l’infusion de la solution d’albumine-FITC.
- Injecter par voie intraveineuse de l’animal (à droite veine jugulaire) lentement (plus de 3 min) avec 100 µL de 10 mL/kg FITC-albumine à l’aide de l’aiguille 30½ G.
- Après 15 minutes, euthanasier la souris par décapitation, rapidement enlever le cerveau du crâne comme décrit précédemment 13 et plongez-le pendant 15 min dans au moins 10 x le volume du cerveau lui-même de l’isopentane préalablement refroidi.
- Déplacer l’isopentane congelés cerveau dans un tube préalablement réfrigéré et la stocker dans un congélateur à-80 ° C jusqu'à coupes histologiques.
4. Histologiques de sectionnement du cerveau imprégné FITC-albumine
- Embed congelés cerveau en température de coupe optimale (OCT) composé (voir Table des matières) avant la découpe du cryostat.
- En série couper le cerveau en coupes épaisses de 20 µm, avec un cryostat (voir Table des matières) et les monter sur lames de microscope vitre.
- Effectuer la FITC-albumine/laminin coloration conjointement l’aide spécifique à un anticorps anti-laminine (voir Table des matières) comme décrit plus haut 6.
- Brièvement, incuber les sections avec l’anticorps primaire anti-laminine (1/1000 de la pAb) pendant la nuit et aller de l’avant avec l’anticorps secondaire approprié conjugué à Cy3.
- Lamelle glisse avec support de montage contenant 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (pic d’absorption = 360 nm, le pic d’émission = 460 nm (voir Table des matières).
- Laisser la lame sécher pendant la nuit à 4 ° C dans l’obscurité.
- Observer la fluorescence coloration sous un microscope à fluorescence (voir Table des matières) à un grossissement de X 20, équipée de deux FITC (pic d’absorption = 495 nm, le pic d’émission = 525 nm) et les filtres de Cy3 (pic d’absorption = 550 nm ; émission PIC = 570 nm).
- Pour visionner les exemples immédiatement après la coloration, fixer la lamelle dans les coins à l’aide de vernis à ongles et les examiner au microscope comme ci-dessus (4.3.3).
5. Réglage vers le haut le Microscope à Fluorescence et Acquisition d’Images en couleur
- mis en place le microscope de fluorescence ainsi.
- Allumez la lampe à fluorescence environ 10 minutes avant utilisation. Allumez l’appareil photo numérique, l’ordinateur connecté et le microscope. Exécutez le logiciel d’analyse de l’image (voir la Table des matières).
- Utiliser l’objectif approprié pour la collecte de signal optimale et une résolution spatiale et sélectionnez les filtres appropriés.
- Acquisition d’Images en couleur
- , sélectionnez la commande [en direct] sur le logiciel d’analyse de l’image (voir la Table des matières) et définir les paramètres d’éclairage optimal pour chaque filtre.
- Sélectionner la commande [freeze] pour prendre l’image en couleurs monocanal et la barre d’échelle (' Edit > Burn échelle ')
- Enregistrer chaque image en la ' .tiff ' format.
- Fusion de chaînes en une seule image en sélectionnant ' fichier > fusion canal ' et enregistrez-le dans le
- tiff ' format.
- Acquérir un minimum de vingt quatre bits couleur pictures (2200 µm x 3400 µm) par tranche de cerveau (6 sections par diapo).
6. Évaluation de l’Extravasation FITC-albumine
- analyser l’intensité de fluorescence pour chaque canal unique en utilisant l’utilisier ImageJ 14 , 15.
- Normaliser l’intensité totale des signaux fluorescents de la FITC-albumine par l’intensité de fluorescence CY3-laminine totale par chaque image et de faire rapport à l’albumine épanchements dehors les navires comme l’intensité de Fluorescence vert.
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Representative Results
Bonne infusion de FITC-albumine dans les résultats de la veine jugulaire dans l’extravasation du traceur fluorescence verte de la circulation sanguine dans le cerveau de parenchymawhen que la BHE est compromise6. Dans des conditions physiologiques, distribution d’albumine fluorescent infusée est restreinte à l’intérieur des vaisseaux du cerveau et aucun signal dans le parenchyme de domaine et/ou cerveau périvasculaires environnant n’est détectable (Figure 1 a, les micrographies sur le retour en haut). À l’inverse, lorsque la BHE est compromise en cas de neuro-pathologiques, FITC-albumine illustre un modèle de fluorescence diffuse le long des espaces périvasculaires et dans le parenchyme du cerveau (Figure 1 a, les micrographies sur le fond). La coloration conjointement avec le marqueur vasculaire, laminine, sert à localiser clairement site d’accumulation FITC-albumine (Figure 1 a). Intensité de la fluorescence verte accru émise par FITC-albumine en compromis BBB a été évaluée à l’aide d’une logiciel de traitement d’image (voir la Table des matières) et signalée comme étant l’intensité de Fluorescence verte (N = 3 ; 0.3112 vs 0.5765 ; ***, p = 0,0004, Non appariée T-test) (Figure 1 b). Intensité de FITC-albumine a été normalisée comme indiqué ci-dessus.
Figure 1 : extravasation FITC-albumine comme un marqueur de dégâts BBB. (A) les micrographies de fluorescence représentatif des cryosections cerveau montrant la distribution différentielle de l’albumine vert fluorescent sous les deux physiologique (en haut) et pathologiques (en bas). Coloration rouge représente la laminine marqueur vasculaire. Temps d’exposition : DAPI 20 ms, FITC 500 ms, Mme Tx rouge 60 échelle bar = 100 µm (monographie de fusion). (B) Ce graphique affiche la quantification de la fluorescence verte émise par FITC-albumine, qui est signalée comme l’intensité de Fluorescence verte (voir étape 6.2), physiologique (BBB sain) et pathologiques (compromis BBB). N = 3. Données sont représentées comme moyenne ± écart-type, *** p = 0,0004 (non apparié T-test). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La technique que nous décrivons ici est principalement utile pour détecter les fuites BBB dans des conditions de maladie cérébrale. Dysfonctionnement BBB gagne l’attention comme une caractéristique commune des divers troubles neurologiques4. Précédemment, nous avons utilisé cette approche pour décrire le dérangement au début de l’intégrité de la BBB dans un modèle murin d’une maladie neurodégénérative rare comme HD6.
Cette méthode tire parti de la relative simplicité et efficacité de la procédure, qui fournit des résultats précis et fiables. Il représente un outil de recherche préclinique très sensible et est utile pour la vitesse et l’immédiateté, qu'il offre pour évaluer qualitativement perturbation BBB par simple visualisation de fluorescence verte dans les tissus cérébraux sectionnés. Toutefois, lorsqu’il est combiné avec l’analyse biochimique et moléculaire, la technique est de proposer une information quantitative sur l’intégrité structurelle et fonctionnelle des TJs endothéliales vasculaires et permet l’analyse de la corrélation de BBB rupture avec l’homéostasie du cerveau.
Bien qu’elle ne peut fournir aucune information sur l’ultrastructure BBB, le protocole décrit ici peut entraîner des procédures moins coûteux et plus exigeante en temps, en comparaison avec d’autres méthodes telles que la microscopie électronique de haute résolution16, 17. en outre, en raison de sa facilité d’application et de la reproductibilité, la procédure peut être utile pour la surveillance des lésions progressives du système vasculaire cérébrale qui caractérisent les modèles précliniques de troubles neurodégénératifs.
Une grande force d’évaluer les perturbations BBB par une approche axée sur la fluorescence réside dans le potentiel d’enquêter sur le rôle des changements subtils dans la fonction BBB en commun et des troubles neurologiques rares et, finalement, pour tester directement en temps réel l’effet de BBB-influence des drogues ou des molécules endogènes lorsqu’elle est appliquée depuis le compartiment sanguin ou du cerveau. Bien que la procédure ne peut pas encore être traduite pour les humains, il a le potentiel de fournir des indications pour le développement de nouveaux marqueurs de cerveau pour être utilisée en pratique clinique dans le futur.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la « Fondazione Neuromed » et financé par le ministère italien de la santé « Ricerca Corrente » de V.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
| iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health & Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
| Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medical patch | Medicalis | 34788 | |
| Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
| Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
| Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
| Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
References
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Tags
Neurosciences numéro 129 barrière hémato - encéphalique (BHE) perméabilité BBB FITC-albumine neurodégénérescence injection intraveineuse modèle murinErratum
Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione
