Summary
אנו מתארים פלטפורמת השבבים מבוססי לעיבוד תלת ממדי של תאים מיקרו bioreactors. אחת שבב יכול בית עד 10 Mio. תאים שיכולים להיות מעובדים בתנאים מוגדרים במדויק לגבי זרימת נוזלים, מתח וכו 'חמצן בלולאה, סטרילי במחזור סגור.
Abstract
פיתחנו שבב המבוסס על התרבות תאים של מערכת לעיבוד תלת ממדי של תאים. שבב מיוצר בדרך כלל מתוך אי - פולימרים מתכלים, למשל, פוליקרבונט או methacrylate polymethyl על ידי הזרקה מיקרו, הבלטות חם מיקרו או מיקרו Thermoforming. אבל, זה גם יכול להיות מיוצר מ - פולימרים ביו מתכלה. מימדים הכולל שלו הם 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 מ"מ (hxwxl). התכונות העיקריות של שבבים המשמשים הם או רשת של עד 1156 סמ"ק מיקרו מכולות (CF-chip) כל אחת בגודל של 120-300 x 300 x 300 μ (hxwxl) או גומחות עגול עם קוטר של 300 μ ועומק של μ 300 (r-chip). הפיגום יכול בית 10 Mio. תאים בתצורת תלת מימדי. עבור מזין אופטימלי אספקת גז, השבב מוכנס דיור bioreactor. Bioreactor הוא חלק לולאה סגורה מחזור steril כי בתצורה הפשוטה ביותר, מורכבת additionaly של משאבת הרים מאגר בינוני עם אספקת גז. Bioreactor ניתן להריץ זלוף, superfusion, או אפילו מצב הפעולה מעורבת. יש לנו מעובדות בהצלחה שורות תאים, כמו גם תאים ראשוניים על פני תקופות של מספר שבועות. עבור תאים עכברוש ראשוני בכבד יכולנו להראות שימור של פונקציות organotypic במשך יותר מ 2 שבועות. עבור קרצינומה קווי hepatocellular תא יכולנו להראות את אינדוקציה של גנים ספציפיים לא כבד או לידי ביטוי רק מעט בתרבות monolayer סטנדרטי. המערכת עשויה להיות שימושית גם כאשר תא גזע טיפוח מערכת מאז הניסויים בידול הראשון עם קווי בתאי גזע היו מבטיחות.
Protocol
מאמר זה מתאר את השימוש של פלטפורמת השבבים מבוססי (איור 1) לעיבוד תלת מימדי של שורות תאים, כמו גם תאים ראשוניים. מאז תאים רבים לעשות פונקציות organotypic לבטא רק בסביבה-3D, פיתחנו שבב פולימר המספק פיגום אשר התאים יכולים לדבוק בכל הכיוונים במרחב, וזה יכול להיות מותקן בתוך דיור bioreactor לשליטה על זרימת הנוזל מתח חמצן וכו 'בהתאם לעיצוב ניסיוני, פני השטח של פולימר ניתן לשנות על ידי טכניקות שונות, למשל, UV-קרינה, PECVD, γ-השתלת או כימיה רטובה קונבנציונאלי.
איור 01
1. De-אוורור ו hydrophilisation של השבב
לפני השימוש, השבב חייב להיות deaerated ו hydrophilized. לשם כך, סדרה אלכוהול מתבצעת. פתרונות Isopropanol בהיקף של 100%, 70%, 50%, 30% isopropanol במים DMPC שטופלו מוכנים ואת השבב הוא טבול ריכוז כל אחד, עם תחילת הפתרון 100%, עד ל -30. השלב האחרון של הסדרה מורכבת pyrocarbonate דימתיל טהור (DMPC) שטופלו מים. מנקודה זו ואילך, חשוב לשמור על שבב הרטוב.
2. קולגן אני ציפוי
לאחר סדרת אלכוהול, השבב מצופה בדרך כלל עם פתרון קולגן אני מזנב החולדה. מתוך הפתרון קולגן המניות של 2 מ"ג / מ"ל חומצה אצטית 0.2% aliquot המתאים חלבון הקולגן 30 מיקרוגרם הוא מדולל במים DMPC שטופלו לנפח סופי של μl 150. התוצאה היא ציפוי קולגן משטח השבב עם צפיפות של 10 מיקרוגרם קולגן אני לכל שטח פני 2 ס"מ.
3. הרכבה של תאים קרצינומה hepatocellular
קרצינומה של תאים Hepatocellular קו הפ G2 הם trypsinized וספר. עבור לטווח קצר ניסויים (1 עד 6 ימים) 5 * 10 6 תאים מחוסן בשבב כל המקביל 6 ס"מ בקרת רקמת תרבות בצלחות פטרי. כדי inoculte, השבב 5 * 10 6 תאים resuspended בינוני 150 μl תרבות והניח על גבי האזור microstructured של השבב (איור 2). לאחר מכן, היא ממוקמת באינקובטור במשך 2-3 שעות. במהלך תקופה זו הדגירה תאים המשקע לתוך מיקרו מכולות לדבוק הקולגן אני מצופה הפיגום.
איור 2
4. החדרת שבב לתוך הדיור bioreactor
לאחר תקופת הדגירה, השבב הוסר מן החממה רכוב הדיור bioreactor. לשם כך, תחת הספסל נקי, bioreactor preassembled יוסר אריזה סטרילית מפורקים במידה המאפשרת החדרה של השבב. השבב הוא טיפל בזהירות עם מלקחיים סטרילית להציב לתוך החריץ המכיל את אטם אשר חותמות שבב שתוצאתה הדור תא עליון ותחתון ב bioreactor. ואז, bioreactor הוא כינס שוב הועבר האינקובטור שבו הוא מחובר למשאבה, את אספקת הגז אנלייזר חמצן.
5. מילוי של המערכת
ברגע bioreactor מחובר המאגר בינוני, משאבת גז אספקת הדם לולאה סגורה מלא בינוני. הדבר נעשה על ידי הצבת 3-way-מחברים בצורה כזו כי superfusion, אשר מוגדר זרימת בינוני מעל השבב, מושגת. זה מוביל לשחרור אוויר סגורה מהמחזור bioreactor מבלי להסיר את התאים מן הפיגום. לאחר מערכת מלא לחלוטין עם בינוני, 3-way-מחברים מוחלפות באופן כזה כי זלוף, אשר מוגדר הזרימה מלמטה השבב דרך רקמות, מושגת. בתצורת זלוף זרימת מותאם לצרכים של התא אשר עבור hepatocytes בדרך כלל נע בין 6-50 μl / min.
6. דגימה
במהלך הניסוי דגימות בינוני ניתן להסיק. לשם כך, מזרקים מחוברים ליציאות סטרילי על גבי המאגר בינוני. לאחר הדגימה, היציאות הן מעוקרות עם isopropanol 70%.
7. בידוד של תאים שלמים מן שבב ליישומים הזרם
בסוף הניסוי, bioreactors מנותקים מאספקת הגז המשאבה הרים, הועבר הספסל נקי מפורקים כמתואר לעיל. בעזרת מלקחיים סטריליות השבב יוסר הדיור bioreactor, הניחלתוך צלחת פטרי 3.5 ס"מ ושטף עם PBS. לאחר מכן, השבב הוא מודגרות עם טריפסין / EDTA (0.25% / 0.53mM) במשך 5-15 דקות באינקובטור כדי לנתק את התאים מאזור microstructured. ההשעיה התא שנאסף centrifuged 5 דקות ב 600 גרם התאים יכולים לשמש ליישומים הזרם המקובל, למשל, או בידוד מוחלט רנ"א וחלבונים. באופן שגרתי, אנו לבודד RNA הכולל (פריז ערכה, Ambion Inc, אוסטין, טקסס, ארה"ב) עבור ניתוח microarray בזמן אמת RT-PCR. ביטוי חלבון מנותח לאחר מכתים immunohistochemical של תאים בתוך השבב עם מיקרוסקופ סריקת לייזר, אבל יכול גם להיות מנותח אחרת, למשל, על ידי cytometry הזרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פיתחנו פלטפורמת השבבים מבוססי לעיבוד תלת ממדי של תאים bioreactors מיקרו perfused פעיל. השבבים יכולים להיות מיוצרים מ בלתי מתכלה, כמו גם פולימרים מתכלים על ידי הזרקה מיקרו, הבלטה חמה, כמו גם טכניקות thermoforming מיקרו 3. בהתאם לעיצוב ניסיוני, פני השטח של פולימר ניתן לשנות על ידי קרינת UV-4. שורות תאים hepatocyte וכן hepatocytes עכברוש העיקרי מצליח לטפח במכשירים אלו יכולים להיות מוצגים על ידי ניתוח של ביטוי גנים מסוימים בכבד ספציפיים, כמו גם ניתוח של כמה חלבונים בכבד ספציפי 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ברצוננו להודות Mechthild Herschbach ואנקה Dech לקבלת סיוע טכני מעולה.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | Other | ATCC | HB-8065 | |
| Collagen I from rat tail | Reagent | Roche Group | 11 179 179 001 | |
| PARIS kit | Reagent | Ambion | AM1921 | |
| Syto16 | Reagent | Invitrogen | S7578 | |
| anti cytokeratin 18 | Antibody | Abcam | ab668 | Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/100 in PBS |
| Anti E-cadherin | Antibody | Abcam | ab1416 | Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/50 in PBS. |
| Goat anti-albumin | Reagent | Bethyl Laboratories | E80-129 | Primary Ab, goat anti-human Albumin, used 1/200 in PBS |
| Rabbit anti-mouse IgG1 | Antibody | Invitrogen | A11059 | Secondary Ab, Alexa Flour 488 conjugated, used 1/100 in PBS + 0.5 % BSA |
| Cy3 anti-goat IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 705-165-003 | Cy3 AffiniPure donkey a-goat IgG Ab, used 1/700 in PBS + 0.5% BSA |
References
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. J. Cell Biol. 53, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. 3. Enzymatic requirements for tissue dispersion. Exp. Cell Res. 82, 391-398 (1973).
- Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmueller, R., Weibezahn, K. F., Welle, A. 3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films. Biomed. Microdev. 8, 191-199 (2006).
- Welle, A., Gottwald, E. UV-based patterning of polymeric substrates for cell culture applications. Biomed. Microdev. 4, 33-41 (2002).
- Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmueller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. -F. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab Chip. 7, 777-785 (2007).
- Eschbach, E., Chatterjee, S. S., Noldner, M., Gottwald, E., Dertinger, H., Weibezahn, K. -F., Knedlitschek, G., G, Microstructured scaffolds for liver tissue with high density: Morphological and biochemical characterization of tissue aggregates. J. Cell. Biochem. 95, 243-255 (2005).
