Summary
Nous décrivons une plate-forme de puces à base pour la culture en trois dimensions des cellules de micro-bioréacteurs. Une puce peut accueillir jusqu'à 10 Mio. cellules qui peuvent être cultivées dans des conditions définies avec précision à l'égard de l'écoulement du fluide, etc pression d'oxygène dans une solution stérile, boucle de circulation fermée.
Abstract
Nous avons développé un système sur puce de culture de cellules pour la culture en trois dimensions des cellules. La puce est généralement fabriqué à partir de polymères non biodégradables, par exemple, le polycarbonate ou polyméthacrylate de méthyle par moulage par injection de micro, micro gaufrage à chaud ou thermoformage micro. Mais, il peut aussi être fabriqué à partir de polymères bio-dégradables. Ses dimensions globales sont 0,7 1 x 20 x 20 x 0,7 à 1 mm (hxlxL). Les principales caractéristiques des puces utilisées sont soit une grille allant jusqu'à 1156 micro-cubes conteneurs (cf-chip) de la taille d'120-300 x 300 x 300 μ (hxlxL) ou des niches rondes avec des diamètres de 300 μ et une profondeur de 300 μ (r-chip). L'échafaud peut accueillir 10 Mio. cellules dans une configuration en trois dimensions. Pour un nutriment optimale et la fourniture de gaz, la puce est insérée dans un boîtier bioréacteur. Le bioréacteur est partie d'une boucle de circulation steril fermé qui, dans la configuration la plus simple, est Additionaly constitué d'une pompe à rouleaux et d'un réservoir avec une moyenne d'alimentation en gaz. Le bioréacteur peut être exécuté en perfusion, surfusion, ou même un mode de fonctionnement mixte. Nous avons réussi à cultiver des lignées cellulaires ainsi que des cellules primaires sur des périodes de plusieurs semaines. Pour les cellules de foie de rat primaires nous avons pu montrer une préservation des fonctions organotypique pendant plus de 2 semaines. Pour les lignes de carcinome hépatocellulaire cellulaire nous avons pu montrer l'induction de gènes spécifiques du foie n'est pas ou peu exprimé en culture monocouche standard. Le système pourrait aussi être utile comme un système de culture de cellules souches depuis expériences première différenciation avec les lignées de cellules souches ont été prometteurs.
Protocol
Ce document décrit l'utilisation d'une plate-forme de puces à base (fig. 1) pour la culture en trois dimensions de lignées cellulaires ainsi que des cellules primaires. Depuis de nombreuses cellules expriment effectivement les fonctions organotypique que dans un environnement 3D, nous avons développé une puce polymère qui fournit un échafaudage pour lequel les cellules peuvent adhérer dans toutes les directions spatiales, et qui peut être monté dans un boîtier bioréacteur pour le contrôle de débit des fluides , etc tension d'oxygène Selon la conception expérimentale, la surface du polymère peut être modifié par des techniques différentes, par exemple, l'irradiation aux UV, PECVD, γ-greffe ou conventionnelles de chimie humide.
Figure 01
1. Désaération et hydrophilisation de la puce
Avant l'utilisation, la puce doit être dégazée et hydrophilisée. Pour ce faire, une série d'alcool est effectuée. Solutions Isopropanol composé de 100%, 70%, 50%, 30% d'isopropanol dans de l'eau traitée DMPC sont préparés et la puce est plongée dans chaque concentration, à commencer par la solution 100%, pour un maximum de 30 ans. L'étape finale de la série se compose de pyrocarbonate de diméthyle pur (DMPC) de l'eau traitée. A partir de ce moment, il est important de garder la puce humide.
2. Collagène I revêtement
Après la série d'alcool, la puce est généralement recouvert d'une solution de collagène I de queue de rat. De la solution stock de collagène de 2 mg / ml dans l'acide acétique à 0,2% d'une aliquote correspondant à 30 mg de protéines de collagène est dilué avec de l'eau traitée DMPC à un volume final de 150 pl. Il en résulte un revêtement de collagène de la surface de la puce avec une densité de 10 mg de collagène I par zone cm de surface 2.
3. Ensemencement des cellules de carcinome hépatocellulaire
Cellules de carcinome hépatocellulaire de la ligne Hep G2 sont trypsinisées et comptées. Pour expérimentations à court terme (1 à 6 jours) 5 * 10 6 cellules sont ensemencées dans chaque puce et la commande correspondante de 6 cm de culture tissulaire des boîtes de Pétri. Pour inoculte, la puce 5 * 10 6 cellules sont resuspendues dans 150 ul milieu de culture et placé sur le dessus de la zone microstructurée de la puce (fig. 2). Ensuite, il est placé dans un incubateur pendant 2-3 heures. Pendant cette période d'incubation des cellules de sédiments dans les conteneurs des micro-et adhèrent au collagène I-revêtement échafaud.
Figure 2
4. Insertion de la puce dans le boîtier du bioréacteur
Après la période d'incubation, la puce est retirée de l'incubateur et monté dans le boîtier bioréacteur. Pour cela, sous le banc propre, le bioréacteur préassemblées est retiré de l'emballage stérile et démonté à un degré qui permet l'insertion de la puce. La puce est soigneusement manipulés avec une pince stérile et placé dans la rainure qui contient le joint qui scelle la puce et qui aboutit à la génération d'un compartiment supérieur et inférieur dans le bioréacteur. Ensuite, le bioréacteur est assemblé à nouveau et transféré à l'incubateur où il est relié à la pompe, l'approvisionnement en gaz et l'analyseur d'oxygène.
5. Remplissage du système
Dès que le bioréacteur est reliée au réservoir moyenne, une pompe et d'alimentation en gaz de la boucle de circulation fermée est remplie de milieu. Ceci est fait en positionnant le 3-way-connecteurs de telle manière que les surfusion, qui est défini comme le flux de milieu sur le dessus de la puce, est atteint. Cela conduit à une décharge d'air enfermé dans la circulation bioréacteur sans enlever les cellules de l'échafaud. Après que le système est complètement remplie de milieu, le 3-way-connecteurs sont mis dans une telle façon que la perfusion, qui est défini comme le flux d'en bas la puce à travers le tissu, est atteint. Dans la configuration du flux de perfusion est ajustée aux besoins de la cellule où des hépatocytes varie généralement de 60 à 500 l / min.
6. Échantillonnage
Pendant l'expérience moyenne des échantillons peuvent être tirées. Pour cela, les seringues sont connectés aux ports stériles sur le dessus du réservoir à moyen terme. Après l'échantillonnage, les ports sont stérilisés à l'isopropanol à 70%.
7. Isolement des cellules intactes de la puce pour les applications en aval
A la fin de l'expérience, les bioréacteurs sont déconnectés de l'alimentation en gaz et la pompe à rouleaux, transféré à la hotte et démonté comme décrit précédemment. Avec une pince stérile la puce est retirée du logement bioréacteur, placédans un plat de 3,5 cm de Pétri et rincées avec du PBS. Ensuite, la puce est incubée avec la trypsine / EDTA (0,25% / 0,53 mm) pendant 5-15 minutes dans un incubateur pour détacher les cellules de la zone microstructurée. La suspension cellulaire recueilli est centrifugé pendant 5 min à 600 g. Les cellules peuvent ensuite être utilisés pour des applications conventionnelles en aval, par exemple, l'ARN total ou l'isolement des protéines. Régulièrement, nous isoler l'ARN total (PARIS kit, Ambion Inc, Austin, Texas, USA) pour l'analyse des microréseaux et en temps réel RT-PCR. L'expression protéique est analysé après coloration immunohistochimique des cellules à l'intérieur de la puce avec un microscope à balayage laser, mais peut aussi être analysé autrement, par exemple, par cytométrie en flux.
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Discussion
Nous avons développé une plate-forme de puces à base pour la culture en trois dimensions des cellules en bioréacteurs micro activement perfusé. Les puces peuvent être fabriqués à partir de non-biodégradables ainsi que des polymères biodégradables par injection de micro, le gaufrage à chaud ainsi les micro techniques de thermoformage 3. Selon la conception expérimentale, la surface du polymère peut être modifié par irradiation UV 4. Lignées cellulaires d'hépatocytes ainsi que hépatocytes primaires de rat peut être cultivée avec succès dans ces dispositifs que peut être démontré par l'analyse d'expression de certains gènes du foie spécifiques ainsi que l'analyse de certaines protéines du foie spécifiques 5,6.
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Acknowledgments
Nous tenons à remercier Mechthild Herschbach et Anke Dech d'assistance technique excellente.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | Other | ATCC | HB-8065 | |
| Collagen I from rat tail | Reagent | Roche Group | 11 179 179 001 | |
| PARIS kit | Reagent | Ambion | AM1921 | |
| Syto16 | Reagent | Invitrogen | S7578 | |
| anti cytokeratin 18 | Antibody | Abcam | ab668 | Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/100 in PBS |
| Anti E-cadherin | Antibody | Abcam | ab1416 | Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/50 in PBS. |
| Goat anti-albumin | Reagent | Bethyl Laboratories | E80-129 | Primary Ab, goat anti-human Albumin, used 1/200 in PBS |
| Rabbit anti-mouse IgG1 | Antibody | Invitrogen | A11059 | Secondary Ab, Alexa Flour 488 conjugated, used 1/100 in PBS + 0.5 % BSA |
| Cy3 anti-goat IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 705-165-003 | Cy3 AffiniPure donkey a-goat IgG Ab, used 1/700 in PBS + 0.5% BSA |
References
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. J. Cell Biol. 53, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. 3. Enzymatic requirements for tissue dispersion. Exp. Cell Res. 82, 391-398 (1973).
- Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmueller, R., Weibezahn, K. F., Welle, A. 3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films. Biomed. Microdev. 8, 191-199 (2006).
- Welle, A., Gottwald, E. UV-based patterning of polymeric substrates for cell culture applications. Biomed. Microdev. 4, 33-41 (2002).
- Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmueller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. -F. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab Chip. 7, 777-785 (2007).
- Eschbach, E., Chatterjee, S. S., Noldner, M., Gottwald, E., Dertinger, H., Weibezahn, K. -F., Knedlitschek, G., G, Microstructured scaffolds for liver tissue with high density: Morphological and biochemical characterization of tissue aggregates. J. Cell. Biochem. 95, 243-255 (2005).
