Summary
हम सूक्ष्म बायोरिएक्टर में तीन आयामी कोशिकाओं की खेती के लिए चिप आधारित एक मंच का वर्णन. एक चिप ऊपर 10 Mio के लिए घर कर सकते हैं. कोशिकाओं है कि एक बाँझ, बंद संचलन पाश में द्रव का प्रवाह है, ऑक्सीजन तनाव आदि के संबंध के साथ ठीक से परिभाषित शर्तों के तहत खेती की जा सकती.
Abstract
हम तीन आयामी कोशिकाओं की खेती के लिए चिप आधारित एक सेल संस्कृति प्रणाली विकसित की है. चिप आम तौर पर गैर biodegradable polymers, उदाहरण के लिए, polycarbonate या सूक्ष्म इंजेक्शन मोल्डिंग द्वारा polymethyl methacrylate, माइक्रो गर्म embossing या thermoforming सूक्ष्म से निर्मित है. लेकिन, यह भी जैव degradable पॉलिमर से निर्मित किया जा सकता है. इसका समग्र आयामों एक 0.7 x 20 x 20 x 0.7 1 मिमी (hxwxl). इस्तेमाल किया चिप्स के मुख्य सुविधाओं या तो की एक 1156 घन सूक्ष्म कंटेनर (cf चिप) ग्रिड 120-300 के आकार प्रत्येक x 300 x 300 (hxwxl) μ या 300 μ के diameters के साथ दौर recesses और गहराई के 300 μ (r चिप). पाड़ 10 Mio घर कर सकते हैं. एक तीन आयामी विन्यास में कोशिकाओं. एक इष्टतम पोषक तत्व और गैस की आपूर्ति के लिए, चिप एक bioreactor आवास में डाला जाता है. bioreactor एक बंद steril परिसंचरण पाश है कि, सरल विन्यास में, additionaly एक रोलर पंप और गैस की आपूर्ति के साथ एक मध्यम जलाशय शामिल है का हिस्सा है. bioreactor छिड़काव, superfusion, या यहाँ तक कि एक मिश्रित ऑपरेशन मोड में चलाया जा सकता है. हम सफलतापूर्वक कई सप्ताह की अवधि में प्राथमिक कोशिकाओं सेल लाइनों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से खेती. चूहे प्राथमिक यकृत कोशिकाओं के लिए हम अधिक से अधिक 2 सप्ताह के लिए organotypic कार्यों के संरक्षण दिखा सकता है. Hepatocellular कार्सिनोमा सेल लाइनों के लिए हम जिगर केवल थोड़ा मानक monolayer संस्कृति में व्यक्त नहीं या विशिष्ट जीन की प्रेरण दिखा सकता है. इस प्रणाली को भी उपयोगी हो सकता है के रूप में स्टेम सेल लाइनों के साथ पहली भेदभाव प्रयोगों के बाद से एक स्टेम सेल की खेती प्रणाली का वादा कर रहे थे हो सकता है.
Protocol
इस कागज के तीन आयामी सेल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लाइनों प्राथमिक कोशिकाओं की खेती के लिए चिप आधारित एक मंच (fig. 1) के उपयोग का वर्णन करता है. के बाद से कई कोशिकाओं-3D वातावरण में ही व्यक्त organotypic कार्य करते हैं, हम एक बहुलक चिप है कि करने के लिए जो कोशिकाओं स्थानिक सभी दिशाओं में पालन कर सकते हैं पाड़ प्रदान करता है विकसित किया है, और है कि द्रव का प्रवाह के नियंत्रण के लिए एक bioreactor आवास में रखा जा सकता है है , ऑक्सीजन, तनाव आदि प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर, बहुलक की सतह विभिन्न तकनीकों, जैसे, यूवी विकिरण, PECVD, γ - कलम बांधने का काम या पारंपरिक गीला रसायन विज्ञान के द्वारा संशोधित किया जा सकता है.
चित्रा 01
1. डी वातन और चिप के hydrophilisation
उपयोग करने से पहले, चिप deaerated और hydrophilized हो गया है. इस के लिए, एक शराब श्रृंखला से बाहर किया जाता है. Isopropanol 100%, 70%, 50%, 30% DMPC इलाज पानी में isopropanol से मिलकर समाधान तैयार हैं और चिप प्रत्येक एकाग्रता में डूबा हुआ है, 100% समाधान के साथ शुरुआत, 30 तक के लिए. श्रृंखला के अंतिम चरण शुद्ध डाइमिथाइल (DMPC) pyrocarbonate पानी का इलाज के होते हैं. इस बिंदु से, यह चिप गीला रखना महत्वपूर्ण है.
2. कोलेजन मैं कोटिंग
शराब की श्रृंखला के बाद, चिप आम तौर पर एक कोलेजन मैं चूहे की पूँछ से समाधान के साथ लेपित है. कोलेजन 2 मिलीग्राम / एमएल के शेयर समाधान 0.2% एसिटिक एसिड में से एक 30 μg कोलेजन प्रोटीन इसी विभाज्य DMPC पानी का इलाज के साथ 150 μl के अंतिम मात्रा से पतला है. 10 μg कोलेजन मैं प्रति 2 सेमी की सतह क्षेत्र के एक घनत्व के साथ चिप सतह के कोलेजन कोटिंग में यह परिणाम है.
3. Hepatocellular कार्सिनोमा कोशिकाओं का टीका
लाइन Hep G2 के hepatocellular कार्सिनोमा कोशिकाओं trypsinized और गिना रहे हैं. अल्पकालिक प्रयोगों (1 से 6 दिन) के लिए 5 10 * 6 कोशिकाओं प्रत्येक चिप और इसी नियंत्रण सेमी 6 टिशू कल्चर पेट्री डिश में inoculated हैं . Inoculte, चिप 5 * 10 6 कोशिकाओं 150 μl संस्कृति माध्यम में resuspended हैं और चिप के microstructured क्षेत्र (छवि 2) के शीर्ष पर रखा. बाद में, यह एक मशीन में 2-3 घंटे के लिए रखा है. इस ऊष्मायन अवधि के दौरान सूक्ष्म कंटेनरों में कोशिकाओं तलछट और कोलेजन पाड़ मैं लेपित का पालन.
चित्रा 2
4. चिप के bioreactor आवास में निवेशन
ऊष्मायन अवधि के बाद, चिप इन्क्यूबेटर से निकाल दिया जाता है और bioreactor आवास में मुहिम शुरू की. इसके लिए साफ बेंच के तहत, preassembled bioreactor बाँझ पैकिंग से हटा दिया है और एक डिग्री है कि चिप की प्रविष्टि के लिए अनुमति देता है disassembled. चिप ध्यान बाँझ संदंश के साथ संभाला है और नाली जिसमें गैसकेट मुहरों जो चिप और जो bioreactor में एक ऊपरी और निचले डिब्बे की पीढ़ी में यह परिणाम में रखा है. फिर, bioreactor फिर इकट्ठा किया है और इनक्यूबेटर जहां यह पंप से जुड़ा है, गैस की आपूर्ति और ऑक्सीजन विश्लेषक को हस्तांतरित.
5. सिस्टम के भरने
के रूप में जल्द ही के रूप में bioreactor मध्यम जलाशय से जुड़ा है, पंप और गैस की आपूर्ति बंद संचलन पाश के माध्यम से भरा है. यह इस तरह है कि superfusion, जो चिप के शीर्ष पर माध्यम के प्रवाह के रूप में परिभाषित किया गया है हासिल की है में 3 तरह कनेक्टर्स स्थिति के द्वारा किया जाता है. इस पाड़ से कोशिकाओं को हटाने के बिना bioreactor प्रचलन से संलग्न हवा का निर्वहन करने के लिए होता है. व्यवस्था के बाद पूरी तरह से मध्यम से भरा है, 3 तरह connectors इस तरह से है कि छिड़काव, जो ऊतकों के माध्यम से चिप से नीचे के प्रवाह के रूप में परिभाषित किया गया है हासिल की है में बंद कर रहे हैं. छिड़काव विन्यास में प्रवाह सेल की जरूरत है जो hepatocytes के लिए आमतौर पर 60-500 μl / मिनट से लेकर के लिए निकाला जाता है.
6. नमूनाकरण
प्रयोग के दौरान मध्यम नमूने तैयार किया जा सकता है. इस के लिए, सीरिंज मध्यम जलाशय के शीर्ष पर बाँझ बंदरगाहों से जुड़े हैं. नमूने के बाद, बंदरगाहों के 70% isopropanol के साथ निष्फल रहे हैं.
7. बहाव के अनुप्रयोगों के लिए चिप से बरकरार कोशिकाओं के अलगाव
प्रयोग के अंत में, बायोरिएक्टर गैस की आपूर्ति और रोलर पंप से डिस्कनेक्ट हो जाते हैं, स्वच्छ बेंच को हस्तांतरित और disassembled के रूप में पहले वर्णित है. बाँझ संदंश के साथ चिप bioreactor आवास से हटा दिया जाता है रखा,एक 3.5 सेमी पेट्री डिश में और पीबीएस के साथ rinsed. बाद में, चिप trypsin / EDTA (0.25% / 0.53mM) के साथ एक मशीन में 5-15 मिनट के लिए incubated है microstructured क्षेत्र से कोशिकाओं को अलग. एकत्र सेल निलंबन 600 जी में 5 मिनट के लिए centrifuged है कोशिकाओं तो पारंपरिक बहाव के अनुप्रयोगों, उदाहरण के लिए, कुल शाही सेना या प्रोटीन अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. नियमित, हम माइक्रोएरे विश्लेषण और वास्तविक समय RT-पीसीआर (पैरिस किट, Ambion इंक, ऑस्टिन, टेक्सास, संयुक्त राज्य अमरीका) के लिए कुल शाही सेना को अलग. प्रोटीन अभिव्यक्ति एक खुर्दबीन स्कैनिंग लेजर के साथ चिप के अंदर की कोशिकाओं के immunohistochemical धुंधला के बाद विश्लेषण किया है, लेकिन भी अन्यथा विश्लेषण किया जा सकता है, जैसे प्रवाह cytometry द्वारा.
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Discussion
हम सक्रिय रूप से perfused सूक्ष्म बायोरिएक्टर में तीन आयामी कोशिकाओं की खेती के लिए चिप आधारित एक मंच विकसित किया है. चिप्स से गैर biodegradable के रूप में अच्छी तरह से biodegradable polymers सूक्ष्म इंजेक्शन मोल्डिंग, गर्म embossing के रूप में अच्छी तरह से सूक्ष्म thermoforming 3 तकनीकों के द्वारा निर्मित किया जा सकता है. प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है, बहुलक की सतह 4 यूवी विकिरण द्वारा संशोधित किया जा सकता है . Hepatocyte सेल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लाइनों प्राथमिक चूहे hepatocytes इन उपकरणों में सफलतापूर्वक खेती की जा सकता है के रूप में कुछ जिगर विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति विश्लेषण के रूप में अच्छी तरह के रूप में कुछ विशिष्ट जिगर 5,6 प्रोटीन का विश्लेषण द्वारा दिखाया जा सकता है है.
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Acknowledgments
हम Mechthild Herschbach और Anke Dech उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | Other | ATCC | HB-8065 | |
| Collagen I from rat tail | Reagent | Roche Group | 11 179 179 001 | |
| PARIS kit | Reagent | Ambion | AM1921 | |
| Syto16 | Reagent | Invitrogen | S7578 | |
| anti cytokeratin 18 | Antibody | Abcam | ab668 | Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/100 in PBS |
| Anti E-cadherin | Antibody | Abcam | ab1416 | Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/50 in PBS. |
| Goat anti-albumin | Reagent | Bethyl Laboratories | E80-129 | Primary Ab, goat anti-human Albumin, used 1/200 in PBS |
| Rabbit anti-mouse IgG1 | Antibody | Invitrogen | A11059 | Secondary Ab, Alexa Flour 488 conjugated, used 1/100 in PBS + 0.5 % BSA |
| Cy3 anti-goat IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 705-165-003 | Cy3 AffiniPure donkey a-goat IgG Ab, used 1/700 in PBS + 0.5% BSA |
References
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