Summary
Мы описываем чип-платформы для трехмерного культивирования клеток в микро-биореакторов. Один чип может вмещать до 10 мил. клеток, которые можно выращивать в точно определенных условиях в связи с потоком жидкости и т.д. напряжения кислорода в стерильной, замкнутый контур циркуляции.
Abstract
Мы разработали чип основе клеточной культуры система трехмерного выращивания клеток. Чип, как правило, изготовлены из не-биоразлагаемых полимеров, например, поликарбоната или полиметилметакрилата микро литья под давлением, микро горячего тиснения или микро горячего формования. Но, он также может быть изготовлен из биоразлагаемых полимеров. Его габаритные размеры составляют 0,7 1 х 20 х 20 х 0,7 1 мм (ВxШxД). Основные особенности чипы, используемые либо сетки до 1156 кубических микро-контейнеры (CF-чип), каждая размером 120-300 х 300 х 300 μ (ВxШxД) или круглые углубления диаметром 300 μ и глубины в 300 μ (г-чип). Эшафот можно разместить 10 млн.. клеток в трехмерной конфигурации. Для оптимального питательного и газоснабжения, чип вставляется в биореакторе жилья. Биореактор является частью замкнутого контура циркуляции стерильные, что в простейшей конфигурации, дополнительно состоит из насоса ролика и средний резервуар с газом. Биореактор может быть запущен в перфузии, superfusion, или даже в смешанном режиме эксплуатации. Мы успешно культивируемых клеточных линий, а также первичные ячейки над периодами в несколько недель. Для крыс первичных клеток печени, мы могли бы показать сохранение органотипической функции в течение более 2 недель. Для линий гепатоцеллюлярной карциномы ячейки мы могли бы показать индукцию печени специфических генов нет или незначительно выраженных в стандартной культуры монослоя. Система также может быть полезна как выращивание стволовых клеток системе, так как первые опыты дифференцирование стволовых клеток были многообещающими.
Protocol
Эта статья описывает использование чип-платформы (рис. 1) для трехмерного выращивания клеточных линий, а также первичные ячейки. Так как многие клетки выразить органотипической функции только в 3D-среде, мы разработали чип полимера, который обеспечивает эшафот которой клетки могут придерживаться во всех пространственных направлениях, и которые могут быть установлены в биореакторе жилья для контроля потока жидкости , напряжения кислорода и т.д. В зависимости от экспериментального проектирования поверхности полимера могут быть изменены различными методами, например, УФ-облучение, PECVD, γ-прививкой или обычной мокрой химии.
Рисунок 01
1. Де-аэрации и hydrophilisation микросхемы
Перед использованием чип должен быть деаэрированной и hydrophilized. Для этого, алкоголь серии осуществляется. Изопропанол решений, состоящих из 100%, 70%, 50%, 30% изопропанола в ДМФХ-очищенной воды готовятся и чип, смоченной в каждой концентрации, начиная с 100%-ный раствор, на срок до 30 лет. На заключительном этапе серии состоит из чистого Диметил pyrocarbonate (ДМФХ)-очищенной воды. С этой точки зрения, очень важно держать чип влажным.
2. Коллаген я покрытием
После алкоголя серии чипов, как правило, покрыты коллагена I решение от крысиного хвоста. Из решения коллагена запас 2 мг / мл в 0,2% уксусной кислоты аликвоту соответствующий 30 мкг белка коллагена разбавляют ДМФХ обработанных водой до конечного объема 150 мкл. Это приводит к коллагена покрытие поверхности чипа с плотностью 10 мкг коллагена я на см 2 площади поверхности.
3. Прививка клеток гепатоцеллюлярной карциномы
Гепатоцеллюлярной карциномы клетках линии Hep G2 являются трипсином и подсчитаны. Для краткосрочных экспериментов (от 1 до 6 дней) 5 * 10 6 клеток засевают в каждом чипе и соответствующий регулятор 6 см культуре ткани чашки Петри. Для inoculte, чип 5 * 10 6 клеток ресуспендируют в 150 мкл культуральной среде и размещены на верхней части микроструктурированных области чипа (рис. 2). После этого его помещают в инкубатор на 2-3 часа. В течение этого инкубационного периода клетки осадка в микро-контейнеров и придерживаться коллагена I-покрытием эшафот.
Рисунок 2
4. Введение чипа в биореакторе жилья
После инкубационного периода, чип будет удален из инкубатора и монтируется в биореакторе жилья. Для этого, в чистом столе, собранном биореактор удаляется из стерильной упаковки и разобрали до такой степени, что дает возможность вставки чипа. Чип тщательно обрабатываются стерильным пинцетом и помещают в паз, который содержит прокладку которых печатями чипа и в результате чего поколение верхнего и нижнего отсека в биореактор. Затем, биореактор собирается снова и переданы инкубатор, где это связано с насосом, газоснабжения и анализатора кислорода.
5. Заполнение системы
Как только биореактор подключен к среде водохранилища, насосные и газоснабжения замкнутого контура циркуляции заполнена средой. Это делается путем установки 3-полосная-разъемы таким образом, что superfusion, которая определяется как поток среды по верхней части чипа, достигается. Это приводит к сброса воздуха из закрытых биореактор обращение без удаления клеток из леса. После того как система полностью заполнена средой, 3-полосная-разъемы переключаются таким образом, что перфузии, которая определяется как поток снизу чипа через ткань, достигается. В перфузии конфигурации потока с учетом потребностей клетка, которая на гепатоциты обычно составляет от 60-500 мкл / мин.
6. Отбор проб
В ходе эксперимента средний образцы могут быть сделаны. Для этого, шприцы подключены к стерильным порты на вершине среды водоема. После отбора проб, порты стерилизуют при 70% изопропанола.
7. Выделение интактных клеток с чипом для последующих применений
В конце эксперимента, биореакторы отключены от газоснабжения и роликовый насос, переведен в чистом столе и разбираются, как описано выше. С стерильных щипцов чип будет удален из биореактора жилья, размещенныев 3,5 см блюдо Петри и промывали PBS. После этого чипа инкубируют с трипсин / ЭДТА (0,25% / 0,53) в течение 5-15 мин в инкубатор, чтобы отделить клетки от микроструктурированных области. Собранных клеточной суспензии центрифугируют в течение 5 мин при 600 g. Клетки могут затем быть использованы для обычных приложений вниз по течению, например, общей РНК или белка изоляции. Регулярно, мы выделяем общую РНК (ПАРИЖ комплект, Амбион Inc, Остин, штат Техас, США) для микрочипов анализа в режиме реального времени RT-PCR. Белки выражение анализируется после иммуногистохимического окрашивания клетки внутри чипа с лазерного сканирующего микроскопа, но также могут быть проанализированы в противном случае, например, с помощью проточной цитометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы разработали чип-платформы для трехмерного выращивания клеток в активное перфузии микро биореакторов. Чипы могут быть изготовлены из не поддающихся биохимическому разложению, а также биоразлагаемых полимеров методом микро литья под давлением, горячее тиснение, а также микро термоформования методы 3. В зависимости от экспериментального проектирования поверхности полимера может быть изменен УФ-облучение 4. Гепатоцитов клеточных линий, а также первичные гепатоциты крысы могут успешно культивируется в этих устройствах, как можно показать, выражением анализ некоторых специфических генов печени, а также анализ некоторых специфических белков печени 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Мехтильд Herschbach и Анке Dech за отличную техническую помощь.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | Other | ATCC | HB-8065 | |
| Collagen I from rat tail | Reagent | Roche Group | 11 179 179 001 | |
| PARIS kit | Reagent | Ambion | AM1921 | |
| Syto16 | Reagent | Invitrogen | S7578 | |
| anti cytokeratin 18 | Antibody | Abcam | ab668 | Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/100 in PBS |
| Anti E-cadherin | Antibody | Abcam | ab1416 | Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/50 in PBS. |
| Goat anti-albumin | Reagent | Bethyl Laboratories | E80-129 | Primary Ab, goat anti-human Albumin, used 1/200 in PBS |
| Rabbit anti-mouse IgG1 | Antibody | Invitrogen | A11059 | Secondary Ab, Alexa Flour 488 conjugated, used 1/100 in PBS + 0.5 % BSA |
| Cy3 anti-goat IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 705-165-003 | Cy3 AffiniPure donkey a-goat IgG Ab, used 1/700 in PBS + 0.5% BSA |
References
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. J. Cell Biol. 53, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. 3. Enzymatic requirements for tissue dispersion. Exp. Cell Res. 82, 391-398 (1973).
- Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmueller, R., Weibezahn, K. F., Welle, A. 3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films. Biomed. Microdev. 8, 191-199 (2006).
- Welle, A., Gottwald, E. UV-based patterning of polymeric substrates for cell culture applications. Biomed. Microdev. 4, 33-41 (2002).
- Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmueller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. -F. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab Chip. 7, 777-785 (2007).
- Eschbach, E., Chatterjee, S. S., Noldner, M., Gottwald, E., Dertinger, H., Weibezahn, K. -F., Knedlitschek, G., G, Microstructured scaffolds for liver tissue with high density: Morphological and biochemical characterization of tissue aggregates. J. Cell. Biochem. 95, 243-255 (2005).
