Summary
Vi beskriver ett chip-baserad plattform för tredimensionella cellkulturer i mikro-bioreaktorer. Ett chip kan rymma upp till 10 miljoner. celler som kan odlas på exakt definierade villkor med avseende på strömning, syre spänning etc. i ett slutet, sterilt cirkulation slinga.
Abstract
Vi har utvecklat ett chip-baserat system cellodling för tredimensionella odling av celler. Kretsen är normalt tillverkade av icke biologiskt nedbrytbara polymerer, t.ex. polykarbonat eller polymetylmetakrylat av mikroorganismer formsprutning, mikro varmpressning eller mikro varmformning. Men kan den också tillverkas av biologiskt nedbrytbara polymerer. Det övergripande mått är 0,7 1 x 20 x 20 x 0,7 1 mm (hxwxl). Huvuddragen i den använda marker är antingen ett rutnät på upp till 1156 kubik micro-behållare (CF-chip) varje storlek 120-300 x 300 x 300 μ (hxwxl) eller runda fördjupningar med en diameter på 300 μ och ett djup av 300 μ (r-chip). Ställningen rymmer 10 miljoner. celler i ett tredimensionellt konfiguration. För en optimal närings-och gasförsörjning, är det chip in i en bioreaktor bostäder. Den bioreaktor är en del av ett slutet steril cirkulation slinga som i den enklaste konfigurationen är additionaly består av en rulle pump och ett medium reservoar med ett gasförsörjning. Den bioreaktor kan köras i perfusion, superfusion, eller ens en blandad driftläge. Vi har framgångsrikt odlade cellinjer så väl som primära celler under perioder på flera veckor. För råtta primära leverceller vi kunde visa ett bevarande av organotypic funktioner för mer än 2 veckor. För cell hepatocellulär cancer linjer vi kunde visa induktion av lever specifika gener inte, eller endast svagt i standarden monolager kultur. Systemet kan också vara användbart som en Stamcellsodling systemet sedan den första differentieringen experiment med stamcellslinjer var lovande.
Protocol
Detta dokument beskriver användningen av ett chip-baserad plattform (Fig. 1) för de tre-dimensionella odling av cellinjer och primära celler. Eftersom många celler uttrycker organotypic fungerar endast i en 3D-miljö, har vi utvecklat en polymer chip som ger en klätterställning som cellerna kan hålla sig i alla rumsliga riktningar, och som kan monteras i en bioreaktor boende för kontroll av vätskeflöde , syre spänning etc. Beroende på experimentell design kan ytan av polymeren ändras av olika tekniker, t ex UV-strålning, PECVD, γ-ympning eller konventionell våt kemi.
Figur 01
1. Avluftning och hydrophilisation av chip
Före användning måste chipet vara avluftat och hydrophilized. För detta är en alkohol-serien utförs. Isopropanol lösningar som består av 100%, 70%, 50%, 30% isopropanol i DMPC-behandlat vatten bereds och chip doppas i varje koncentration, som börjar med 100% lösning, för upp till 30-talet. Det sista steget i serien består av ren Dimethyl pyrocarbonate (DMPC)-behandlat vatten. Från och med nu är det viktigt att hålla chip våt.
2. Kollagen Jag beläggning
Efter alkohol-serien, är det chip vanligtvis belagd med ett kollagen Jag lösning från råtta svans. Från kollagen stamlösningen av 2 mg / ml i 0,2% ättiksyra en alikvot motsvarande 30 mikrogram kollagen protein är utspädd med DMPC-behandlat vatten till en slutlig volym på 150 l. Detta resulterar i en kollagen beläggning av chip yta med en densitet på 10 mikrogram kollagen jag per cm 2 yta.
3. Inokulering av celler levercellscancer
Hepatocellulär cancer celler i raden Hep G2 trypsinized och räknas. För kortvariga försök (1 till 6 dagar) 5 * 10 6 celler inokuleras i varje chip och motsvarande kontroll 6 cm vävnadsodling petriskålar. För att inoculte är chipet 5 * 10 6 celler resuspenderas i 150 l odlingsmedium och placeras på toppen av mikrostrukturerad område av chip (Fig. 2). Därefter placeras det i en inkubator för 2-3 timmar. Under denna inkubationstid cellerna sediment i mikro-behållare och ansluta sig till kollagen I-belagda schavotten.
Figur 2
4. Införande av marker i bioreaktor bostäder
Efter inkubationstiden, är det chip ut ur kuvösen och monteras i bioreaktor bostäder. För detta, under sterilbänk är förmonterade bioreaktor bort från den sterila förpackningen och demonteras till en grad som gör det möjligt för införande av chipet. Chipet är noggrant hanteras med steril pincett och placeras i spåret som innehåller den packning som tätar chip och som resulterar i att generera en övre och undre fack i bioreaktor. Sedan är det bioreaktor samman igen och överföras till inkubatorn där den är ansluten till pumpen, den gas och syre analysatorn.
5. Fyllning av systemet
Så snart bioreaktor är ansluten till mediet reservoar, pump och gasförsörjning den slutna cirkulationen slingan är fylld med medium. Detta görs genom att placera 3-vägs-kontakter på ett sådant sätt att superfusion, som definieras som flödet av medium över toppen av chipet, uppnås. Detta leder till ett utsläpp av inneslutna luften från bioreaktor omsättning utan att ta bort celler från schavotten. När systemet är helt fylld med medium, är 3-vägs-kontakter kopplas in så att perfusionen, som definieras som flödet underifrån chipet genom vävnaden, uppnås. I perfusionen konfigurationen flödet justeras till cellens behov som för hepatocyter normalt varierar från 60 till 500 l / min.
6. Provtagning
Under experimentet mediet proverna kan dras. För detta är sprutor kopplade till den sterila portarna på toppen av mediet reservoaren. Efter provtagning är portarna steriliseras med 70% isopropanol.
7. Isolering av intakta celler från chip för tillämpningar i efterföljande led
I slutet av experimentet, är bioreaktorer kopplas bort från gastillförseln och rullen pumpen överförs till sterilbänk och demonteras enligt beskrivningen tidigare. Med steril pincett chipet tas bort från bioreaktor bostäder, placerasi en 3,5 cm petriskål och sköljas med PBS. Efteråt är det chip inkuberas med trypsin / EDTA (0,25% / 0.53mM) i 5-15 min i en inkubator att lösgöra celler från mikrostrukturerad området. De insamlade cellsuspension centrifugeras i 5 min på 600 g. Cellerna kan sedan användas för konventionella nedströms tillämpningar, t.ex. total RNA eller protein isolering. Rutinmässigt, isolerar vi totalt RNA (PARIS kit, Ambion Inc., Austin, Texas, USA) för microarray analys och realtids RT-PCR. Proteinuttryck analyseras efter immunhistokemisk färgning av celler inuti chipet med en laser scanning mikroskop, men kan också analyseras på annat sätt, t.ex. genom flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utvecklat ett chip-baserad plattform för tredimensionella cellkulturer i aktivt perfusion mikro bioreaktorer. Markerna kan tillverkas av icke biologiskt nedbrytbart samt biologiskt nedbrytbara polymerer av mikroorganismer formsprutning, varmpressning samt mikro varmformning tekniker 3. Beroende på experimentell design kan ytan av polymeren ändras av UV-strålning 4. Hepatocyte cellinjer samt primära hepatocyter råtta kan med framgång odlas i dessa enheter som kan visas genom uttryck analys av vissa lever-specifika gener samt analys av vissa lever-specifika proteiner 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka Mechthild Herschbach och Anke Dech för utmärkt tekniskt bistånd.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | Other | ATCC | HB-8065 | |
| Collagen I from rat tail | Reagent | Roche Group | 11 179 179 001 | |
| PARIS kit | Reagent | Ambion | AM1921 | |
| Syto16 | Reagent | Invitrogen | S7578 | |
| anti cytokeratin 18 | Antibody | Abcam | ab668 | Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/100 in PBS |
| Anti E-cadherin | Antibody | Abcam | ab1416 | Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/50 in PBS. |
| Goat anti-albumin | Reagent | Bethyl Laboratories | E80-129 | Primary Ab, goat anti-human Albumin, used 1/200 in PBS |
| Rabbit anti-mouse IgG1 | Antibody | Invitrogen | A11059 | Secondary Ab, Alexa Flour 488 conjugated, used 1/100 in PBS + 0.5 % BSA |
| Cy3 anti-goat IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 705-165-003 | Cy3 AffiniPure donkey a-goat IgG Ab, used 1/700 in PBS + 0.5% BSA |
References
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. J. Cell Biol. 53, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. 3. Enzymatic requirements for tissue dispersion. Exp. Cell Res. 82, 391-398 (1973).
- Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmueller, R., Weibezahn, K. F., Welle, A. 3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films. Biomed. Microdev. 8, 191-199 (2006).
- Welle, A., Gottwald, E. UV-based patterning of polymeric substrates for cell culture applications. Biomed. Microdev. 4, 33-41 (2002).
- Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmueller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. -F. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab Chip. 7, 777-785 (2007).
- Eschbach, E., Chatterjee, S. S., Noldner, M., Gottwald, E., Dertinger, H., Weibezahn, K. -F., Knedlitschek, G., G, Microstructured scaffolds for liver tissue with high density: Morphological and biochemical characterization of tissue aggregates. J. Cell. Biochem. 95, 243-255 (2005).
