Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Måling af Influenza neutraliserende antistof svar til A(H3N2) virus i menneskelige Sera af Microneutralization undersøgelser, som ved hjælp af MDCK-SIAT1 celler

Published: November 22, 2017 doi: 10.3791/56448
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Influenza Division, Centers for Disease Control and Prevention, 2Battelle

Summary

Influenza neutraliserende antistoffer korrelerer med beskyttelse af influenza-infektioner. Microneutralization assays måling af neutraliserende antistoffer i menneskelige sera og bruges ofte til influenza human serum. Vi beskriver en microneutralization analyse ved hjælp af MDCK-SIAT1 celler til at måle neutraliserende antistof titers til moderne 3C.2a og 3C.3a A(H3N2) virus efter vaccination mod influenza eller infektion.

Abstract

Neutraliserende antistoffer mod hemagglutinin (HA) influenza-vira betragtes som den vigtigste immune mekanisme, der korrelerer med beskyttelse af influenza-infektioner. Microneutralization (MN) assays er ofte bruges til at måle neutraliserende antistof reaktioner i menneskelige sera efter vaccination mod influenza eller infektion. Madine Darby Canine nyre (MDCK) celler er almindeligt anvendte celle substrat for MN assays. Men i øjeblikket cirkulerer 3C.2a og 3C.3a A(H3N2) influenza virus har fået ændret receptor binding specificitet. MDCK-SIAT1-cellelinie med øget α-2,6 sialic galactose fraspaltning på overfladen har vist sig for at give forbedret smitteevne og mere trofast replikationer end konventionelle MDCK celler efter disse moderne A(H3N2) virus. Her, beskriver vi en MN analyse ved hjælp af MDCK-SIAT1 celler, der er blevet optimeret for at kvantificere neutraliserende antistof titers til disse moderne A(H3N2) virus. I denne protokol fortyndes varme inaktiveret sera indeholdende neutraliserende antistoffer først seriefremstillede, derefter inkuberes med 100 TCID50/godt af A(H3N2) influenzavirus til at tillade antistoffer i sera at binde til virus. MDCK-SIAT1 celler er derefter føjes til virus-antistof blandingen og inkuberes i 18-20 timer ved 37 ° C, 5% CO2 til at tillade A(H3N2) virus at inficere MDCK-SIAT1 celler. Efter natten inkubation, plader er fast og mængden af virus i hver godt er kvantificeret ved en enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) ved hjælp af anti-influenza en nucleoprotein (NP) monoklonale antistoffer. Neutraliserende antistof titer er defineret som reciprokke af den højeste serumfortynding, der giver ≥50% hæmning af virus smitteevne.

Introduction

Influenzavirus fortsætte med at forårsage sygelighed og dødelighed i den menneskelige befolkning hvert år. HA er den store overflade glycoprotein af influenzavirus. Neutraliserende antistoffer rettet mod HA er den vigtigste immune mekanisme, der korrelerer med beskyttelse af influenza-infektion1,2. Hemagglutination hæmning (HI) assays og MN assays er to metoder, der er almindeligt anvendt til at måle antistof reaktioner i menneskelige sera efter influenza-infektion eller vaccination3. HI assay måler antistof hæmning af virus hemagglutination af røde blodlegemer og betragtes som en surrogat assay. I modsætning til HI, kan MN assay direkte måle niveauet af antistoffer i menneskelige sera, der neutraliserer influenza-infektion i cellekulturer. MDCK celler bruges ofte i influenza virusisolation og MN-undersøgelser,4.

Influenzavirus undergår konstant antigene drift og skift, erhverve mutationer på HA proteiner, der kan ændre receptor binding specificiteten af virus. Siden 2014, nye klynger af A(H3N2) virus dukkede op og fortsatte med at cirkulere indtil den aktuelle sæson. Fleste af disse virus tilhører genetiske gruppe 3C.2a og 3C.3a baseret på Fylogenetisk analyse af HA proteiner. Mange af de cirkulerende 3C.2a vira havde reduceret evne til at hemagglutinate røde blodlegemer og derfor ikke kan være kendetegnet ved HI assays5. Neutralisering assays skal bruges til at måle antistof reaktioner på disse vira, der ikke hemagglutinate6. Desuden, undersøgelser har vist, at disse moderne A(H3N2) virus har ændret receptor bindende egenskaber sammenlignet med tidligere A(H3N2) virus og har tendens til at akkumulere kultur tilpasset mutationer og polymorfi når passaged i in vitro- celle kulturer7,8,9. Sammenlignet med konventionelle MDCK celler, er MDCK-SIAT1 en cellelinje, udviklet af Matrosovich et al. gennem stabile Transfektion af MDCK celler med cDNA af menneskelige en2, 6-sialtransferase (SIAT1). Denne cellelinie udtrykker øgede mængder af en2, 6-sialic galactose fraspaltning og nedsat beløb for en2, 3-sialic syre fraspaltning end overordnet MDCK celler10. MDCK-SIAT1 celler har vist sig for at forbedre isolering priser for A(H3N2) virus i forhold til MDCK celler11. For nylig, Lin et al. rapporterede, at for nyopstået 3C.2a og 3C.3a menneskelige A(H3N2) influenzavirus, mere trofaste virus replikeringer og bedre virus smitteevne blev opnået, når virus var kulturperler i MDCK-SIAT1 cellelinjer sammenlignet med MDCK celler7. MDCK-SIAT1-celler passer således bedre i MN assays til at karakterisere antistof svar til de seneste klynger af A(H3N2) virus.

Her beskriver vi en MN analyse ved hjælp af MDCK-SIAT1 celler til at måle antistof svar til moderne 3C.2a og 3C.3a A(H3N2) vira i menneskelige sera. Virus dyrkes i enten æg eller celler kan bruges i denne analyse. Varme inaktiveret sera indeholdende neutraliserende antistoffer er først seriefremstillede fortyndet, derefter inkuberes med 100 TCID50/godt af A(H3N2) influenzavirus tillade antistoffer i sera at binde sig til virussen. MDCK-SIAT1 celler er derefter føjes til virus-antistof blandingen og inkuberes i 18-20 timer ved 37 ° C, 5% CO2 til at tillade A(H3N2) virus at inficere MDCK-SIAT1 celler og kopiere. Efter natten inkubation, pladerne er faste og mængden af virus i hver brønd er kvantificeret ved en ELISA ved hjælp af anti-influenza A NP monoklonale antistoffer. Påvisning af NP indikerer tilstedeværelsen af virusinfektion og fraværet af neutraliserende antistoffer. Neutraliserende antistof titer er defineret som reciprokke af den højeste serumfortynding, der indeholder ≥ 50% hæmning af virus smitteevne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle influenzavirus skal håndteres efter passende biosikkerhed niveau krav (BSL-2 eller højere) som defineret i biosikkerhed på mikrobiologiske og biomedicinske laboratorier (BMBL)12.

1. forberedelse af reagenser og råvare

  1. Forberede MDCK-SIAT1 celler og sterile cellekulturmedium
    1. Forberede MDCK-SIAT1 cellekulturmedium med 500 mL af Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) med høje glukose, 10% v/v varme inaktiveret føtal bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat, 1 mg/mL G418 sulfat (f.eks., geneticin), og 100 U/ml penicillin med 100 µg/mL streptomycin (valgfrit). Sterilisere ved filtrering gennem et 0,2 µM porestørrelse membran. G418 sulfat er tilføjet for at sikre plasmid stabilitet i MDCK SIAT1 cellerne.
    2. Forberede MDCK-SIAT1 -cellelinie. I en 162 cm2- vævskultur flask(s) indeholdende 30 mL sterilt celle kultur medier, frø kolber med 2-2,5 x 106 MDCK-SIAT1 celler og der inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 i 2 dage; Dette vil blive brugt til vævskultur infektiøse dosis (TCID) beslutsomhed og MN assays.
      Bemærk: MDCK-SIAT1 celler blev venligst leveret af Dr. M. Matrosovich, Marburg, Tyskland10. Denne cellelinje kan også fås kommercielt (Se Tabel af materialer).
  2. Forberede sterile virus formering medier bruger 500 mL af DMEM høje glukose, 0.3% bovint serumalbumin (BSA) brøkdel V, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 20 mM HEPES. Sterilisere ved filtrering gennem et 0,2 µM porestørrelse membran.
  3. Forberede 0,75% (v/v) marsvin røde blodlegemer (gpRBCs) i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med 0,01 M PBS, ved pH 7,2.
  4. Forberede sterile virus fortyndingsmiddel ved hjælp af DMEM høje glukose, 1% kvæg Albumin brøkdel V (BSA), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 20 mM HEPES. Sterilisere ved filtrering med en 0,2 µm porestørrelse membran, og friske forberede hvert assay.
  5. Forberede kolde celle fiksativ som 80% kolde acetone i PBS (0,01 M PBS, pH 7,2).
  6. Forberede den vaske buffer ved hjælp af PBS (0,01 M PBS pH 7,2) og 0,3% (v/v) tween-20.
  7. Forberede antistof fortyndingsmiddel ved hjælp af PBS (0,01 M PBS, pH 7,2), 0,3% (v/v) tween-20 og 5% fedtfrit tørt mælk.
  8. Brug Anti-influenza A NP mus monoklonalt antistof klon A1 og A3 pool som primære antistof. Fortyndes i antistof fortyndingsmiddel i den optimale koncentration som bestemmes ved titrering.
  9. Brug ged anti-mus IgG konjugeret til hest radise peberrodsperoxidase (HRP) som sekundær antistof. Fortyndes i antistof fortyndingsmiddel i den optimale koncentration som bestemmes ved titrering.
  10. Forberede peroxidase substrat ved hjælp af o- phenylendiamin dihydrochlorid (OPD) i 0,05 M fosfat citratbuffer pH-værdi på 5. Forberede 0,05 M fosfat citratbuffer ved at opløse 1 kapsel/100 mL deioniseret H2O. opløses 1 OPD tablet (10 mg) / 20 mL af fosfat citratbuffer umiddelbart før brug.
  11. Bruge 0,5 M svovlsyre som den OPD stop løsning. Tilføje 28 mL 18 M svovlsyre materiel til 972 mL deioniseret H2O i en kemisk hætte.
  12. Behandling af menneskers og dyrs sera
    1. Varme inaktivere menneskelige sera bruges i MN assays i vandbad på 56 ° C i 30 min før analysen. Anvendes umiddelbart eller kan eventuelt opbevares optøede sera ved 4 ° C i højst 24 timer; eventuelt længere oplagringsperiode gemme sera frosne ved-20 ° C eller koldere.
    2. Behandle dyr sera bruges i MN assays med Receptor ødelægge enzym (RDE) og varme inaktivere før analysen som følger.
      1. Tø sera i vandbad 37 ˚C og derefter placere på is. Mix 1 bind af animalske serumprøven med 3 bind af RDE. Der inkuberes ved 37 ˚C til 18-20 h.
      2. Varme inaktivere RDE behandlet sera på 56 ˚C for 30 min. tilføje 6 bind af PBS, pH 7,2 til hver prøve for en endelige før fortynding på 1:10. Du kan eventuelt gemme optøede sera ved 4 ° C i højst 24 timer; eventuelt længere oplagringsperiode gemme sera frosne ved-20 ° C eller koldere.
        Bemærk: Dyrs sera kan indeholde forskellige sialic syre glycans, som kan binde sig til har influenza-vira og hæmme bindingen af influenza-specifik anti-HA antistoffer. Derfor er det nødvendigt at RDE behandle alle dyr sera før MN assays til at fjerne disse non-specifik viral HA bindemidler i serumprøver.

2. passage af MDCK-SIAT1 cellekultur

Bemærk: Alle cellekulturer skal udføres i en biologisk sikkerhed kabinet til at forhindre forurening.

  1. Dekanteres cellekulturmedium fra celle éncellelag i 162 cm2 kolber. Trypsinize cellerne ved at skylle éncellelag med trypsin-EDTA. Tilføj 5 mL trypsin-EDTA for at dække den celle éncellelag. Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 indtil éncellelag løsner (5-10 min). Tilsættes 15 mL MDCK-SIAT1 celle kultur medier til hver kolbe, som indeholder trypsinized celler, pipetteres op og ned til separate celler.
  2. Bruge en hemocytometer og trypan blå til at bestemme cellen tæller og levedygtighed. Seed celler i nye 162 cm2 vævskultur flasker indeholdende 30 mL af celle kultur medier med 2-2,5 x 106 celler /flask og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 i 2 dage til brug i TCID og MN assays. Seed celler på 4-5 x 106 celler/kolben og der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 i 2 dage til brug i virus formering.
    Bemærk: Den seeding tæthed kan justeres, hvis kortere eller længere kultur perioder er ønsket. Virus formeringsmateriale, celler bør nå over 100% confluency. For vævskultur infektion dosis (TCID) og MN assays skal cellerne på 75-95% confluency (figur 1).

3. overførsel af A(H3N2) virus i MDCK-SIAT1 celler

Bemærk: A(H3N2) virus kan overføres enten i 10-11 dag gamle befrugtede hønes æg efter standard-protokol3eller MDCK-SIAT1 celle kulturer. MDCK-SIAT1 celler bør nå over 100% confluency for virus podning. Viruslagrene frø kan blive podet med flere fortyndinger af inokulum. Inokulum fortyndinger med den bedste høst HA og smitteevne kan bruges til yderligere MN assays.

  1. Fjerne cellekulturmedium fra celle éncellelag (> 100% confluency) i 162 cm2 kolber. Vask éncellelag to gange med 15 mL sterilt 0,01 M PBS, pH 7,2, og dekanteres.
  2. Etiket 1 kolbe som kontrol og tilsættes 20 mL af virus formering medier. Inkuber kolben ved 37 ° C med 5% CO2. Forlade denne kolbe uberørt og bruge til sammenligning efter dag 1 af virus formering.
  3. Der tilsættes 10 mL sterilt virus formering medier til flask(s) og inkuberes alle flask(s) ved 37 ° C, 5% CO2. Optø et hætteglas med influenza virus lager ved stuetemperatur og derefter placere på is. Fortyndes med virus formering medier til target fortyndinger.
    Bemærk: Target fortyndinger kan justeres baseret på HA titers over viruslagrene. For at forberede en 1:1000 fortyndes inokulum, Tilsæt 100 µL af virus til 9,9 mL sterilt virus formering medier. Vend forsigtigt, fjerne 1 mL af 1: 100 til 9 mL sterilt virus formering medier, vend forsigtigt for en 1:1000 fortyndes inokulum. Anbring på is.
  4. Fjerne alle kolber undtagen kontrol kolben fra rugemaskinen. Fjern virus formering medier fra flask(s) af MDCK-SIAT1 celler og podes hver kolbe med 10 mL fortyndet virus. Inkuber kolberne ved 37 ° C, 5% CO2 for 1 h, roterende flask(s) hvert 15 min.
  5. Fjern 5 mL af inokulum fra flask(s) og erstatte med 15 mL virus formering medier indeholdende 1 µg/mL TPCK-trypsin. Inkubér flask(s) ved 37 ° C, 5% CO2 til 16-18 h.
  6. Efter natten inkubation, overholde flask(s) under 100 X mikroskop forstørrelse og ser for cytopatisk effekt (CPE) på cellerne. Fjern 15-17 mL af supernatanten-virus fra flask(s), og erstatte med 15-17 mL af frisklavede virus formering medier indeholdende 2 µg/mL TPCK-trypsin.
  7. Inkuber kolberne ved 37 ° C, 5% CO2. Overvåge CPE af éncellelag (forhold celle kontrol kolbe) og tjekke HA med jævne mellemrum (hver 4 h) med 0,75% gpRBC indtil høsten.
    1. Oprette en HA 96-brønd mikrotiter plade. Tilsæt 50 µL 0,01 M PBS, pH 7,2 til brønde A2 - A12 og B2 - B12 (dubletter), og brønde H1 - H12 for kontrol.
    2. Tilsæt 100 µL af virus supernatanten til A1 og A2, udføre en 2-fold seriel fortynding fra A1 og B1 gennem A12 og B12. Kassér 50 µL efter blanding i A12 og B12. Tilsæt 50 µL af 0,75% gpRBCs til rækkerne A, B og H.
    3. Tryk på pladen og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
      1. Bestemme HA af virus supernatanten ved at vippe 96-brønd mikrotiter pladen på en 45° til 60° vinkel.
      2. Læs plader til hemagglutination; den højeste fortynding af virus, der opnår komplet hemagglutination anses HA titrering slutpunktet for den specifikke virus. Optage den reciprokke værdi af den højeste virus fortynding med komplet hemagglutination som HA titer af virus.
        Bemærk: De udlignede røde blodlegemer i række H (kontrol) bør begynde at "køre" og danner en lille teardrop-form på grund af tyngdekraften. Vent indtil røde blodlegemer i kontrol wells finish Læs kører, så RBC knapper i virussen titrering brønde. Dem, der udviser RBC knapper og "Kør", opnår ikke hemagglutination. Find den største fortynding af virus, der fuldstændig hæmmer hemagglutination som slutpunktet HA titer af virus.
  8. Høste virus når HA af virus kultur plateauer eller virus kultur når mål HA (for eksempel > 16 HAU), men før cellen éncellelag begynder at vise betydelige CPE.
    1. Der centrifugeres virus kultur supernatanten ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C at sammenpresse den celleaffald. Overføre den klarede supernatant indeholdende virus høst til en ren rør. Alikvot supernatanten indeholdende virus høst til engangsbrug sterile kryogene hætteglas og fryse straks ved-70 ° C eller koldere.
      Bemærk: Viruslagrene bruges til MN-assays skal have høj smitsomme titer og minimal defekte partikler. Den mindste fortynding over viruslagrene at opnå 100 TCID50/50 µL til MN assay er 1: 100.
      Bemærk: De virus aktier anvendes i MN assays bør ikke være optøet og genindfrosset.

4. bestemmelse af TCID af Virus

  1. Dag 1: Virus titrering
    1. Optø et hætteglas med virus ved stuetemperatur og umiddelbart sted på is.
    2. Test virus på to forskellige start fortyndinger: 10-2 og 10-3. Tilsættes 100 µL af virus til 9,9 mL virus fortyndingsmiddel for 10-2 fortynding. Tilsættes 1 mL af 10-2 9.0 mL virus fortyndingsmiddel for 10-3 fortynding.
    3. Ved hjælp af to mikrotiter tilføje plader (plade 1 til 10-2 fortynding) og plade 2 til 10-3 fortynding, 100 µL af virus fortyndingsmiddel i alle pladens huller, undtagen i 96-brønd mikrotiter plade i kolonne 1.
    4. Udføre ½log10 fortyndinger (10-2, 10-2.5, 10-3, osv.). Tilføje 146 µL af virussen starter fortynding til alle brønde i kolonne 1 og overføre 46 µL seriefremstillede fra kolonne 1 gennem kolonne 11 (figur 2). Ændre pipette tips mellem brønde. Efter blanding kolonne 11, kassere tips med 46 µL fortynding.
    5. Brug kolonne 12 som celle kontrol (CC); Det indeholder kun virus fortyndingsmiddel. Inkuber i 1 time ved 37 ° C, 5% CO2.
  2. Dag 1: Forberedelse af MDCK-SIAT1 celler
    Bemærk: MDCK-SIAT1 celle éncellelag bør nå 75-95% confluency for TCID og MN assays. Én 162-cm2 kolbe på 95% confluency bør give nok celler til frø ~ 4-5 mikrotiter plader.
    1. Vask 75-95% sammenflydende éncellelag med 20 mL PBS til at fjerne FBS i kultur medier. Trypsinize cellerne som følger.
      1. Skyl éncellelag med steril PBS, tilføje 7 mL trypsin-EDTA for at dække den celle éncellelag. Lægge kolben flade og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 indtil éncellelag løsner (ca 5-10 min). 7 mL virus fortynder tilsættes til hver kolbe, som indeholder de trypsinized celler.
    2. Cellerne vaskes med virus fortyndingsmiddel, der skal fjerne FBS.
      1. Forsigtigt pipetteres op og ned for at adskille cellerne. Overføre cellerne til en 50 mL konisk slange; Fyld glasset med virus fortyndingsmiddel.
      2. Der centrifugeres ved 485 x g i 5 min. Decant virus fortyndingsmiddel, erstatte med frisk 50 mL virus fortyndingsmiddel, og centrifugeres ved 485 x g i 5 min. Decant virus fortyndingsmiddel og erstatte med frisk virus fortyndingsmiddel (10 mL/kolbe) til resuspenderes.
    3. Bruge en hemocytometer og trypan blå for at bestemme celletal og levedygtighed. Justere den celle koncentration med virussen fortynder til 1.5 x 105 celler/mL.
    4. Tilsæt 100 µL fortyndede celler, MDCK-SIAT1 til hver brønd af mikrotiter plader (1.5 x 104 celler/brønd) og dække pladerne. Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 til 18-20 h.
  3. Dag 2: ELISA
    1. Fiksering af celler
      1. Fjern mediet fra mikrotiter plader. Vask hver godt med 200 µL af PBS. Tilsæt 300 µL koldt 80% acetone til hver brønd og Inkuber ved stuetemperatur i 10 min. Fjern fiksativ og tillade plader til luft tørre.
    2. ELISA
      1. Primære antistof tilsætning
        Bemærk: Anti-influenza A NP monoklonalt antistof bør anvendes i overskud som de primære antistof i ELISA. Bestemme den optimale antistof fortynding for hvert parti af primære antistoffer ved at udføre antistof titreringer i MN. Vælg den primære antistof koncentration, som er i overskud og med det bedste signal til baggrunden ratio.
        1. Fortyndes Anti-influenza A NP monoklonalt antistof (primære antistof) til koncentrationen af målet i antistof fortyndingsmiddel (f.eks. tilføje 30 µL af primære antistof til 30 mL af antistof fortyndingsmiddel for en target fortynding af 1:1000).
        2. Vask plader 3 gange med 300 µL af wash buffer. Tilsæt 100 µL fortyndede primære antistof til hver brønd. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
      2. Sekundær antistof tilsætning
        Bemærk: Ged anti mus IgG konjugeret til peberrodspulver peberrodsperoxidase (HRP) bør anvendes i overskud som den sekundære antistof i ELISA. Bestemme den optimale antistof fortynding for hvert parti af sekundære antistoffer ved at udføre antistof titreringer. Vælg den sekundære antistof koncentration i overskud og med det bedste signal til baggrunden ratio.
        1. Fortyndes ged anti-musen IgG konjugeret med HRP antistof (sekundær antistof) til target koncentration i antistof fortyndingsmiddel (f.eks. tilføje 7.5 µL af sekundær antistof til 30 mL af antistof fortyndingsmiddel for en target 1:4000 fortynding).
        2. Vaske pladerne 3 gange med 300 µL wash buffer. Tilsæt 100 µL fortyndede sekundær antistof til hver brønd. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
      3. Substrat tilsætning og plade læsning
        1. Vaske pladerne 5 gange med 300 µL wash buffer og tap på en fnugfri serviet.
        2. Tilsæt 100 µL af frisk tilberedte substrater til hver brønd og Inkuber ved stuetemperatur indtil farveudviklingen mættede fedtsyrer og ekstinktion (OD) af celle kontrolhullerne < 0,2.
        3. Tilsættes 100 µL stopopløsning til alle pladens huller. Læs OD af brønde på 490 nm med en mikrotiterplade Spektrofotometer.
  4. TCID 50 beregning
    1. Beregne den mediane OD490 celle kontrol (kolonne 12).
    2. Overveje enhver test godt med en OD490 større end to gange medianen OD490 af CC brønde som "positive"; ellers, det er betragtet som "negative".
    3. Beregn TCID50 af virus ved hjælp af Reed-Muench metode13.
      1. Bestem antallet af positiver og negativer på hver fortynding.
      2. Beregne "kumulativ positive", "Kumulativ negative", "Ratio" og "% positive" som illustreret i tabel 1.
      3. Beregne "proportional afstanden" mellem fortynding viser > 50% positiver og fortynding viser < 50% positive ved hjælp af følgende:
        Equation 1
        Bemærk: Korrektionsfaktoren for ½ log fortynding er 0,5. For eksempel i tabel 1: (80 − 50) /(80 − 20) x 0,5 = 0,25
      4. Beregne virussen TCID50 ved at tilføje den proportionelle afstand til fortynding viser > 50% positive.
        Bemærk: For eksempel, i tabel 2, TCID50 er 10-5+(-0.25) = 10-5.25. Bemærk dette er TCID50 af virus pr. 100 µL (eller 10-5.25/100 µL).
    4. Beregne virus fortyndingen. MN assays, fortyndet virus til 200 TCID50/100 µL (svarende til 100 TCID50/50 µL pr. brønd).
      Bemærk: I eksemplet i tabel 1, er 1 TCID50 10-5.25 i 100 µL, og fortynding at opnå 200 TCID50/100 µL er 1:891 baseret på beregningerne: 200 x 10-5.25 = 10-2.95 = 1/102,95 = 1 / 891

5. MN analyse ved hjælp af MDCK-SIAT1 celler

  1. Dag 1: Test og kontrol sera forberedelse og plade layout
    1. Tø sera i 37 ° C vandbad og fjerne umiddelbart efter optøning. Alikvot mængde af sera, der skal testes; et minimum af 10 µL af oprindelige sera er nødvendig for at teste med en virus i singlet. Teste sera i dubletter, hvis muligt.
    2. Varme inaktivere de menneskelige sera i 30 min. i en 56 ° C vandbad i trin 1.12.1. Sted sera på is post varme inaktivering, tilføje virus fortyndingsmiddel til sera at opnå en 1:10 før fortynding.
    3. RDE behandle og pre fortyndes animalske sera til 1:10 til brug for kontrol pr. 1.12.2.
      Bemærk: Optøede og behandlede menneskers og dyrs sera kan opbevares ved 4 ° C, for ikke længere end 24 h. Sera skal opbevares frosset ved-20 ° C eller koldere hvis længere oplagringsperioden er nødvendig forud for analysen.
    4. For at teste med en virus, tilføje 100 µL 1:10 fortyndet sera til kolonner A1 til A10 (figur 4). Tilføje 50 µL af virus fortynder til rækker B gennem H, undtagen kolonner, 11 og 12 (figur 4). Udføre en 2-fold seriel fortynding fra rækker A til H, og skille sig af med de sidste 50 µL på række H (figur 4).
      Bemærk: Når flere vira der skal testes, sera kan fortyndes i titer rør. Fortynding af serum, for formålet med bestemmelse af serum titer, i godt A er 1:10, samt B 1:20, godt C 1:40, godt D 1:80, godt E 1: 160, godt F 1:320, godt G 1:640, godt H 1:1,280 (figur 4).
    5. For virus kontrol, tilføje 50 µL virus fortyndingsvæske brønde A12, B12, C12 og D12 (ingen sera). For celle kontrol, tilføje 100 µL af virus fortyndingsmiddel brønde E12, F12, G12 og H12 (ingen virus, intet sera).
    6. Kontrol sera (f.eks ilder sera kontrol), tilføje 100 µL fortyndede kontrol sera til godt en kolonne 11 og tilsæt 50 µL af virus fortyndingsmiddel brønde B11 - H11. Seriel fortyndet ned.
    7. Dække pladerne, der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 indtil klar for virus tilsætning.
  2. Dag 1: Virus tilsætning
    1. Fortyndet virus til 100 TCID50/50 µL med virus fortyndingsmiddel.
    2. Tilføje 50 µL fortyndet virus i alle pladens huller, undtagen kolonnen 11 tilbage titrering (BT) plader og celle-kontrolhullerne E12, F12, G12 og H12, på alle plader (figur 4). Disse plader med kontrol sera på kolonne 11, tilføje virus til kolonne 11.
    3. Tilbage titrering (BT)
      1. Omfatte en BT i kolonne 11 af ét sæt af dobbelte plader (for eksempel, pladen 1A og 1B). Tilføje 50 µL af virus fortynder til alle brønde i kolonne 11. Tilføje 50 µL af virus på 100 TCID50/50 µL til den første brønd (A11). Mix af pipettering op og ned.
      2. Bland og overføre 50 µL successive brønde til at udføre 2-fold serielle fortyndinger. Ændre pipette tips mellem brønde til at undgå virus fremførsel. Kassér 50 µL fra godt H11.
      3. Tilsæt 50 µL af virus fortynder til kolonne 11 til at bringe det endelige rumfang på 100 µL. Tryk plader til at blande.
    4. Inkuber plader ved 37 ° C, 5% CO2 for 1 h.
    5. Udføre MDCK-SIAT1 celle ud på dag 1 og ELISA på dag 2 som beskrevet i trin 4.2 og 4.3 (også beskrevet i punkt 5.3 og 5.4)
  3. Dag 1: MDCK-SIAT1 celle tilsætning
    1. Forberede MDCK-SIAT1 celler som beskrevet i trin 4.2. Tilsæt 100 µL MDCK-SIAT1 celler på 1.5 x 105 celler/mL til hver brønd (1.5 x 104 celler/brønd). Inkuber plader ved 37 ° C, 5% CO2 til 18-20 h.
  4. Dag 2: ELISA
    1. Efter natten inkubation, den anden dag, skal du lave cellerne med 80% kolde acetone, som beskrevet i trin 4.3.
    2. Primære antistof tilsætning
      1. Vaske pladerne 3 gange med 300 µL wash buffer. Fortyndes Anti-influenza A NP monoklonalt antistof (primære antistof) til den optimale koncentration som bestemt ved titrering i antistof fortyndingsmiddel (f.eks. tilføje 30 µL af primære antistof til 30 mL af antistof fortyndingsmiddel for en target fortynding af 1:1000).
        Bemærk: 100 µL af primære antistof er nødvendig pr. brønd. ~ 10 mL kræves pr. plade.
      2. Tilsæt 100 µL fortyndede primære antistof til hver brønd. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
    3. Sekundær antistof tilsætning
      1. Vask plader 3 gange med 300 µL wash buffer. Fortynd ged anti mus IgG konjugeret med HRP antistof (sekundær antistof) til koncentrationen af målet i antistof fortyndingsmiddel (f.eks. tilføje 7.5 µL af sekundær antistof til 30 mL af antistof fortyndingsmiddel for en target 1:4000.)
        Bemærk: 100 µL af sekundær antistof er nødvendig pr. 96 godt. ~ 10 mL kræves pr. plade.
      2. Tilsæt 100 µL fortyndede sekundær antistof til hver brønd. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
    4. Substrat tilsætning og plade læsning
      1. Vaske pladerne 5 gange med 300 µL wash buffer og tap på fnugfri serviet.
      2. Tilsæt 100 µL af frisk tilberedte substrater til hver brønd og Inkuber ved stuetemperatur indtil virus-kontrolhullerne nå en OD490 = 0,8 - 3, med den celle kontrol på et lavt baggrund OD490 < 0,2.
      3. Tilføje 100 µL af stop-løsning til alle brønde. Læs OD af brønde på 490 nm med en mikrotiterplade Spektrofotometer.
  5. Dataanalyse
    NOTE: Beregningerne af MN bestemmes for hver plade individuelt.
    1. Bestemme neutraliserende antistof titer af hver serumprøven.
      1. Beregne OD490 cut-off af 50% virus neutralisering for hver plade ved hjælp af følgende ligning:
        Equation 2
        Bemærk: Her x = 50% af neutralisering cut-off. Den gensidige serumfortynding svarende til den højeste fortynding med OD490 anses mindre end 50% af cut-off (≥50% hæmning) for neutralisering antistof titer for at serumprøven (figur 5).
    2. Kontroller, at celle-kontrolhullerne har en OD490 < 0,2 og virus-kontrolhullerne har en OD490 = 0,8 - 3.
    3. Kontroller virus infektivitetsniveauet i hvert assay (100 x TCID50) af virus BT. det acceptable område af BT er 50, 100 eller 200 TCID. Hvis du bruger den samme cut-off, som defineret i trin 4.4.2, bør den højeste virus fortynding i kolonnen BT med OD over cut-off i wells E11, F11, G11.
      Bemærk: Serum positive kontroller bør give titers inden for 2-fold af de værdier, der er opnået i de tidligere undersøgelser. OD490 af negativt serumkontrol bør svare til den konstaterede for virus kontrol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bestemmelse af smitteevne af virus bestande er det første skridt i MN assay. Figur 2 illustrerer plade layout for at bestemme TCID50 af virus bestande. For viruslagrene med ukendt smitteevne, kan virus være titreres fra flere præ fortyndinger, for eksempel både 10-2 og 10-3, for at fange de bedste titreringskurven for at beregne smitteevne af virus. Den virus mængde anvendes i MN assay bør være standardiseret til 100 TCID50/well (50 µL). Den mindste fortynding af virus bestande til at opnå en 100 TCID50/godt er 1: 100.


Figur 3 beskriver de kritiske faser af en MN analyse ved hjælp af MDCK-SIAT1 celler. Varme-inaktiverede sera er serie-fortyndet i 96-brønd plader som illustreret i figur 4. 100 TCID50/50 µL virus føjes derefter til hver brønd. Efter 1 h inkubation tillade antistoffet i sera binder sig til virus, 100 µL af 1.5 x 105 celler/mL af MDCK-SIAT1 celler føjes til hver brønd. For optimale resultater bør MDCK-SIAT1 celler på 75-95% confluency (figur 1) for både TCID50 og MN assays. Pladerne er derefter inkuberes i 18-20 timer ved 37 ° C, 5% CO2. Efter natten inkubation, er mængden af virus i hver brønd påvises og kvantificeres ved en anti-influenza A NP ELISA (figur 3).

OD i hver repræsenterer godt mængden af virusinfektion og replikering i MDCK-SIAT1 celler i seriefremstillede fortyndet sera indeholdende neutraliserende antistoffer. Det kan afbildes mod sera fortyndinger (figur 5). Den reciprokke værdi af den højeste serumfortynding, der opnåede ≥50% neutralisering anses antistof titer for serumprøven. Figur 5 viser eksempler på resultater fra 2 patienter med parret sera testet mod A/HongKong/4801/2014 A(H3N2) 3C.2a virus før og efter influenza vaccination. Med patient 1 før vaccination sera, ingen af sera fortyndinger hæmmede virusinfektion (figur 5, lys blå kurve) og derfor anses for negativ (< 10). Derimod hæmmede efter vaccination sera fra denne patient virus replikering, der angiver vaccination induceret neutraliserende antistoffer. Den tredje fortynding af denne sera er den stoerste fortynding under 50% cut-off, således denne patient har en efter vaccination titer af 40 (figur 5, mørk blå kurve). Til sammenligning indeholder serum fra den anden patient før vaccination, præ-eksisterende neutraliserende antistoffer på en titer på 320. Efter vaccination, forhøjet titer til > 1,280. I dette tilfælde på en 1:10 før fortynding af serum, ingen antistof ende titer blev opnået. Serum bør testes igen på en højere før fortynding for at nå slutningen titer.

Figure 1
Figur 1 . MDCK-SIAT1 cellekultur. MDCK-SIAT1 celler. (A) MDCK-SIAT1 sammenflydende éncellelag (> 100% confluency) til virus podning; (B) MDCK-SIAT1 celler på log fase med 75-95% confluency TCID50 og MN assays.

Figure 2
Figur 2 . TCID plade layout. Virus smitteevne bestemmes af TCID50. Virus bestand er forud fortyndet til 10-2og derefter seriefremstillede fortyndes på en ½ log pr. fortynding til 10-7 (kolonne 1-11), på 8 gentagelser pr. fortynding (række A -H). Kolonnen 12 bruges som celle kun kontrol. TCID50 af virus bestanden kan beregnes ved hjælp af metoden Reed-Muench.

Figure 3
Figur 3 . Skematisk af MN analysen ved hjælp af MDCK-SIAT1 celler. 50 µL af varme-inaktiverede sera er seriefremstillede 2-fold fortyndet i 96-brønde plader. 50 µL af 100 TCID50 A(H3N2) virus føjes derefter til hver brønd. Pladerne inkuberes ved 37 ° C i 1 time at give bindende af virus og antistof. Derefter 1.5 x 104 MDCK-SIAT1 celler føjes til hver brønd. Pladerne inkuberes i 18-20 timer ved 37 ° C, 5% CO2. Efter natten inkubation, plader er vasket og fast, mængden virus i hver brønd er kvantificeret ved en ELISA ved hjælp af anti-influenza A NP monoklonale antistoffer. Sera antistof titers er beregnet baseret på cut-offs defineret af virus kontrol og celle kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . MN assay plade layout. Varme-inaktiverede sera fortyndes pre 1:10, derefter seriefremstillede 2-fold fortyndet i 96-brønd plader i kolonne 1-10. Virus kontrol (virus og celler kun, ingen sera) og celle kontrol (celler kun, ingen virus og ingen sera) er i kolonne 12. Kolonne 11 bruges til tilbage titrering eller kontrol sera. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . MN assay resultater af menneskelig sera testet mod A/HongKong/4801/2014 A(H3N2) virus ved hjælp af MDCK-SIAT1 celler. Sera fra to patienter præ- og post-2016-17 sæsonbestemt influenzavaccination blev testet mod A/HongKong/4801/2014 A(H3N2) virus ved hjælp af MDCK-SIAT1 celler. Neutralisering titers er den reciprokke værdi af den højeste serumfortynding, der opnår ≥50% virus neutralisering, som er angivet med pile på hver kurve. Patient 1: før vaccination titer < 10, efter vaccination titer 40; patienternes 2:pre-vaccination titer 320, efter vaccination titer > 1,280.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MN-analysen er en af de vigtigste assays anvendes til influenza serologi til påvisning af antistof svar efter influenza-infektion eller vaccination. Titers genereret fra MN assays er ofte brugt som det primære resultat af mange influenza seroepidemiology undersøgelser. MN assays er også almindeligt brugt til sero-diagnose, og evalueringen af vaccine immunogenicitet. Internationale Inter lab undersøgelser er blevet gennemført for at sammenligne MN assays udføres i flere laboratorier14.

I modsætning til HI, er MN assay beregnet til direkte måling funktionelle antistoffer, der kan neutralisere virusinfektion i cellekultur. Der er forskellige former for MN assays anvendes i feltet laboratorier rundt om i verden. Udlæsning af assays (dvs., reduktion af virus infektivitetsniveauet i overværelse af neutraliserende antistoffer) kan være baseret på ELISA kvantificering af virus NP antistoffer, HA kvantificering af virus, eller immuno-farvning af virus plaques i hver brønd følgende virusinfektion antistoffer og inkubation i celle kulturer14,15. Forskellige former for fluorescerende-baserede plaque reduktion neutralisering assays (fx, fokus reduktion assays og ViroSpot assays) bruges ofte til antigenkarakterisering af stort antal influenza felt isolater, dels på grund af den lave virus beløb, der kræves i disse undersøgelser,15,16. Til karakterisering af antistof svar til influenza i humant serum, 2-dages ELISA baseret MN assay er anbefalet af World Health Organization (WHO) globale influenza overvågningsnet for serologiske diagnosticering af influenza3. Denne metode er også almindeligt anvendt i sero-epidemiologi undersøgelser og evaluering af antistof svar efter vaccination mod influenza. Det registrerer primært antistoffer mod influenza HA overflade proteiner og derfor kan påvise funktionelle stamme-specifikke antistoffer.

Her beskriver vi en 2-dages ELISA-baserede MN assay, der udnytter MDCK-SIAT1 celler. Denne analyse er optimeret for neutraliserende antistoffer til moderne A(H3N2) vira i menneskelige sera. Flere kritiske trin bør overvejes, når udfører MN-undersøgelser, ved hjælp af MDCK-SIAT1 celler. Første, MDCK-SIAT1 celler skal være passaged i kultur medier indeholdende G418 sulfat for at opretholde stabiliteten i den menneskelige αSIAT1 cDNA i cellelinie. G418 sulfat (fx, geneticin) er ikke påkrævet i medierne under virus formering og MN-undersøgelser, ved hjælp af MDCK-SIAT1 celler. Celler, der bruges i MN assays skal på log vækstfase med 75-95% confluency. Andet, god viruslagrene er nødvendig for at gennemføre vellykkede MN assays. Viruslagrene bør have høj smitteevne som målt ved TCID50 titrering og et minimum af defekte partikler. Den mindste fortynding over viruslagrene at opnå 100 TCID50/godt virus bør være lig med eller større end 1: 100. Selv om både æg og celle passaged virus kan anvendes i MN assays, MDCK-SIAT1 cellelinje fastholder bedre genetiske stabilitet formeringsmateriale fra 3C.2a og 3C.3a A(H3N2) vira7. Efter virus formering, bør blive sekventeret HA og NA gener af virus lagre for at sikre, at ingen æg eller celle kultur tilpasset mutationer er indført på centrale antigene websteder, der kan forårsage ændringer i antigenicity af den virus, som benyttes i analysen. For det tredje mængden af smitsomme virus, som benyttes i hvert assay bør omhyggeligt titreres, og verificeret med inddragelse af en ryg titrering for hver virus i hvert assay. For meget virus, som benyttes i analysen kan sænke antistof titers opdaget og reducere følsomheden af analysen. Ligeledes, for lidt virus, som benyttes i analysen vil forårsage svage VC signaler og høj baggrunde (CC) og falske positive resultater. Det er således vigtigt at medtage passende positive og negative kontrol sera i assays til at overvåge ydeevne. Når man sammenligner antistof svar til flere vira ved hjælp af de samme sera, er det afgørende at sikre, at tilbage titreringer af alle vira er inden for et acceptabelt interval.

MN analysen ved hjælp af MDCK-SIAT1 celler er følsom og specifik påvisning af antistof svar til moderne 3C.2a og 3C.3a A(H3N2) influenzavirus i menneskelige sera, herunder antigent gled A(H3N2) virus6. Denne analyse har været anvendt til at evaluere vaccinerede menneskelige sera paneler til 3C.2a og 3C.3a A(H3N2) virus efter inaktiveret influenza vaccination5,17,18. Imidlertid har influenza virus fortsætte med at erhverve mutationer, der kan ændre antigenicity og receptor bindende egenskaber af virus og forårsage antigene drift, løbende indsats for at optimere eksisterende influenza serologi assays for at opretholde følsomhed og specificitet skal karakterisere nye spirende influenzavirus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapportere nogen interessekonflikt. Resultater og konklusioner i denne publikation er dem af forfatterne og nødvendigvis repræsenterer ikke udsigt over Centers for Disease Control og forebyggelse og den bevilgende myndighed.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu og Ms. Ashley Burroughs fra Influenza Division af CDC for deres kritiske review og assistance i forberedelsen af dette manuskript. Vi takker Dr. Adrian Reber fra Influenza Division af CDC for sin bistand til forberedelse grafik af figur 3. Endelig vil takke vi Dr. M. Matrosovich, Marburg, Tyskland for at give MDCK-SIAT1 celler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose Life Science 11965 A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30070.03
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free Sigma-Aldrich 3117332001
L-Glutamine Life Science 25030-081
Sodium pyruvate Life Science 11360-070
Geneticin G-418 disulfate salt  Sigma-Aldrich A1720-5G  
HEPES Life Science 15630-080
Penicillin/Streptomycin Life Science 15140-122
Acetone VWR 67-64-1 Used at an 80% concentration
Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate  Sigma-Aldrich SLBF2806V
O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet Sigma-Aldrich SLBQ1086V 1 tablet per 100ml of cell culture grade water
Sulfuric Acid Fisher Scientific A510-P500 Used 0.5M final concentration
Ethanol, Denatured, 4L VWR EM-AX0422-3 Used at an 70% concentration
Trypsin-EDTA Life Science 1748048
RDE II "Seiken" Denka Seiken 370013
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379-500ml
Anti-NP mouse monoclonal Ab Millipore pool MAB 8257 MAB 8258
Anti-mouse IgG HRP  KPL 074-1802
96-well flat-bottom plates Thermo Scientific 3455
Plate reader Molecular Device Spectromax 384 plus
Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap Corning/VWR 3151

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
  2. Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against influenza infection in humans--on the path to a universal vaccine? Curr Opin in Immunol. 25, 470-476 (2013).
  3. WHO Global Influenza Surveillance Network. Manual for the labratory diagnosis and virological surveillence of influenza. , http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548090_eng.pdf (2011).
  4. Govorkova, E. A., Kodihalli, S., Alymova, I. V., Fanget, B., Webster, R. G. Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs. Dev Biological Stand. 98, discussion 73-34 39-51 (1999).
  5. WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the northern hemisphere influenza season. , http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/201703_recommendation.pdf?ua=1 2017-2018 (2017).
  6. Levine, M. Z., et al. Neutralizing Antibody Responses to Antigenically Drifted Influenza A(H3N2) Viruses among Children and Adolescents following 2014-2015 Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccination. Clin Vaccine Immunol : CVI. 23, 831-839 (2016).
  7. Lin, Y., et al. The characteristics and antigenic properties of recently emerged subclade 3C.3a and 3C.2a human influenza A(H3N2) viruses passaged in MDCK cells. Influenza Other Respir Viruses. , (2017).
  8. Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment? J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).
  9. Skowronski, D. M., et al. Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses. Euro Surveillance. 21, 30112 (2016).
  10. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).
  11. Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells. J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).
  12. US Department of Health and Human Services. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).
  13. Reed, H. M. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (1938).
  14. Laurie, K. L., et al. International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE. Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).
  15. Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay. J Vis Exp : JoVE. , (2016).
  16. van Baalen, C. A., et al. ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses. Vaccine. 35, 46-52 (2017).
  17. WHO. Recommended composition of infleunza virus vaccines for use in the 2015-2016 northern heamisphere infleunza season. , http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2015_16_north/en 2015-2016 (2015).
  18. WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2016-2017 northern hemisphere influenza season. , http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/201602_recommendation.pdf?ua=1 2016-2017 (2016).

Tags

Infektionssygdomme sag 129 A(H3N2) influenza virus MDCK-SIAT1 microneutralization TCID neutraliserende antistof immunitet
Måling af Influenza neutraliserende antistof svar til A(H3N2) virus i menneskelige Sera af Microneutralization undersøgelser, som ved hjælp af MDCK-SIAT1 celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gross, F. L., Bai, Y., Jefferson,… More

Gross, F. L., Bai, Y., Jefferson, S., Holiday, C., Levine, M. Z. Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells. J. Vis. Exp. (129), e56448, doi:10.3791/56448 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter