Summary
Inzicht in de functie van essentiële processen bij bacteriën is uitdagend. Fluorescentie microscopie met doelgroepen gerichte kleurstoffen kan belangrijke inzicht verwerven in de cel van de microbiële groei en celcyclus progressie. Hier, wordt Agrobacterium tumefaciens gebruikt als een model bacterie Markeer methoden voor levende cellen imaging voor karakterisering van essentiële processen.
Abstract
Core cellulaire processen zoals DNA-replicatie en segregatie, eiwitsynthese celwand biosynthese en celdeling, is afhankelijk van de functie van eiwitten die essentieel voor bacteriële overleven zijn. Een aantal doelgroepen gerichte kleurstoffen kan als sondes beter deze processen begrijpen worden gebruikt. Kleuring met lipofiele kleurstoffen kan de observatie van de membraan structuur, visualisatie van lipide-microdomains, en detectie van membraan blebs. Gebruik van TL-d-aminozuren (FDAAs) om de sites van peptidoglycaan biosynthese sonde kan duiden op mogelijke gebreken in de celwand biogenese of cel groei patronen. Ten slotte kunnen nucleïnezuur vlekken aangeven mogelijke defecten in DNA replicatie of chromosoom segregatie. Cyanine DNA vlekken label levende cellen en zijn geschikt voor time-lapse microscopie real-time waarnemingen van nucleoïde morfologie inschakelen tijdens celgroei. Protocollen voor het labelen van de cel kunnen worden toegepast op eiwit uitputting mutanten te identificeren van de gebreken in de membraan structuur, celwand biogenese of chromosoom segregatie. Bovendien kan time-lapse microscopie worden gebruikt om te controleren van morfologische veranderingen zoals een essentieel eiwit wordt verwijderd en extra verwerven in eiwitfunctie inzicht kan. Bijvoorbeeld, resulteert de uitputting van essentiële celdeling eiwitten in filamentation of vertakking, overwegende dat de uitputting van de cel groei eiwitten cellen tot kortere of ronder kan veroorzaken. Protocollen voor celgroei doelgroepen gerichte labeling en time-lapse microscopie vindt u hier, voor de bacteriële plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Samen, doelgroepen gerichte kleurstoffen en time-lapse microscopie inschakelen karakterisering van essentiële processen in A. tumefaciens. Tot slot, de protocollen die gemakkelijk kunnen worden aangepast voor sonde essentiële processen in andere bacteriën.
Introduction
Progressie door de bacteriële cel cyclus moet de coördinatie van de vele processen met inbegrip membraan en een celwand biosynthese, DNA-replicatie en segregatie en celdeling. Om volledig te begrijpen de complexiteit van de bacteriële celbiologie, is het noodzakelijk om te studeren van deze essentiële activiteiten; Dit is echter een niet-triviale taak omdat de levensvatbaarheid van de cellen in het gedrang komt wanneer essentiële onderdelen van deze trajecten zijn mutagenized. Epifluorescence microscopie in combinatie met doelgroepen gerichte kleurstoffen is een krachtige aanpak van deze essentiële processen in wildtype en mutant bacteriestammen sonde.
Peptidoglycaan-specifieke kleurstoffen zijn fluorescerende antibiotica (vancomycine-FL, bocillin-FL) en TL-d-aminozuren (bijvoorbeeld. 7-hydroxycoumarin-3-carboxylic acid-3-amino-d-alanine, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanine , NADA; tetramethylrhodamine-3-amino-d-alanine; TADA). Bij gram-positieve bacteriën, het gebruik van subletale concentraties van fluorescerend antibioticum analogen sonde sites van peptidoglycaan biosynthese heeft een effectieve strategie geweest om te onthullen peptidoglycaan invoeging patronen1,2, 3,4. Terwijl inzichten te krijgen in het peptidoglycaan invoeging patronen in vaste gram-negatieve bacteriën5TL vancomycine labeling is gebruikt, geeft de buitenmembraan in het algemeen een permeabiliteit barrière die voorkomt het gebruik van TL dat antibiotica als een sonde voor peptidoglycaan biosynthese in levende cellen. In tegenstelling, label korte pulsen van TL-d-aminozuren of d-aminozuren met biorthogonal functionele groepen covalent regio's van recente peptidoglycaan opneming in een breed scala van levende bacteriecellen6,7. Patronen van peptidoglycaan invoegen die zijn waargenomen met synthetische d-aminozuren bevatten punctate en septal (Escherichia coli en Bacillus subtilis), polaire en septal (Agrobacterium tumefaciens en Listeria monocytogenes), septal enige (Staphylococcus aureus) en apicaal (Streptomyces venezuelae)6,7. Deze opmerkingen aangeven dat bacteriën uiteenlopende patronen van biogenese van de celwand vertonen en dat het gebruik van synthetische d-aminozuren als sondes voor de behandeling van de groei patronen een kostbare strategie in veel bacteriën is.
Kleurstoffen die label bacteriële chromosomen bevatten de deoxyribonucleic acid (DNA) specifieke kleine groef binder (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) en hoge affiniteit cyanine kleurstoffen (groen en oranje; overzicht van de materialen). DAPI kleuring van vaste cellen helpt in opsomming van bacteriën van milieu monsters8, terwijl DAPI kleuring van levende cellen wordt gebruikt om aan te geven van bacteriële levensvatbaarheid9. In tegenstelling, kleurstoffen cyanine zoals oranje en groen worden vaak beschreven als de impermeant "dode" cel membraan vlekken bij het inventariseren van niet-levensvatbare cellen9. Opmerkelijk is wanneer deze reagentia worden gebruikt om de morfologie van het bacteriële nucleoïde tijdens de celgroei sonde, waren DAPI, oranje en groen alle aangetoond membraan permeant en geschikt voor het labelen van levende cellen10. In levende cellen van de E. coli , diffuus als gevolg van auto-fluorescentie DAPI kleuring van DNA blijkt uit het cytoplasma en herhaalde blootstelling aan DAPI gebeitste cellen aan het ultraviolette (UV) licht ten de nucleoïde structuur10. Kleuring van E. coli of B. subtilis met oranje blijkt dat deze kleurstof membraan permeant is en langdurige fluorescentie op bindende aan DNA in levende cellen biedt zonder de beïnvloedende celgroei, DNA-replicatie of chromosoom segregatie10 . Deze opmerkingen suggereren dat cyanine DNA kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor het bewaken van de morfologie van nucleoids tijdens de celgroei bij vele bacteriën.
Phospholipid-specific stryl kleurstoffen zoals N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (4-64; Zie materialen lijst) kationogene stoffen zijn en bij voorkeur associëren met negatief geladen fosfolipiden zoals cardiolipin en phosphatidylglycerol11. Verschillende patronen worden waargenomen wanneer 4-64 wordt gebruikt voor het label van de membraan van verschillende bacteriën. Bij Escherichia coli, 4-64 is verrijkt met de palen, in banden langs de laterale muur, en in de divisie sites laat pre-divisional cellen12. Bacillus subtiliskunt 4-64 labelen de visualisatie van lipide spiralen13. Agrobacterium tumefaciens, 4-64 etiketten de buitenmembraan en wordt waargenomen in een patroon van de karakteristieke "hoefijzer" waarin de groei paal is verstoken van labeling14,15. Deze opmerkingen geven aan dat deze bacteriën vertonen heterogene lipide distributies als gevolg van de aanwezigheid van lipide-domeinen die tot cellulaire asymmetrie bijdragen. Veranderingen in 4-64 labeling patronen zoals de aanwezigheid van diffuse labeling, blebs of blaasjes, invaginations of krimp van het membraan kan worden informatieve in karakterisering van mutanten die van invloed zijn de distributie of de biosynthese van lipiden.
Verder dan kleuring cellen, is de functie van eiwitten deelnemen aan essentiële processen bepalen nodig. De karakterisering van essentiële eiwitten is technisch uitdagend, want het is niet mogelijk om te verwijderen van essentiële genen en de fenotypische gevolgen bestuderen. Dus, alternatieve benaderingen die de eiwitten afbreken naar voren zijn gekomen. Bijvoorbeeld, kan een essentiële gen worden gebracht onder de controle van een afleidbare promotor in plaats van zijn eigen promotor. Afleidbare initiatiefnemers zijn inspelen op kleine molecules zoals; 16, isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, arabinose22, vanillate17,23, van zink xylose23, dus de transcriptie van het target-gen ophoudt en de proteïne van belang is uitgeput wanneer de inductor wordt verwijderd. Alternatieve benaderingen voor het afbreken van essentiële eiwitten van belang omvatten synthetische riboswitches24 die kleine molecuul-RNA interacties kunt belemmeren transcriptie van doelgenen, CRISPR interferentie25,26 naar blok transcriptie van doelgenen en afleidbare eiwit afbraak27,28 die gebruikmaakt van peptide tags aan target eiwitten voor aantasting door het ClpXP protease. Uitputting stammen bieden slechts een korte tijd voor karakterisering voordat de cellen verliezen levensvatbaarheid, microscopische beeldvorming van cellen na verloop van tijd tijdens eiwit uitputting is daarom een krachtige aanpak voor karakterisering. Inderdaad, microscopie van levende bacteriecellen onderzoekers inzichten te krijgen in de fundamentele biologische processen, met inbegrip van de mechanismen van de cel vorm onderhoud, secretie en compartimentering29in staat heeft gesteld.
A. tumefaciens is een bacteriële plant pathogen30 en natuurlijke genetische ingenieur31,32. Dus, mechanismen met betrekking tot pathogeniteit, inbegrepen, gastheer-pathogeen interacties33,34,35, secretie36en host transformatie30,31, 37 uitgebreid zijn onderzocht. Voor het ontwerpen van strategieën die A. tumefaciens gemedieerde ziekte te voorkomen of te verbeteren plant transformatie, moeten de processen essentieel voor overleving van A. tumefaciens beter worden begrepen. Het gebruik van doelgroepen gerichte kleurstoffen en de recente ontwikkeling van een strategie van de uitputting eiwit voor A. tumefaciens18 biedt een manier om te onderzoeken van essentiële processen.
Hier vindt u gedetailleerde protocollen voor microscopische analyse van wildtype, mutant en eiwit uitputting stammen van A. tumefaciens . De eerste twee protocollen beschrijven hoe te bereiden cellen en hen label met doelgroepen gerichte kleurstoffen. Het derde protocol biedt stapsgewijze aanwijzingen voor agarose pads (Figuur 1) voorbereiding en beeldvorming van de bacteriële cellen (Figuur 2, Figuur 3, , Figuur 4). Deze protocollen mogelijk ook geschikt voor andere bacteriën met extra aanpassingen ter verantwoording voor verschillende media voorwaarden, groeicijfers, zuurstof eisen en structuren van de cel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. groei van A. tumefaciens stammen
-
A. tumefaciens stammen kweken
- Gebruik een steriele houten stok of Pipetteer tip om te enten met een één kolonie van de gewenste stam 1 mL van ATGN groei media (zie lijst van de materialen voor het recept).
Opmerking: Voor A. tumefaciens uitputting stammen, moet de ATGN 1 mM IPTG bevatten als een inductor te handhaven van de biosynthese van het essentiële eiwit. - Groeien de A. tumefaciens stammen overnachting in ATGN bij 28 ° C met schudden bij 225 t/min.
- Meet de extinctie van de cellen in 600 nm (OD600) gebruik van een spectrofotometer. Verdun de cultuur van de cel tot een OD600 = ~0.2 en blijven groeien tot OD600 = ~0.6 is bereikt. Voor uitputting stammen, blijven groeien met inductor tot OD600 = ~0.6 is bereikt.
- Gebruik van wildtype en mutant stammen van A. tumefaciens op OD600 = ~0.6 voor doelgroepen gerichte kleuring en/of time-lapse microscopie (Zie secties 2 en 3.1). Wassen voor uitputting stammen, de inductor (zie punt 1.2).
- Gebruik een steriele houten stok of Pipetteer tip om te enten met een één kolonie van de gewenste stam 1 mL van ATGN groei media (zie lijst van de materialen voor het recept).
-
Verwijdering van inductor voor karakterisering van A. tumefaciens eiwit uitputting stammen
- 1 mL van de exponentiële cultuur pellet (OD600 = ~0.4-0.6) door middel van centrifugeren bij 7.000 x g gedurende 5 minuten in een desktop centrifuge bij kamertemperatuur.
- Om te wassen, verwijderen van supernatant en resuspendeer de pellet in verse media zonder inductor en pellet van de cellen, zoals eerder beschreven (1.2.1). Wassen van de cellen een totaal 3 keer in de nieuwe media.
- Resuspendeer de laatste pellet in verse media en het concentreren van de cellen tot een OD600 = ~0.8 voor onmiddellijke kleuring met doel specifieke kleurstoffen (sectie 2 en figuur 4B-D) of time-lapse microscopie (punt 3.2 en figuur 4A) . U kunt ook vooraf afbreken de cellen voor de gewenste hoeveelheid tijd door de groeiende cellen in media zonder inductor vóór kleuring en beeldvorming van de cellen.
2. doelgroepen gerichte kleuring van A. tumefaciens cellen
-
Fluorescerende d-amino acid celwand labeling
Opmerking: FDAAs zijn niet-toxisch fluorescerende d-aminozuren die gemakkelijk in de A. tumefaciens peptidoglycaan worden verwerkt. Deze eenvoudige labeling procedure sondes groei patronen in levende cellen6. Protocollen voor de synthese van vier FDAAs zijn beschikbaar38.- Pellet 500 µL van exponentiële cultuur (OD600 = ~0.4-0.6) door middel van centrifugeren bij 7.000 x g gedurende 5 minuten in een desktop centrifuge. Resuspendeer de pellet cel in 100 µL van nieuwe media.
- Voeg 5 µL van 5 mM FDAA aan gewassen en geconcentreerd cellen en incubeer gedurende 2 min. in het donker.
Opmerking: Maximaal FDAA blootstelling aan licht. De tijd van incubatie zal variëren afhankelijk van de groei van de stam. Incubatie keer moet meestal 5-10% van de verdubbeling tijd6. - Pellet de cellen door centrifugeren en cel pellets met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) drie keer wassen.
- Resuspendeer de pellet in ~ 50 µL PBS.
Opmerking: Het volume van PBS gebruikt voor resuspensie kan variëren afhankelijk van de grootte van de pellet. - 0,8-1 toepast µL van cellen agarose stootkussen te een beeld met behulp van microscopie van de epifluorescence onmiddellijk (zie onder de punten 3.1 en 3.2).
- U kunt ook stoppen verder label opneming door vaststelling van de cellen met ijskoude 70% ethanol. Resuspendeer de cel pellet in 1 mL ijskoud 70% ethanol en incubeer op ijs gedurende 15 minuten.
- Verzamelen van cellen door centrifugeren en resuspendeer in een klein volume van PBS voor imaging op een later tijdstip. Cel schorsingen bij 4 ° C en afbeelding opslaan binnen 48 uur.
-
DNA kleuring met DAPI of oranje vlek
Opmerking: Om te observeren DNA structuur, cellen worden aangeduid met hetzij de DAPI of oranje (dode cel vlek). Hoewel klassiek beschreven als een "dode cellen vlek', oranje is permeant, photostable, en heeft geen invloed op de groei van bacteriële cellen, live-cel DNA imaging10inschakelen. In A. tumefaciens, oranje labeling werkt goed in levende cellen en is geschikt voor time-lapse microscopie (Figuur 3). In tegenstelling, het ultraviolette (UV) licht blootstellingsduur die nodig zijn voor imaging DAPI gebeitste cellen is fototoxisch (Figuur 3) en DAPI kleuring is dus geschikt voor de kleuring van levende cellen voor onmiddellijke imaging of kleuring vaste cellen.- DAPI kleuring van cellen
- 1 mL van de exponentiële cultuur pellet (OD600 = ~0.4-0.6) door middel van centrifugeren bij 7.000 x g gedurende 5 minuten in een desktop centrifuge.
- Optioneel, om te lossen cellen voorafgaand aan kleuring, resuspendeer de cel pellet in 1 mL ijskoud ethanol 70%. Incubeer op ijs voor 10-15 min. Collect de cellen door centrifugeren als in 2.2.1.1 beschreven.
- Resuspendeer de cel pellet in 1 mL PBS, met 1 µL van DAPI stockoplossing (1 mg/mL; Zie Materialen tabel). Meng zachtjes door pipetteren en incubeer gedurende 5 minuten in het donker.
- Pellet cellen door centrifugeren bij 7.000 x g gedurende 5 min en resuspendeer in 1 mL PBS te verwijderen overtollige DAPI. Spoel de cellen nog tweemaal en resuspendeer de pellet in PBS 50 µL of media.
- 0,8-1 toepast µL van cellen agarose stootkussen te een beeld met behulp van microscopie van epifluorescence onmiddellijk. Zie punten 3.1 en 3.2.
Opmerking: Dit protocol is niet optimaal voor time-lapse microscopie te observeren chromosoom dynamics (Figuur 3). Overweeg het gebruik van oranje vlekken als alternatief (zie paragraaf 2.2.2).
- Oranje verkleuring van levende cellen
- 1 mL van de exponentiële cultuur pellet (OD600 = ~0.4-0.6) door middel van centrifugeren bij 7.000 x g gedurende 5 minuten in een desktop centrifuge. Resuspendeer cel pellet in 1 mL PBS, met 1 µL van Oranje stockoplossing (zie lijst van de materialen). Meng zachtjes door pipetteren en incubeer gedurende 5 min. in het donker.
- Pellet cellen door centrifugeren en resuspendeer in 1 mL PBS te verwijderen overtollige oranje. Spoel de cellen nog tweemaal en resuspendeer de pellet in PBS met 50 µL.
- 0,8-1 toepast µL van cellen agarose stootkussen te een beeld met behulp van microscopie van epifluorescence onmiddellijk. Zie punten 3.1 en 3.2.
Opmerking: Dit protocol werkt goed samen met levende cellen en is geschikt voor time-lapse microscopie te observeren chromosoom dynamics (Figuur 3). Als het is niet handig om het imago onmiddellijk, kunnen cellen in ijskoude 70% ethanol (zie punt 2.2.1.2) worden vastgesteld.
- DAPI kleuring van cellen
-
Membraan labeling
Opmerking: De lipofiele styryl fluorescerende kleurstof 4-64 is gebruikt uitgebreid te observeren het membraan van bacteriële cellen. In tegenstelling tot veel bacteriën, 4-64 A. tumefaciens cellen het label niet uniform Maak label, maar vrij vaak vertonen een "hoefijzer" patroon14,15. Opmerkelijk, de groei paal is bijna verstoken van vlek terwijl de oude paal intens heet. Aldus, kan 4-64 visualisatie van zowel de groeipatronen van de cel als de membraan structuur in A. tumefaciens.- FM 4-64 toevoegen om een eindconcentratie van 8 µg/mL, in 1 mL van de cultuur van de cel van de exponentiële fase en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten in het donker.
- Pellet gelabelde cellen door centrifugeren bij 7.000 x g gedurende 5 minuten in een desktop centrifuge en resuspendeer cel pellet in 1 mL PBS. Wassen van de cellen een totaal van drie keer te verwijderen overtollige kleurstof.
- Resuspendeer de cellen in een klein volume van PBS en plek op een agarose aanvullen tot het beeld onmiddellijk. (Zie punten 3.1 en 3.2)
Let op: Cellen moeten onmiddellijk beeld worden om te observeren karakteristiek labeling patronen.
3. beeldvorming van A. tumefaciens cellen
-
Agarose pad voorbereiding
Opmerking: Figuur 1 bevat een reeks afbeeldingen (a-panel) en schema (deelvenster B) van een typische agarose pad time-lapse microscopie voorbereid. Agarose pads zijn meestal bereid zo nodig.- 3.1.1. het gebruik van een dekglaasje aan als een gids en knippen een 22 x 22 mm vierkant laboratorium film (Zie materialen lijst) door het uitvoeren van een scalpel rond de randen.
- Een vierkant gesneden uit het midden van de film van de laboratorium verlaten een ~ 2-5 mm grens om te dienen als een pakking voor de agarose pad. Gooi het centrum-knipsel.
- Plaats de pakking van de film op een glasplaatje (75 x 25 mm) gereinigd met een ammoniak en alcoholvrij reiniger (zie lijst van materialen) en verwarm tot de film licht op glas (bovenste afbeelding in figuur 1A gesmolten is). Om te smelten laboratorium film, de rand van een warmte blok set tot 70 ° C gebruiken of licht boven een vuur smelten.
- Bereid agarose oplossing door het mengen van ~0.075 g agarose (zie lijst van de materialen) in 5 mL van de media in een kleine kolf. Verwarm de oplossing in een magnetron met periodieke wervelende te mengen totdat de agarose wordt opgelost en de oplossing duidelijk is. Bewaar deze agarose oplossing bij 55-70 ° C en gebruik voor de bouw van meerdere agarose pads binnen 48 uur.
- Pipetteer media met 1,2-1,5% agarose in het midden van de pakking.
Opmerking: Het volume van de media is meestal 50-60 µL maar afhankelijk van de grootte van de pakking. Het toevoegen van media aan een koude dia kan leiden tot de agarose te te snel stollen, moet dus de dia worden bewaard op een warme ondergrond. De rand van een warmte-blok ingesteld op 70 ° C werken goed. Water agarose of gebufferde agarose oplossingen zoals fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) kunnen worden gebruikt in plaats van media met agarose voor toepassingen waarin verdere celgroei niet vereist is. Voor imaging uitputting stammen, kunnen de inductor aanwezig of afwezig in de media. Aanwezigheid van inductor kan worden gebruikt als een besturingselement, overwegende dat het ontbreken van inductor het fenotype van uitputting onthullen zal. - Plaats een dekglaasje aan over de pakking gelijkmatig verdelen de agarose.
- Plaats dia op een koele, vlakke ondergrond te stollen voor ~ 2 min. vermijden uitdrogen van het agarose stootkussen aangezien dit in een gerimpelde oppervlak op het pad agarose en bundeling van de celsuspensie resulteren zal wanneer toegepast op het oppervlak.
- Schuif voorzichtig het dekglaasje aan uit de agarose pad.
Let op: Deze stap niet overhaast. De agarose pad kan gemakkelijk scheuren en een ongelijke agarose pad beeldvorming kan bemoeilijken. - Laat de agarose pad om lucht droog zijn voor 1-2 min bij kamertemperatuur, totdat het oppervlak van de pad droog verschijnt. Met behulp van een scalpel, het verwijderen van een kleine strook van agarose maken een zak lucht (middelste afbeelding, figuur 1A); de zak van de lucht is meestal ~ 2 x 7-10 mm en A. tumefaciens cellen de neiging om te groeien het beste in de buurt van de zak van lucht (Figuur 1 c).
Opmerking: Voor beeldvorming van vaste cellen of onder omstandigheden waar groei niet wordt gecontroleerd, een zak lucht is niet nodig. - Plek 0,8-1 µL van cellen in de agarose pad en bedek met een nieuwe dekglaasje aan. Plaats het dekglaasje aan zachtjes over de bovenkant van de agarose pad naar de cellen verdelen over het oppervlak van de agarose pad.
- Zegel van de randen van het dekglaasje aan met behulp van gesmolten VALAP (Zie Materialen tabel voor recept; Figuur 1A, afbeelding onderz─│de). Storing te verzegelen langs alle randen en hoeken van het dekglaasje aan kan veroorzaken drogen van het agarose pad, die leiden zal tot het drijven van cellen tijdens de beeldvorming. Opmerking: De verzegeling van het dekglaasje aan is alleen nodig voor lange termijn time-lapse imaging.
Figuur 1: Agarose pad voorbereiding. (A) beeld van de volgorde van het protocol van de voorbereiding van het pad van agarose. Afbeelding 1 is een dia met de pakking van de film laboratorium. In afbeelding 2, worden de agarose pad en air pocket gevisualiseerd. Ten slotte, afbeelding 3 toont de volledige agarose pad met de cellen onder een dekglaasje en verzegeld met VALAP. (B) een schematische voorstelling van een agarose pad voor time-lapse microscopie wordt verstrekt. Zeer belangrijke eigenschappen van de agarose pad worden aangeduid op het schema. (C) de zak lucht bevorderd groei van A. tumefaciens op agarose pads. Beelden van wildtype A. tumefaciens cellen gekweekt op een agarose pad voor 20 uur staan. Beelden werden genomen op posities steeds ver uit de zak van de lucht. De afstand van de dichtstbijzijnde rand van de afbeelding aan de zak lucht wordt boven elke afbeelding weergegeven. Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
-
Imaging
Opmerking: Differential-interference-contrast, fase contrast en epifluorescence imaging is uitgevoerd met een omgekeerde Microscoop uitgerust met hardware gebaseerde autofocus met een geautomatiseerde stadium, standaard filters, een LED-lichtbron, 60 X olie-immersie doelstellingen (1.4 nvt) voor fase contrast of differentiële interferentie contrast (DIC), en een elektron-vermenigvuldigen 1K-camera voor charge-combinatie-apparaat (EMCCD). De Microscoop moet in een temperatuur gecontroleerde ruimte worden geplaatst. Als alternatief, een podium warmer of kamer kan worden gebruikt om consistente temperaturen tijdens de beeldvorming.- Epifluorescence microscopie
Nota: Voor de beeldvorming van de fluorescentie van levende cellen is het noodzakelijk te beperken van het aantal afbeelding acquisities en optimaliseren van de belichtingstijd te minimaliseren photobleaching en fototoxiciteit. Voor de beeldvorming van elke kleurstof, is het raadzaam om een optimale belichtingstijd die voldoende fluorescentie detectie biedt maar leidt niet tot photobleaching of fototoxiciteit te vinden. In de figuren 2-4, werden belichtingstijden van 200 ms gebruikt voor alle afbeeldingen van de fluorescentie. Voor de time-lapse sequenties afgebeeld in Figuur 3, werden de beelden elke 10 min. voor 3U verworven.- Plaats van immersie-olie op het nagestreefde doel en plaats van de omgekeerde dia in de dia houder in het werkgebied. Gebruik de focus knoppen om de cellen in focus.
- Afbeeldingen in fase (of DIC) en de gewenste fluorescentie-filter te verwerven.
Opmerking: De maximale excitatie en emissie golflengten voor de vlekken gebruikt in Figuur 4 Figuur 2en Figuur 3zijn als volgt: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), oranje (547/570).
- Time-lapse microscopie
Opmerking: Tijdens de time-lapse microscopie de volgende functies zijn computergestuurde: x, y en z-positie, luiken en fluorescentie-filters. Een op hardware gebaseerde auto-focus systeem is optimaal te houden van focus tijdens time-lapse imaging. U kunt ook kan een software gebaseerde auto-focusing lus worden gebruikt.- Plaats van immersie-olie op het nagestreefde doel en plaats van de omgekeerde dia in de dia houder in het werkgebied. Gebruik de focus knoppen om de cellen in focus.
- Optioneel: Verwerven meerdere (x, y) positie. Selecteer willekeurig 10 velden van cellen in de nabijheid van de zak van de lucht van de agarose pads.
- Set-up tijd volgorde overname naar afbeelding in fase of DIC op het gewenste tijdsinterval.
Opmerking: Voor de time-lapse opeenvolging afgebeeld in Figuur 4, DIC beelden werden verkregen met 30 ms blootstelling elke 10 min. voor 14u. Bij het gebruik van fluorescentie imaging tijdens time-lapse microscopie, passen de interval en blootstelling Acquisitietijd om photobleaching en fototoxiciteit te minimaliseren.
- Epifluorescence microscopie
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Doel-specifieke etikettering van wildtype A. tumefaciens cellen
Om te illustreren dat cel morfologie wordt niet beïnvloed door het wassen stappen of behandeling met 1% DMSO (die wordt gebruikt voor het verdunnen van de fluorescente kleurstoffen), cellen werden beeld rechtstreeks vanuit cultuur (figuur 2A, uiterst linkse paneel), na het wassen van de cellen door centrifugeren zoals beschreven in 1.2 (figuur 2A, linkerpaneel), of na het broeden van de cellen met 1% DMSO gedurende 10 minuten en het wassen van de cellen (figuur 2A, rechter paneel). Deze afbeeldingen illustreren dat morfologie wordt niet beïnvloed door wassen of de aanwezigheid van DMSO. Daarnaast is de celgroei niet beïnvloed door wassen of DMSO behandeling op basis van groei curve analyse (gegevens niet worden weergegeven). Bovendien, veroorzaakt vaststelling van A. tumefaciens met ijskoude ethanol geen bruto veranderingen in de morfologie (figuur 2A, uiterst rechts paneel).
Vervolgens werden doel specifieke kleurstoffen gebruikt om het observeren van biogenese van de celwand en membraan domeinen DNA binnen cellen van wildtype A. tumefaciens . De patronen van nieuwe peptidoglycaan invoeging werden waargenomen na labelen met drie TL-d-aminozuren: HADA (figuur 2B, deelvenster links), NADA (figuur 2B, midden paneel) en TADA (figuur 2C, rechter paneel). In alle drie labeling experimenten, werd nieuwe peptidoglycaan labeling verrijkt op de groei paal of tussenschot van de cellen. Deze groeipatronen werden consequent waargenomen met alle drie FDAAs, die aangeeft dat de selectie van de FDAA kan worden gewijzigd zodat dual labelen met andere vlekken of cellen uiten van fluorescently geëtiketteerde eiwitten. De lipofiele kleurstof 4-64 etiketten bij voorkeur de oude Pool-regio van A. tumefaciens cellen wat resulteert in een karakteristiek hoefijzer patroon (figuur 2C). Zowel de oranje (figuur 2D, linkerpaneel) en de DAPI (figuur 2D, rechterpaneel) label DNA binnen levende A. tumefaciens cellen. In late pre-divisional cellen, twee verschillende nucleoids worden waargenomen met oranje vlekken, overwegende dat DNA labeling blijkt meer diffuus met DAPI kleuring (figuur 2D) overeen met resultaten van de experimenten waargenomen in E. coli10.
Geschiktheid van DNA kleurstoffen voor time-lapse microscopie
Om te bepalen als de DAPI of oranje zijn geschikt voor time-lapse beeldvorming van de nucleoïde morfologie tijdens celgroei, waren een gelijk aandeel van labelloze, DAPI-label, en oranje-geëtiketteerden wildtype A. tumefaciens cellen gemengd en gespot op Agarose de pads. Op moment 0, eerste beelden werden genomen met behulp van fase contrast, DAPI en TRITC filters om te bepalen als elke cel werd het label. De cel mengsels werden vervolgens beeld onder drie verschillende voorwaarden: (1) fase contrast microscopie alleen, (2) fase contrast en epifluorescence microscopie met behulp van de TRITC filter en (3) fase contrast en epifluorescence microscopie met behulp van de DAPI-filter. Beelden werden verkregen elke 10 minuten gedurende 3 uur. Alle cellen groeide goed ongeacht de fluorescerende vlek gebruikt wanneer beeld met fase contrast microscopie die aangeeft dat oranje noch DAPI kleuring afbreuk doen aan de celgroei (Figuur 3, bovenste paneel). Alle cellen groeide ook goed wanneer beeld door fase microscopie en epifluorescence microscopie met behulp van de filter van de TRITC (Figuur 3, midden paneel). Het oranje label dat is onderworpen aan photobleaching maar kan worden waargenomen gedurende ten minste 2 uur (13 totale blootstelling aan 200 ms), met vermelding van de geschiktheid van deze kleurstof voor korte termijn microscopie van levende cellen. Ongeacht het labelen, alle cellen stoppen met groeien binnen een uur bij het beeld door fase microscopie en epifluorescence microscopie met behulp van de filter van de DAPI (Figuur 3, onderste paneel). Deze observatie blijkt dat A. tumefaciens gevoelig voor UV-blootstelling is en geeft aan dat de kleurstoffen vereisen een UV-filter voor imaging voor time-lapse microscopie experimenten moeten worden vermeden.
Time-lapse beeldvorming en doelgroepen gerichte labeling van een A. tumefaciens uitputting stam
Geven aan dat de master regulator-eiwit, CtrA, essentieel in A. tumefaciens iszowel verzadigen van transposon mutagenese39 en bij gebreke van voor de bouw van een schrapping stam18,40 . Om aan te tonen van de waarde van microscopische analyse van uitputting stammen, werd een eerder beschreven ctrA uitputting stam18 onderworpen aan karakterisering door microscopie. In figuur 4A, time-lapse microscopie werd gebruikt voor het vergelijken van de groei van ctrA uitputting cellen in welke ctrA expressie was geïnduceerde (boven) en uninduced (onder). In aanwezigheid van CtrA gaf een eencellige aanleiding tot een microcolony binnen 14 h. In tegenstelling, wanneer CtrA was uitgeput, cellen lysed of mislukt om te verdelen. Cellen die niet verdelen tentoongesteld bruto morfologische veranderingen, met inbegrip van afronding van halverwege cel en aan de Polen van de cel. Deze opmerkingen suggereren dat CtrA een belangrijke functie in de regulering van de celdeling heeft.
In figuur 4B-D, werden fluorescente kleurstoffen gebruikt voor het karakteriseren van de stam ctrA uitputting na inductie of uitputting van ctrA voor 10 h. cellen waren pulse gelabeld met NADA voor 2 min (figuur 4B). CtrA toen aanwezig (bovenzijde), polar peptidoglycaan biosynthese werd waargenomen. In tegenstelling, uitgebreide NADA etikettering vond plaats in het Polen en grote halverwege cel zwellingen is opgetreden toen CtrA was uitgeput. Deze constatering is consistent met aanhoudende peptidoglycaansynthese ondanks een mislukking van de cellen om te verdelen. De cyanine DNA kleurstof Oranje werd gebruikt voor het karakteriseren van DNA distributie in de ctrA uitputting stam (figuur 4C). Toen CtrA aanwezig was, groeiende cellen hadden een gelijkmatige verdeling van DNA en segregatie van nucleoids bleek in een late pre-divisional cel; in tegenstelling, wanneer CtrA was uitgeput, was DNA ongelijk verspreid in de cellen. Deze opmerkingen suggereren dat CtrA tot de juiste DNA replicatie of segregatie bijdraagt. Ten slotte, ctrA uitputting cellen waren gelabeld met 4-64 (Figuur 4 d). In aanwezigheid van CtrA, was de celmembraan gelabeld met een karakteristieke hoefijzer patroon waarin de groei paal verstoken van vlek was. In cellen uitgeput van CtrA, verscheen 4-64 op het etiket van het gehele membraan, hoewel één pool was meer intens gekleurd. Deze constatering stelt dat membranen intact blijven, hoewel de lipide microdomain organisatie kan worden verstoord wanneer CtrA is uitgeput.
Figuur 2: Representatieve beelden van wildtype Agrobacterium tumefaciens cellen aangeduid met doel specifieke kleurstoffen. (A) fase contrast beelden van A. tumefaciens cellen vóór en na het wassen-protocol, wanneer behandeld met 1% DMSO, hetzij na fixatie met ijskoude ethanol. (B) Polar groei van A. tumefaciens cellen wordt weergegeven door het labelen met de fluorescerende d-aminozuren HADA, NADA en TADA. (C) Staining van A. tumefaciens met de lipofiele 4-64 vlek. (D) Staining A. tumefaciens cellen met de DNA-specifieke kleurstoffen oranje en DAPI. Voor panelen B-D, worden fase contrast (boven) en epifluorescence (onder) afbeeldingen weergegeven. Cel contouren vindt u in de fluorescentie beelden ter referentie. Schaal bar = 2 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Vergelijking van de DAPI en oranje labeling van DNA in levende A. tumefaciens cellen. Gelijke verhoudingen van labelloze DAPI-label en oranje-geëtiketteerden wildtype A. tumefaciens cellen waren gemengd en gespot op agarose pads. Op moment 0, eerste beelden werden genomen met behulp van fase contrast, TRITC en DAPI filters om te bepalen als de cellen waren gelabeld. (A) Time-lapse labelloze DAPI-label en oranje-geëtiketteerden cellen beeld door fase contrast microscopie. (B) Time-lapse labelloze DAPI-label en oranje-geëtiketteerden cellen beeld door fase microscopie en epifluorescence microscopie met behulp van de filter van de TRITC. (C) Time-lapse labelloze DAPI-label en oranje-geëtiketteerden cellen beeld door fase microscopie en epifluorescence microscopie met behulp van de DAPI-filter. Schaal bar = 2 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Representatieve beelden van de ctrA uitputting stam in geïnduceerde en uninduced. (A) Time-lapse microscopie van de ctrA uitputting stam onder omstandigheden waar ctrA was geïnduceerde (boven) of uitgeput (onder). De nummers boven elk deelvenster geven de tijd in uren. (B) fase contrast (links) en epifluorescence (rechts) beelden van cellen die zijn gemarkeerd met NADA. (C) fase contrast (links) en fluorescentie (rechts) beelden van cellen die zijn gemarkeerd met oranje. (D) fase contrast (links) en fluorescentie (rechts) beelden van cellen die zijn gemarkeerd met 4-64. Cel contouren werden verstrekt in fluorescentie beelden ter referentie. Schaal bar = 2 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol bevat een reeks procedures voor het onderzoek van A. tumefaciens wildtype, mutant en uitputting stammen. Het is vermeldenswaard dat alle procedures vermeld in de sectie protocol gemakkelijk aangepast voor andere bacteriestammen met extra wijzigingen worden kan ter verantwoording voor groei media, temperaturen en groeicijfers.
Het gebruik van doelgroepen gerichte kleurstoffen is een waardevol instrument voor het verstrekken van een gedetailleerde karakterisering van celcyclus gebeurtenissen in bacteriële cellen. Hier, peptidoglycaan invoeging patronen werden waargenomen met behulp van de TL-d-aminozuren, lipide domeinen waren gevisualiseerd met 4-64, en nucleoids waren gelabeld met DAPI of oranje. Elk van de protocollen kunnen worden aangepast voor gebruik in andere bacteriën na het optimaliseren van het wassen-protocol en ervoor te zorgen dat de behandeling van DMSO niet groei of morfologie aangetast. Belangrijke overwegingen omvatten de selectie van een buffer voor het wassen stappen, incubatie tijden voor opneming van het label en de selectie van een geschikte fluorophore om te voorkomen dat auto-fluorescentie of multiplex labeling bestudering mogelijk maken. Bijvoorbeeld, is een alternatief voor de lipofiele membraan van het rood-fluorescerende vlek (4-64) de groen-fluorescerende membraan vlek (1-43). Ook blauw-, groen- en red-TL-d-aminozuren zijn beschikbaar6,,38 en d-aminozuren met biorthogonal handvatten kunnen worden geconjugeerd met gemeenschappelijke fluorophores t/m6,7van de chemie van de klik. Tot slot, naast de oranje-belichting fluorescerende cyanine DNA kleurstof, een groen fluorescerend cyanine DNA kleurstof is beschikbaar en presteert goed met live bacteriecellen10. Visualisatie van Sleutelcel structuren aangeduid met doelgroepen gerichte kleurstoffen kan worden gecombineerd met de observatie van fluorescente proteïnen mechanistische inzichten in essentiële processen in bacteriën te krijgen.
Deze protocollen zijn de noodzakelijke voorwaarden voor microscopische waarneming van A. tumefaciens uitputting vlekken en moet het mogelijk zijn om uit te breiden van deze benaderingen van eiwit uitputting stammen in andere bacteriën. De karakterisatie van uitputting stammen kunnen bijzonder uitdagend, want er een beperkt tijdsbestek is onderzoeken uitvoeren voordat de cellen stoppen met groeien of lyse. Het is van cruciaal belang om adequaat wassen de cellen als u wilt verwijderen van alle sporen van de overtollige kleurstof tijdens de etikettering; Sommige cellen uitgeput van essentiële eiwitten hebben echter gebreken in hun cel oppervlakken die ze als gevoelig zijn voor wassen stappen kunnen veroorzaken. Verhogen van het eerste volume van celculturen kan helpen compenseren voor het verlies van cellen tijdens de stappen wassen. Uitputting stammen die hebben gecompromitteerd celmembranen of celwanden mogelijk gevoelig voor cel lysis als volwassen in vloeibare cultuur zonder inductor. Opname van een osmoprotectant (5 gewichtspercenten sacharose werkt goed voor A. tumefaciens) kan helpen handhaven cel morfologie en beperken van lysis van de cel tijdens de uitputting. Het is noodzakelijk om de juiste hoeveelheid tijd om vooraf de cellen voorafgaand aan met een fluorescente kleurstof vlekken afbrekende empirisch. Cellen met permeablized membranen of celwanden mogelijk gevoelig voor cel lysis of niet-selectieve labelen met fluorescerende reagentia maken imaging laat uitputting tijdstippen bijzonder uitdagend.
Een cruciale stap voor time-lapse microscopie van A. tumefaciens (of andere bacteriële cellen) is de voorbereiding van de agarose pad. De agarose pad moet niveau om goede focus in de hele time-lapse microscopie experimenten. Bovendien moet het dekglaasje aan volledig worden afgesloten om te voorkomen dat de agarose pad drogen en wijzigen van het brandvlak. Voor A. tumefaciensis zuurstof vereist voor celgroei. Beeldvorming in de buurt van een zak lucht is noodzakelijk om robuuste groei van A. tumefaciens tijdens lange time-lapse microscopie experimenten (Figuur 1 c). Als cellen niet groeien of stoppen met groeien na slechts een paar uur, is het raadzaam om voor te bereiden op een agarose pad met een grotere lucht pocket en beeld in de buurt van de luchtzakken. Zelfs een goed geconstrueerde agarose pad met een goede air-zak kunt A. tumefaciens groei alleen ondersteuning voor een maximum van ~ 24 h. Als meer time-lapse sequenties nodig zijn, aanpak andere, zoals microfluidics of stroom cellen moeten worden beschouwd. Als de cellen onscherp tijdens imaging drift, ervoor zorgen dat de agarose pad niveau en naar behoren verzegelde onder het dekglaasje aan. Merk op dat zelfs met een in de omgeving van perfecte agarose pad, het is mogelijk dat sommige cellen onscherp drift zal, aldus imaging meerdere velden en frequente heroriëntatie zijn sterk aanbevolen. Voor andere bacteriën, alternatieve benaderingen van de voorbereiding van agarose pads moeten worden beschouwd als41,42,43 best voldoen aan de eisen van de groei voor de bacterie. Agarose pads zijn ook nuttig voor immobilizing van cellen tijdens de beeldvorming van gelabelde of vaste cellen wanneer time-lapse niet nodig is. In dit geval het dekglaasje aan afdichting is niet noodzakelijk en alternatieve benaderingen voor de bouw van agarose pads, die kunnen worden opgeslagen tot later mogelijk passende43.
Globaal, kan het gebruik van doelgroepen gerichte kleurstoffen en time-lapse microscopie inzicht over fundamentele processen in bacteriën. Hier, illustreren we de gebruikelijke hoefijzer patroon van benoemen met de lipofiele 4-64 kleurstof en de karakteristieke, polaire en septal labelen met TL-d-aminozuren in A. tumefaciens. Opmerkingen van deze patronen in A. tumefaciens stroken met de polar groei van deze bacterie44 en het is waarschijnlijk dat soortgelijke studies kunnen onthullen informatie over groei patronen bij andere bacteriën. De bevinding dat cyanine kleurstoffen zoals oranje geschikt zijn voor time-lapse microscopie10 (Figuur 3 bestudeert) zal zorgvuldige bestudering van mogelijk maken nucleoïde morfologie tijdens celgroei bij wildtype en mutant stammen. Fluorescente kleurstoffen van doelgroepen gerichte tijdens de uitputting van een essentieel eiwit imaging bieden belangrijke opmerkingen om de functie van het eiwit vast te stellen. Tot slot, aangezien veel van deze kleurstoffen beschikbaar met verschillende spectrale eigenschappen zijn, studies gelijktijdig gebruik van meerdere labels in staat moeten stellen inzichten in de coördinatie van essentiële processen gedurende de celcyclus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Michael VanNieuwenhze (Indiana University) voor het geschenk van de FDAAs gebruikt in Figuur 2 en Figuur 4. Wij danken de leden van de bruine lab voor feedback tijdens de voorbereiding van dit manuscript. Onderzoek in de bruine lab op A. tumefaciens celgroei en deling wordt ondersteund door de National Science Foundation (IOS1557806).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial Strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens C58 | ATCC | 33970 | Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264. |
| Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA | Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media Components | |||
| ATGN Minimal Medium | To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. | ||
| 20X AT Buffer | Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave. | ||
| NaOH | Fisher BioReagents | BP359 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P288 | |
| 20X AT Salts | Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave. | ||
| (NH4)2SO4 | Fisher Chemical | A701 | |
| MgSO4•7H2O | Fisher BioReagents | BP213 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher BioReagents | BP510 | |
| MnSO4•H2O | Fisher Chemical | M114 | |
| Glucose | Fisher Chemical | D16 | Prepare 40% stock in water. Filter sterilize. |
| Bacto Agar | Fisher BioReagents | BP1423 | Add 15 g to 1 L of water when preparing plates. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional Media Additives | |||
| Kanamycin | GoldBio | K-120 | Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml. |
| IPTG | GoldBio | I2481C5 | Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy Materials | |||
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550D | 25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-541-B | 22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Sparkle Glass Cleaner | Home Depot | 203261385 | Ammonia and alcohol free. |
| Ultra Pure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C |
| PBS | Fisher BioReagents | BP399500 | 10X solution to be diluted to 1X with sterile water. |
| Parafilm | Bemis | PM-999 | Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation. |
| VALAP | Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten. | ||
| Lanolin Butter | SAAQIN | SQ-LAB-R1 | |
| Petroleum Jelly | Target Corp. | 06-17644 | |
| Paraffin Wax | Crafty Candles | 263012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Target-specific dyes | |||
| DMSO | Fisher BioReagents | BP231-1 | Use to dilute stock solutions of dyes as needed. |
| FDAAs (NADA, HADA,TADA) | FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM. | ||
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml. |
| SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S11368 | Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM. |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dry bath | Sheldon Manufacturing, Inc. | 52120-200 | |
| Metallic thermal beads | Lab Armor | 42370-002 | |
| Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera | Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work. |
References
- Daniel, R. A., Errington, J. Control of cell morphogenesis in bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell. Cell. 113 (6), 767-776 (2003).
- Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
- Turner, R. D., et al. Peptidoglycan architecture can specify division planes in Staphylococcus aureus. Nat Commun. 1, 26 (2010).
- Wheeler, R., Mesnage, S., Boneca, I. G., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Super-resolution microscopy reveals cell wall dynamics and peptidoglycan architecture in ovococcal bacteria. Mol Microbiol. 82 (5), 1096-1109 (2011).
- Turner, R. D., Hurd, A. F., Cadby, A., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall elongation mode in Gram-negative bacteria is determined by peptidoglycan architecture. Nat Commun. 4, 1496 (2013).
- Kuru, E., et al. In Situ probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (50), 12519-12523 (2012).
- Siegrist, M. S., et al. (D)-Amino acid chemical reporters reveal peptidoglycan dynamics of an intracellular pathogen. ACS Chem Biol. 8 (3), 500-505 (2013).
- Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: past and present. Microbiol Rev. 58 (4), 603-615 (1994).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. J Vis Exp. (79), (2013).
- Bakshi, S., et al. Nonperturbative imaging of nucleoid morphology in live bacterial cells during an antimicrobial peptide attack. Appl Environ Microbiol. 80 (16), 4977-4986 (2014).
- Barak, I., Muchova, K. The role of lipid domains in bacterial cell processes. Int J Mol Sci. 14 (2), 4050-4065 (2013).
- Fishov, I., Woldringh, C. L. Visualization of membrane domains in Escherichia coli. Mol Microbiol. 32 (6), 1166-1172 (1999).
- Barak, I., Muchova, K., Wilkinson, A. J., O'Toole, P. J., Pavlendova, N. Lipid spirals in Bacillus subtilis and their role in cell division. Mol Microbiol. 68 (5), 1315-1327 (2008).
- Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. MBio. 5 (3), e01219 (2014).
- Zupan, J. R., Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zambryski, P. C. Dynamic FtsA and FtsZ localization and outer membrane alterations during polar growth and cell division in Agrobacterium tumefaciens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 9060-9065 (2013).
- Eberhardt, A., Wu, L. J., Errington, J., Vollmer, W., Veening, J. W. Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems. Mol Microbiol. 74 (2), 395-408 (2009).
- Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate. J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).
- Figueroa-Cuilan, W., Daniel, J. J., Howell, M., Sulaiman, A., Brown, P. J. Mini-Tn7 Insertion in an Artificial attTn7 Site Enables Depletion of the Essential Master Regulator CtrA in the Phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82 (16), 5015-5025 (2016).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Khan, S. R., Gaines, J., Roop, R. M. 2nd, Farrand, S. K. Broad-host-range expression vectors with tightly regulated promoters and their use to examine the influence of TraR and TraM expression on Ti plasmid quorum sensing. Appl Environ Microbiol. 74 (16), 5053-5062 (2008).
- Yansura, D. G., Henner, D. J. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (2), 439-443 (1984).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- Thanbichler, M., Iniesta, A. A., Shapiro, L. A comprehensive set of plasmids for vanillate- and xylose-inducible gene expression in Caulobacter crescentus. Nucleic Acids Res. 35 (20), e137 (2007).
- Topp, S., et al. Synthetic riboswitches that induce gene expression in diverse bacterial species. Appl Environ Microbiol. 76 (23), 7881-7884 (2010).
- Peters, J. M., et al. A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria. Cell. 165 (6), 1493-1506 (2016).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
- Griffith, K. L., Grossman, A. D. Inducible protein degradation in Bacillus subtilis using heterologous peptide tags and adaptor proteins to target substrates to the protease ClpXP. Mol Microbiol. 70 (4), 1012-1025 (2008).
- McGinness, K. E., Baker, T. A., Sauer, R. T.
- Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1707), (2016).
- Escobar, M. A., Dandekar, A. M. Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends Plant Sci. 8 (8), 380-386 (2003).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev. 67 (1), table of contents 16-37 (2003).
- Nester, E. W.
- Imam, J., Singh, P. K., Shukla, P. Plant Microbe Interactions in Post Genomic Era: Perspectives and Applications. Front Microbiol. 7, 1488 (2016).
- Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front Plant Sci. 5, 322 (2014).
- Yuan, Z. C., Williams, M. A really useful pathogen, Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell. 24 (10), (2012).
- Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
- Pitzschke, A. Agrobacterium infection and plant defense-transformation success hangs by a thread. Front Plant Sci. 4, 519 (2013).
- Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat Protoc. 10 (1), 33-52 (2015).
- Curtis, P. D., Brun, Y. V. Identification of essential alphaproteobacterial genes reveals operational variability in conserved developmental and cell cycle systems. Mol Microbiol. 93 (4), 713-735 (2014).
- Kim, J., Heindl, J. E., Fuqua, C. Coordination of division and development influences complex multicellular behavior in Agrobacterium tumefaciens. PLoS One. 8 (2), e56682 (2013).
- Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), (2011).
- Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469 (2014).
- Zeng, L., Golding, I. Following cell-fate in E. coli after infection by phage lambda. J Vis Exp. (56), e3363 (2011).
- Brown, P. J., et al. Polar growth in the Alphaproteobacterial order Rhizobiales. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (5), 1697-1701 (2012).
