Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

संश्लेषण और एक Ruthenium आधारित Mitochondrial कैल्शियम का मूल्यांकन

Published: October 26, 2017 doi: 10.3791/56527
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry and Chemical Biology, Cornell University

Summary

संश्लेषण, शुद्धि के लिए एक प्रोटोकॉल, और एक ruthenium आधारित mitochondrial कैल्शियम का अवरोधक के लक्षण वर्णन प्रस्तुत किया है । permeabilized स्तनधारी कोशिकाओं में इसकी प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है.

Abstract

हम विस्तार के संश्लेषण और एक mitochondrial कैल्शियम की शुद्धि के लिए एक बहुत ही अवरोध करनेवाला, [(ओह2) (एनएच3)4आरयू (µ-O) आरयू (nh3)4(ओह2)]5 +। इस यौगिक के अनुकूलित संश्लेषण से शुरू [आरयू (nh3)5सीएल] सीएल2 में 1 एम एनएच4ओह एक बंद कंटेनर में, एक हरी समाधान उपज । शुद्धि कटियन-विनिमय क्रोमैटोग्राफी के साथ पूरा किया है । इस यौगिक की विशेषता है और यूवी विज़ और IR स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा शुद्ध होने के लिए सत्यापित किया जाता है । mitochondrial कैल्शियम निरोधात्मक गुण permeabilized हेला कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं ।

Introduction

Mitochondrial कैल्शियम प्रक्रियाओं है कि ऊर्जा उत्पादन और apoptosis सहित सामांय सेल समारोह के लिए महत्वपूर्ण है की एक संख्या के लिए एक प्रमुख नियामक है । 1 , 2 , 3 mitochondrial कैल्शियम uniporter (MCU), भीतरी mitochondrial झिल्ली पर रहता है कि एक आयन ट्रांसपोर्टर प्रोटीन, mitochondria में कैल्शियम आयनों की आमद को नियंत्रित करता है । 4 , 5 , MCU के 6 रासायनिक अवरोधकों समारोह और इस परिवहन प्रोटीन और mitochondrial कैल्शियम की सेलुलर भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए प्रयास जारी रखने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं । यौगिक [(HCO2) (nh3)4निय (µ-o) रॐ (NH3)4(हे2CH)]3 +, Ru360, एक के साथ MCU के लिए केवल ज्ञात चयनात्मक अवरोधकों में से एक है 24 µ m. 7 के एक रिपोर्ट Kd मान ,8,9,10 यह परिसर ruthenium लाल (RuRed), एक triruthenium di-µ-oxo पाटनी hexacation के सूत्र [(एनएच3) के व्यावसायिक नुस्खों में पाया गया एक आम नापाक है 5 आरयू (µ-o) आरयू (एनएच3)4(µ-o) आरयू (nh3)5)]6 +, जो भी एक कैल्शियम के रूप में इस्तेमाल किया गया है । हालांकि Ru360 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, यह बहुत महंगा है । इसके अलावा, संश्लेषण और Ru360 के अलगाव कठिन शुद्धि प्रक्रियाओं और अस्पष्ट लक्षण वर्णन विधियों द्वारा चुनौती दी है ।

हम हाल ही में एक Ru360 एनालॉग का उपयोग करने के लिए वैकल्पिक प्रक्रियाओं की सूचना दी है, [(ओह2) (एनएच3)4आरयू (µ-O) आरयू (nh3)4(ओह2)] सीएल5. 11 यह यौगिक Ru360 के समान उच्च अपनत्व के साथ MCU को रोकता है । इस प्रोटोकॉल में, हम इस यौगिक है, जो [आरयू (NH3)5सीएल] सीएल2से शुरू की हमारी सबसे प्रभावी संश्लेषण का वर्णन करेंगे । उत्पाद की शुद्धि दृढ़ता से अंलीय कटियन का उपयोग कर-विनिमय राल विस्तृत है, इस प्रक्रिया के लिए आम नुकसान के साथ । हम भी विशेषता और यौगिक शुद्धता के आकलन के लिए तरीके मौजूद है, और mitochondrial कैल्शियम चित्रित अवरुद्ध में इसकी प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए एक सरल तरीका है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: इस संश्लेषण में केंद्रित एसिड्स और कुर्सियां का इस्तेमाल किया जाता है । सभी उचित सुरक्षा प्रथाओं का प्रयोग करें जब इंजीनियरिंग नियंत्रण (धुएं हूड) और सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, लैब कोट, पूर्ण लंबाई पैंट, और बंद-पैर के जूते सहित निजी सुरक्षा उपकरण (पीपीई) के उपयोग सहित प्रतिक्रिया प्रदर्शन ।

< p class = "jove_title" > 1. की तैयारी [(ओह 2 ) (nh 3 ) 4 रॐ (& #181;-o) रॐ (NH 3 ) 4 (OH 2 )] सीएल 5

  1. संश्लेषण की [निय (NH 3 ) 5 सीएल] सीएल 2 < सुप class = "xref" > 12
    1. भंग १.०० g च्या RuCl 3 & #183; n h 2 o (४०% रॐ वजन, ४.१ mmol) मे 5 एमएल के ज 2 हे. कूल डार्क ब्राउन सॉल्यूशन को 0 & #176; सी एक आइस बाथ में । एक dropwise तरीके से ८०% hydrazine हाइड्रेट समाधान के 11 मिलीलीटर (०.२३ मॉल) जोड़ें । प्रारंभिक प्रतिक्रिया विकास गैस के साथ जोरदार होगा, एक भूरे रंग के समाधान में जिसके परिणामस्वरूप । आने वाले समाधान 16 ज के लिए कमरे के तापमान पर हलचल करते हैं; अंतिम समाधान डार्क रेड होगी ।
      सावधानी: Hydrazine तीव्र विषाक्त और यलो है । साथ ही, इस रिएजेंट के निर्जल रूपों विस्फोटक हैं । हमेशा की तरह, उचित पीपीई और धुएं डाकू जब हैंडलिंग का उपयोग करें । इन समाधानों को सूखापन के लिए ध्यान केंद्रित मत करो ।
      2. इस समाधान के लिए
    2. , 2 के लिए पीएच समायोजित करने के लिए केंद्रित एचसीएल के लगभग 5-10 मिलीलीटर जोड़ें । इस बिंदु पर, समाधान पीला-भूरे रंग में होगा ।
    3. गर्मी इस समाधान पर १०५ & #176; ग जबकि सरगर्मी के लिए 1-2 ज. एक पीला ठोस समाधान के बाहर वेग होगा । जब कोई और अधिक वर्षा दिख रूपों, गर्मी से हटा दें ।
    4. प्रतिक्रिया मिश्रण कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं, और फिर एक 0 में जगह & #176; सी बर्फ स्नान के लिए 10 min. वैक्यूम निस्पंदन द्वारा पीले ठोस इकट्ठा और 5 मिलीलीटर इथेनॉल और diethyl ईथर के प्रत्येक के साथ धो लो ।
    5. पूरी तरह से गर्म पानी के 15-25 मिलीलीटर में कच्चे उत्पाद को भंग । चिल एक फिल्टर कुप्पी में एक केंद्रित एचसीएल समाधान के 10 मिलीलीटर यह एक बर्फ स्नान में रखकर । पीला समाधान एक पीला पीला शुद्ध ठोस की वर्षा के लिए प्रेरित करने के लिए ठंडा एचसीएल समाधान में फ़िल्टर । फ़िल्टर इस वेग और 5 मिलीलीटर ०.५ एम एचसीएल, इथेनॉल और ईथर के प्रत्येक के साथ धो लो ।
    6. IR स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग यौगिक विशेषताएं । टूटती आवृत्तियों की पहचान द्वारा शुद्धता सत्यापित करें ३२२६ सेमी -1 , १६०४ सेमी -1 , १२९७ सेमी -1 , और ८०१ सेमी -1 । २०६९ सेमी -1 में एक आम मामूली नापाकी को सौंपा गया है [आरयू (NH 3 ) 5 N 2 ] Cl 3 .
  2. संश्लेषण [(OH 2 ) (NH 3 ) 4 रॐ (& #181;-o) रॐ (NH 3 ) 4 (OH 2 )] सीएल 5
    1. भंग १०० मिलीग्राम (०.३४ mmol) [आरयू (NH 3 ) 5 सीएल] सीएल 2 में ५० मिलीलीटर 1 मीटर NH 4 ओह में एक २०० मिलीलीटर भारी दीवार गोल तली हुई दबाव पोत । ढीले एक डाट के साथ कुप्पी टोपी और ७५ & #176 पर प्रतिक्रिया मिश्रण गर्मी, 6 के लिए सी h. गर्मी से निकालें और 4 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर हलचल के लिए एक अंधेरे हरी समाधान उपज ।
      सावधानी! एक दबाव निर्माण में एक सील पोत परिणाम हीटिंग । उचित दबाव-सुरक्षित कांच के बना हुआ का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें । इस प्रतिक्रिया के लिए, पोत को सील करने के प्रयोजन के लिए गैसीय NH 3 के नुकसान को कम करने के लिए है । इसलिए, अतिरिक्त दबाव की रिहाई के लिए अनुमति देने के लिए डाट ढीला जगह है ।
  3. शुद्धि द्वारा कटियन-विनिमय क्रोमैटोग्राफी
    1. एक 25 मिलीलीटर चोंच में, 5 जी कटियन सस्पेंड-एक्सचेंज राल (जैसे, Dowex 50WX2 200-400 मेष (एच + फार्म) में 10 एमएल ०.१ एम एचसीएल ।
    2. एक 10 मिलीलीटर कॉलम (10 मिमी व्यास, 15 सेमी ऊंचाई) एक ५० मिलीलीटर विलायक जलाशय के साथ चिपका में इस घोल लोड । ०.१ मीटर एचसीएल के लगभग 20-30 मिलीलीटर के साथ राल धो, जब तक eluate बेरंग है ।
    3. हरी प्रतिक्रिया समाधान चरण 1.2.1 में पृथक करने के लिए वापस लौटें । इस समाधान के लिए, pH को 2 पर समायोजित करने के लिए केंद्रित HCl जोड़ें, जिस पर समाधान रंग भूरा में बदलता है ।
    4. लोड कटियन के लिए इस acidified समाधान-विनिमय राल चरण 1.3.2 में तैयार स्तंभ धीरे से यह राल के शीर्ष पर pipetting । eluate पूरी तरह से नाली, और समाधान लोड हो रहा है जारी करते हैं । इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक संपूर्ण समाधान नहीं जोड़ा गया । राल के ऊपर गहरे भूरे रंग का हो जाएगा/ राल मात्रा में थोड़ा कम हो जाएगा.
    5. राल के शीर्ष को कवर करने के लिए कांच मोतियों का उपयोग करें । ये राल जब नए समाधान जोड़ रहे है परेशान किया जा रहा से रोकने जाएगा ।
    6. Elute 1 M HCl के 20 मिलीलीटर के साथ कॉलम ।
    7. ने १.५ मीटर (& #8776; ५० एमएल) की बढ़ी हुई एचसीएल एकाग्रता के साथ कॉलम को Elute । एक पीला समाधान के लिए बंद कॉलम आना शुरू हो जाएगा । 2 M करने के लिए एचसीएल एकाग्रता बढ़ाएँ और eluate बेरंग या एक बहुत ही पीला हरा-पीला है जब तक eluting जारी. इस प्रक्रिया के लिए 150-200 मिलीलीटर की कुल मात्रा की आवश्यकता होगी ।
    8. २.५ मीटर (20-50 मिलीलीटर) के लिए एचसीएल एकाग्रता बढ़ाएं । eluate परीक्षण ट्यूबों में भागों के रूप में इकट्ठा । 3 एम एचसीएल में वृद्धि । उत्पाद स्तंभ से हरा-भूरा समाधान के रूप में elute होगा । एक लाल-भूरा अंश भी कॉलम के उतर आने शुरू हो सकता है. के रूप में इन भागों ऑक्सीकरण ruthenium लाल अशुद्धियां हैं, हरे-भूरे रंग के अंशों के साथ पूल नहीं है ।
  4. [(OH 2 ) (NH 3 ) 4 रॐ (& #181;-o) की पवित्रता का वर्णन और सत्यापन रॐ (एनएच 3 ) 4 (OH 2 )] सीएल 5
    1. टेस्ट से अंशों के सभी कदम 1.3.8 । यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा । इस कार्य को पूरा करने के लिए, 3 M NH3 के 2 मिलीलीटर में दिए गए अंश के १०० & #181; L को जोड़ें और यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण करें । शुद्ध उत्पाद युक्त अंशों ३६० एनएम में एक बड़ी अवशोषक बैंड और ६०० एनएम पर एक कम तीव्र अवशोषक होगा । ४८० या ५३३ एनएम में अवशोषक ऑक्सीकरण ruthenium लाल और ruthenium लाल अशुद्धियों का संकेत है, क्रमशः ।
    2. पूल शुद्ध उत्पाद युक्त अंश और रोटरी वाष्पीकरण से सूखापन के समाधान लुप्त हो जाना । उत्पाद को हरा-भूरा ठोस के रूप में पृथक किया जाएगा । पैदावार आमतौर पर 5-15 मिलीग्राम (10-20% उपज) के आदेश पर कर रहे हैं । एकल क्रिस्टल, एक्स के लिए उपयुक्त-रे विवर्तन, यौगिक के जलीय समाधान में इथेनॉल के वाष्प प्रसार द्वारा प्राप्त किया जा सकता है ।
    3. शुद्धता की पुष्टि करने के लिए, पीएच ७.४ फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के एक समाधान में यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा यौगिक का विश्लेषण । शुद्धता का आकलन ३६० एनएम और ६०० एनएम चोटियों की तीव्रता के अनुपात को लेकर किया जा सकता है । यह अनुपात एक शुद्ध यौगिक के लिए 31 है । अशुद्ध यौगिकों के लिए, अनुपात छोटा हो जाएगा.
    4. आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा ठोस राज्य में नमूने का विश्लेषण । डायग्नोस्टिक बैंड में ३२३४ सेमी -1 , ३१५१ सेमी -1 , १६१८ सेमी -1 , १३१३ सेमी -1 , और ८१५ सेमी -1 हैं । आम नापाक बैंड १७६२ सेमी -1 और १४०० सेमी -1 पर देखा जाता है, एनएच की विशेषता 4 सीएल. Ruthenium लाल पर बैंड द्वारा पहचाना जा सकता है १४०४ cm -1 , १३०० cm -1 , १०३७ cm -1 और ८०० cm -1 .
  5. मूल्यांकन के mitochondrial कैल्शियम की अधिकता को रोकना प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी
    सावधानी! निंन कार्यविधियों स्तनधारी कक्षों का उपयोग करें । काम उचित लामिना प्रवाह डाकू कि जैविक सुरक्षा स्तर 2 (BSL2) अनुसंधान के लिए प्रमाणित कर रहे है में किया जाना चाहिए ।
    & #8203; नोट: [(ओह 2 ) (nh 3 ) 4 रॐ (& #181;-o) रॐ (NH 3 ) 4 (ओह 2 )] सीएल 5 इस खंड में [Ru] के रूप में संदर्भित किया जाएगा
    1. के रूप में बफर ग्लूकोज युक्त खारा समाधान (BGSS) बनाने के लिए परख मीडिया । BGSS एक समाधान है जिसमें ११० एमएम KCl, 1 एमएम KH 2 पो 4 , 1 मिमी MgCl 2 , 20 मिमी 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES), 5 मिमी सोडियम succinate, 30 & #181; M ईथीलीन ग्लाइकोल-बीआईएस (& #946;-aminoethyl ईथर)- n, n , n & #39;, n & #39; -tetraacetic अम्ल (EGTA). EGTA के अलावा सब कुछ गठबंधन, ७.४ को पीएच समायोजित करें । EGTA जोड़ें और ७.४ के लिए पीएच को समायोजित । परख मीडिया के ५० मिलीलीटर के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज की ०.५ मिलीलीटर जोड़ें
    2. Culture हेला cells in ५०० cm 2 पेट्री व्यंजन मे Dulbecco & #39; एस संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के साथ एक humidified मशीन में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ 5% कं 2 at ३७ & #176; C. बढ़ाना हेला कोशिकाओं में बढ़ रही एक १०० mm पेट्री डिश द्वारा सीडिंग उन्हें एक ५०० सेमी 2 पेट्री डिश में । बड़े पकवान में कुल मीडिया की मात्रा ११५ मिलीलीटर है । प्रत्येक बड़े पकवान लगभग १८,०००,००० कोशिकाओं उपज, दो प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए पर्याप्त होगा ।
      1. कोशिकाओं को बढ़ने जब तक वे 90-95% प्रवाह तक पहुंचने । मीडिया निकालें, और 15 मिलीलीटर पीएच ७.४ पंजाबियों के साथ कोशिकाओं कुल्ला । पंजाब में 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के 15 मिलीलीटर जोड़ें और 10 मिनट के लिए गर्मी कोशिकाओं को अलग करने के लिए । कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए 14 मिलीलीटर दौर नीचे बाज़ ट्यूबों
    3. गणना trypan नीले और एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं, और कोशिकाओं की कुल संख्या और १.८ मिलीलीटर मात्रा प्रति ७,५००,००० कोशिकाओं तक पहुँचने के लिए आवश्यक मीडिया की मात्रा की गणना के माध्यम से । ५३१० & #215 पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं केंद्रापसारक; जी supernatant की खिचड़ी भाषा और BGSS की गणना की मात्रा जोड़ें । कक्षों को धीरे से पुनर्निलंबित । इस परख के लिए
      1. , dimethyl sulfoxide (DMSO) में ४० एमएम digitonin के स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें, 1 एमएम कैल्शियम ग्रीन-5N में एच 2 ओ, और 10 एमएम CaCl 2 में ज 2 हे. [Ru] स्टॉक समाधान, शुद्ध पानी में तैयार कर सकते हैं, 1-3 मिमी से लेकर ।
        & #8203; नोट: कैल्शियम ग्रीन-5N प्रकाश के प्रति संवेदनशील है । अंधेरे में स्टोर और प्रकाश जोखिम को कम ।
    4. सेटअप fluorimeter ५०६ एनएम पर उत्तेजित करने के लिए और cuvette-३७ & #176 पर नियंत्रित धारक के साथ ५३२ एनएम पर उत्सर्जन पढ़ें; C. एक बार या पहिया हलचल के साथ एक एक्रिलिक cuvette तैयार, १.८ एमएल सेल सस्पेंशन से ऊपर 1.5.2, १.८ & #181; L digitonin हल, ३.६ & #181; l कैल्शियम ग्रीन-5N (हल), और 9 & #181; L [Ru] (1 मिमी स्टॉक समाधान के लिए, 5 & #181; M अंतिम एकाग्रता). fluorimeter में 15 मिनट के लिए गर्मी कोशिकाओं ।
      1. कच्चे अवशोषण के बजाय उत्तेजना/उत्सर्जन अनुपात के रूप में डेटा पढ़ें । इस अभ्यास प्रकाश स्रोत तीव्रता में उतार चढ़ाव के साथ जुड़े त्रुटियों को कम करता है ।
      2. के अभाव में पहले नमूना विश्लेषण ले [आरयू] कोशिकाओं की प्रतिक्रिया पर CaCl 2 के अलावा के प्रभाव को मापने के लिए.
      3. 1.5.4 में वर्णित सेटिंग्स के साथ fluorimeter पर विश्लेषण शुरू करते हैं । एक स्थिर उत्सर्जन आधार रेखा को स्थापित करने के लिए लगभग 2 मिनट तक प्रतीक्षा करें, और उसके बाद जोड़ें १.८ & #181; L के CaCl 2 (10 & #181; M अंतिम एकाग्रता). उत्सर्जन तीव्रता CaCl 2 के अलावा पर तुरंत वृद्धि होगी, और फिर कैल्शियम आयनों mitochondria में प्रवेश के रूप में मिनट के पाठ्यक्रम पर क्षय होगा । क्षय समाप्त होने तक प्रतीक्षा करें (& #8776; 5 min). mitochondrial कैल्शियम का निर्धारण करने के लिए अतिरिक्त कैल्शियम boluses जोड़ें [Ru] के साथ इलाज नहीं कोशिकाओं की प्रतिक्रिया.
    5. में एक और cuvette युक्त 5 & #181; M [निय], 1.5.4.3 में ऊपर बताए गए प्रयोग को दोहराएं । अवरोधक की उपस्थिति में, उत्सर्जन तीव्रता में वृद्धि होगी, लेकिन क्षय नहीं । इस निरीक्षण का प्रतीक है अवरुद्ध mitochondrial कैल्शियम के ऊपर ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यह विधि mitochondrial कैल्शियम का एक संश्लेषण का वर्णन करता है... (ओह2) (nh3)4आरयू (µ-O) आरयू (nh3)4(OH2)] सीएल5 से शुरू [Ru (एनएच3)5सीएल] सीएल2, ए अच्छी तरह से ज्ञात ruthenium (III) शुरू सामग्री । [आरयू (एनएच3)5सीएल] सीएल2 आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा विशेषता है, कंपन मोड के साथ ३२०० सेमी-1, १६०८ सेमी-1, १२९८ सेमी-1, और ७९८ सेमी-1 (चित्रा 1) में । २०६९ सेमी-1 पर एक मामूली नापाक [आरयू (एनएच3)5एन2] सीएल3के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । 1 मीटर एनएच4ओह मुलाजिम के साथ इस आरयू (III) प्रजातियों की प्रतिक्रिया [(ओह2) (NH3)4आरयू (µ-O) आरयू (NH3)4(ओह2)] सीएल5. इस प्रतिक्रिया की प्रगति पीले से हरे रंग में समाधान का एक नाटकीय परिवर्तन का सबूत है । अंतिम प्रतिक्रिया समाधान गहरे हरे रंग में है । इस समाधान के अंलीकरण एक रंग बदलने में केंद्रित एचसीएल परिणामों के साथ ब्राउन करने के लिए; इस बेअसर का प्रतिफल अमोनियम क्लोराइड है, जो अंतिम उत्पाद को दूषित कर सकता है अगर देखभाल व्यायाम नहीं है । कटियन के माध्यम से यौगिक आय की शुद्धि-विनिमय जोरदार अम्लीय जाल (एच+ फार्म) राल का उपयोग कर क्रोमैटोग्राफी. राल ०.१० एम एचसीएल के साथ पहले equilibrated है, और [(ओह2) (एनएच3) के समाधान4आरयू (µ-O) आरयू (एनएच3)4(oh2)] सीएल5 स्तंभ पर लोड है । 1 एम एचसीएल वॉश के साथ अमोनियम क्लोराइड शोधकार्य elutes है । Ruthenium-युक्त यौगिकों उच्च एचसीएल सांद्रता पर elute । पीले रंग की एक श्रृंखला है, जिसमें कोई प्रतिक्रिया नहीं [आरयू (NH3)5सीएल] सीएल2 शुरू सामग्री, जब एचसीएल एकाग्रता १.५ मीटर है कॉलम के बंद आते हैं । 2.5-3.0 M HCl के बीच वांछित उत् पाद elutes, और परिणामी अंशों को हरे-भूरे रंग में हरा दिखाई देता है ।

उत्पाद के अंशों को पूलिंग करने से पहले, उनकी शुद्धता सत्यापित की जानी चाहिए. वांछित यौगिक अपनी यूवी विज़ स्पेक्ट्रम में कुछ पीएच निर्भरता प्रदर्शित करता है, क्योंकि हम वर्णक्रमीय सुविधाओं अंशों के सभी के लिए एक ही हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए अत्यधिक बुनियादी 3 मीटर एनएच3 समाधान करने के लिए अंशों के छोटे aliquots जोड़ने का सुझाव देते हैं । शुद्ध अंश केवल ३६० एनएम पर एक तीव्र शिखर प्रदर्शित करना चाहिए और ६०० एनएम (चित्रा 2) पर एक कमजोर चोटी । ४८० और ५३३ एनएम के पास चोटियों ruthenium ब्राउन और लाल की उपस्थिति का संकेत है, क्रमशः, और २६० एनएम पर एक महत्वपूर्ण चोटी, २९० एनएम पर एक कंधे के साथ, [आरयू (एनएच3) की उपस्थिति का प्रतीक है5सीएल] सीएल2 शुरू सामग्री (चित्रा 3 ). शुद्ध अंश के रोटरी वाष्पीकरण एक हरे-भूरे रंग के ठोस के रूप में वांछित यौगिक affords ।

अलग यौगिक आगे दोनों यूवी विज़ और IR स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा विशेषता हो सकती है । यूवी विज़ स्पेक्ट्रम (चित्रा 2) ३६० एनएम और ऊपर वर्णित के रूप में ६०० एनएम अवशोषक बैंड प्रदर्शित करता है । ६०० एनएम बैंड के लिए विलुप्त गुणांक ८५० मीटर-1सेमी-1 है और ३६० एनएम बैंड के लिए २७००० एम-1सेमी-1है । ६०० एनएम बैंड की तुलना में ३६० एनएम बैंड की तीव्रता का अनुपात पीएच ७.४ पंजाबियों में 31 होना चाहिए, और इस मीट्रिक को प्रभावी ढंग से यौगिक की शुद्धता नापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । IR स्पेक्ट्रम के रूप में प्रकट होना चाहिए चित्रा 4में दिखाया गया है । निय-O-निय टूटती आवृत्ति, उदाहरण के लिए, नैदानिक ८५० सेमी-1पर है । IR स्पेक्ट्रम के लिए आरयू-O-आरयू खिंचाव निर्धारित करने के लिए और कोई अमोनियम क्लोराइड अंतिम उत्पाद में मौजूद था सुनिश्चित करने के लिए कार्यरत था । अमोनियम क्लोराइड, एक आम नापाक, १७६२ सेमी-1 (बहुत कमजोर) और १४०० सेमी-1 (मजबूत) है कि आसानी से IR स्पेक्ट्रम (चित्रा 5) से समझदार किया जा सकता है पर कंपन मोड है । Ruthenium लाल प्रतिक्रिया का एक आम प्रतिफल है और १४०४ सेमी-1, १३०० सेमी-1, १०३७ सेमी-1 और ८०० सेमी-1पर फैला के साथ आईआर स्पेक्ट्रम में पहचाना जा सकता है, हालांकि कुछ इच्छित उत्पाद के साथ ओवरलैप हो जाएगा ( चित्र 6) ।

digitonin-permeabilized हेला कोशिकाओं में कैल्शियम की अधिकता प्रतिक्रिया (चित्रा 7) मनाया जाता है । तारक CaCl2 बोल्स के अतिरिक्त संकेत देता है । [(ओह2) (एनएच3) की उपस्थिति में4आरयू (µ-O) आरयू (एनएच3)4(ओह2)] सीएल5 उत्सर्जन तीव्रता में वृद्धि कैल्शियम इसके अलावा पर मनाया जाता है, लेकिन mitochondrial कैल्शियम के कारण कोई क्षय यह देखा जाता है ।

Figure 1
चित्र 1 : [आरयू (एनएच3) के अवरक्त स्पेक्ट्रा5सीएल] सीएल2। के अवरक्त स्पेक्ट्रा [आरयू (nh3)5सीएल] सीएल2 के साथ एक बहुत छोटे [आरयू (nh3)5N2] cl3 नापाक । लाल तीर २,०६९ सेमी-1पर अशुद्धता को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : प्रतिनिधि यूवी की तुलना में शुद्ध सामग्री के लिए स्पेक्ट्रा । [(ओह2) (एनएच3)4आरयू (µ-ओ) आरयू (एनएच3)4(oh2)] सीएल5 यूवी विज़ स्पेक्ट्रा और के पास अवरक्त (इनसेट) पीएच ७.४ पंजाब में लिया । ३६० एनएम में प्रमुख अवशोषक के लिए विलुप्त गुणांक २७,००० एम-1 सेमी-1है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : यूवी की तुलना में क्रूड प्रतिक्रिया मिश्रण की स्पेक्ट्रा । [(ओह2) (एनएच3)4आरयू (µ-ओ) आरयू (एनएच3)4(oh2)] सीएल5 यूवी विज़ स्पेक्ट्रा पीएच ७.४ पंजाबियों में लिया शुद्धि से पहले कच्चे तेल की प्रतिक्रिया के मिश्रण । लाल तीर आम अशुद्धियों को इंगित करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : शुद्ध सामग्री के लिए प्रतिनिधि अवरक्त स्पेक्ट्रा । के अवरक्त स्पेक्ट्रा [(oh2) (एनएच3)4आरयू (µ-O) आरयू (nh3)4(ओह2)] सीएल5. आरयू-O-आरयू खिंचाव ८५० सेमी-1पर है, अंय हिस्सों एनएच3 oscillators से कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5/>
चित्र 5 : अवरक्त स्पेक्ट्रा युक्त एनएच4सीएल अशुद्धियों । के अवरक्त स्पेक्ट्रा [(ओह2) (एनएच3)4आरयू (µ-O) आरयू (एनएच3)4(oh2)] सीएल5 अमोनियम क्लोराइड नापाक के साथ । लाल तीर १,४०० सेमी-1पर अमोनियम क्लोराइड को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : वाणिज्यिक ruthenium लाल के अवरक्त स्पेक्ट्रा । के अवरक्त स्पेक्ट्रम [(ओह2) (एनएच3)4आरयू (µ-O) आरयू (nh3)4(ओह2)] सीएल5 (ब्लैक ट्रेस) और वाणिज्यिक ruthenium लाल (लाल ट्रेस) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : प्रतिनिधि कैल्शियम की अधिकता का परिणाम है । digitonin-permeabilized हेला कोशिकाओं के एक कॉकटेल के लिए कैल्शियम के जोड़ के कारण प्रतिदीप्ति वृद्धि, कैल्शियम ग्रीन-5N और [(oh2) (एनएच3)4आरयू (µ-ओ) आरयू (एनएच3)4(oh2)] Cl5 BGSS में । कोरा कोई [(ओह2) (एनएच3)4आरयू (µ-O) आरयू (एनएच3) शामिल है4(OH2)] सीएल5 और प्रतिदीप्ति कमी के कारण सीए2 + में mitochondria को देखा जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

mitochondrial कैल्शियम की अधिकता को रोकना [(OH2) (एनएच3)4आरयू (µ-ओ) आरयू (nh3)4(OH2)] सीएल5 [आरयू (NH3)5cl] cl2से संश्लेषित किया जा सकता है, एक प्रसिद्ध ruthenium (III) शुरू सामग्री, के रूप में इस प्रक्रिया में वर्णित है । [आरयू (NH3)5सीएल] सीएल2 के संश्लेषण आसानी से कम कठिनाई के साथ हासिल की है । hydrazine हाइड्रेट में 16 ज के लिए RuCl3 सरगर्मी के बाद, समाधान के पीएच 2 के एक मूल्य के लिए एचसीएल के साथ समायोजित किया जाना चाहिए । पीएच ड्रॉप वांछित उत्पाद को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि चाहें, तो इस संश्लेषण के लिए फार्म [आरयू (NH3)5br] br2 HBr में भाटा के बजाय एचसीएल द्वारा संशोधित किया जा सकता है ।

हम कुछ रणनीतियों mitochondrial कैल्शियम के संश्लेषण के दौरान अवांछित शोधकार्य के गठन को कम करने के लिए मनाया है । विशेष रूप से, कुप्पी छाया रखने इस प्रतिक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है; यदि कुप्पी खुला है, तो ruthenium लाल (RuRed) सहित अन्य प्रतिफलों की संख्या प्रशंसनीय मात्रा में बनाई जाती है । संभवतः, गैसीय अमोनिया खुली प्रतिक्रिया पोत से खो दिया है, और इस घटना वांछित उत्पाद के गठन समझौता । कुप्पी और जलीय अमोनिया की मात्रा का आकार भी महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित से काफी संशोधित नहीं किया जाना चाहिए रहे हैं, जैसा कि हमने देखा है कि इस प्रतिक्रिया की क्षमता छोटी कुप्पी में कमी आई है । इस विधि में तेजी से अंय दो तरीकों हम पहले खुलासा किया था की तुलना में इस परिसर की उपज में वृद्धि नहीं करता है । यह करता है, तथापि, कम कदम होते है और कम साइड उत्पाद गठन, जैसे RuRed के लिए वृद्धि दे । कम उपज की एक छोटी राशि की उपस्थिति के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है [Ru (एनएच3)5सीएल] सीएल2 के साथ ही अज्ञात अत्यधिक आरोप लगाया अशुद्धियों है कि कॉलम के शीर्ष पर बरकरार रखे हैं । हालांकि हम कई अतिरिक्त प्रतिक्रिया शर्तों का पता लगाया नहीं है, यह संभव है कि सुधार प्रतिक्रिया समय और प्रतिक्रियात्मक सांद्रता अलग से महसूस किया जा सकता है, उच्च पैदावार प्राप्त करने के लिए ।

[(oh2) की शुद्धि (एनएच3)4आरयू (µ-O) आरयू (nh3)4(ओह2)] सीएल5 इस प्रोटोकॉल का सबसे थकाऊ और मुश्किल भाग है । एक अच्छी तरह से पैक कॉलम बहुत जुदाई में सहायता करेगा; घोल के रूप में राल लोड हो रहा है एक प्रभावी दृष्टिकोण के लिए कॉलम पैक है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एचसीएल एकाग्रता के रूप में कॉलम रेफरेंस के पाठ्यक्रम पर बढ़ा है, राल आकार में अनुबंध होगा. सफलतापूर्वक शुद्ध सामग्री प्राप्त करने के लिए, दर जिस पर एसिड एकाग्रता वृद्धि हुई है कहा प्रक्रिया से विचलित नहीं करना चाहिए. अंतिम उत्पाद एक हरे-भूरे रंग का ठोस होगा; एक बुनियादी समाधान गहरे हरे रंग का हो जाएगा, लेकिन अंलीय समाधान भूरे रंग का हो जाएगा । यदि एक चमकीले गुलाबी-लाल समाधान मनाया जाता है, ruthenium लाल संदूषण मौजूद हैं । RuRed की मात्रा विलुप्त होने गुणांक (६२,००० M-1· cm-1 पर ५३३ एनएम) का उपयोग करके निर्धारित की जा सकती है । इस शुद्धि प्रक्रिया मजबूत कटियन के लिए अपेक्षाकृत सामांय है-विनिमय राल कॉलम ।

mitochondrial कैल्शियम अधिक संकोच निषेध permeabilized हेला कोशिकाओं का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है, फ्लोरोसेंट कैल्शियम सेंसर कैल्शियम ग्रीन-5N, और एक spectrofluorimeter. 13 , 14 इस परख कोशिकाओं की एक बड़ी मात्रा में है और इसलिए एक बहुत बड़ी ५०० सेमी2 पेट्री डिश में संस्कृति के जरूरत प्रवर्धन की आवश्यकता है । उजागर सतह क्षेत्रों बहुत बड़ी हैं क्योंकि इन बड़े संस्कृति कुप्पी सूक्ष्म जीवाणु को कम करने में अतिरिक्त चुनौतियों को रोकने के । काम एक लामिना प्रवाह कैबिनेट में किया जाना चाहिए बाँझ बनाए रखने के लिए । permeabilized हेला कोशिकाओं में कैल्शियम ग्रीन-5N की प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी से नजर आती है. cuvette करने के लिए कैल्शियम की एक बाहरी बोल्स के अलावा प्रतिदीप्ति में एक तत्काल वृद्धि, कैल्शियम आयनों संवेदक के साथ बातचीत से उत्पंन होने से चलाता है । एक अवरोध करनेवाला के अभाव में कई मिनट के दौरान, तीव्रता mitochondria में इन कैल्शियम आयनों की वजह से क्षय, एक organelle कि डाई द्वारा पहुँचा नहीं जा सकता. जब इस परख बाहर कैल्शियम आयनों के एक बोल्स के अलावा एक अवरोधक की उपस्थिति में किया जाता है उत्सर्जन की तीव्रता में वृद्धि करने के लिए वृद्धि देता है । mitochondrial कैल्शियम के कारण क्षय, तथापि, मौजूद नहीं है, इस यौगिक के mitochondrial कैल्शियम निरोधात्मक के गुणों का सत्यापन । इस प्रक्रिया में कैल्शियम के लिए एक सामान्य स्क्रीन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, इस प्रक्रिया के हित के अंय युकेरियोटिक कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है । यह परख बाहरी सेलुलर झिल्ली के permeabilization पर निर्भर करता है इस प्रकार एक जटिल की सेलुलर क्षमता के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है ।

संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल संश्लेषण और एक उपंयास ruthenium आधारित mitochondrial कैल्शियम का शोधन अवरोधक की शुद्धि का वर्णन । यह यौगिक mitochondrial कैल्शियम के जीव विज्ञान और स्तनधारी कोशिका के फिजियोलॉजी में अपनी भूमिका का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण मूल्य का है. परीक्षण के लिए अपेक्षाकृत सरल परख mitochondrial कैल्शियम के साथ साथ नए अवरोधकों की स्क्रीनिंग और जांच के लिए उपयोग की भी है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

इस शोध को कॉर्नेल विश्वविद्यालय ने समर्थन दिया था । यह काम सामग्री अनुसंधान के लिए कॉर्नेल केंद्र का उपयोग किया साझा सुविधाएं, जो NSF MRSEC कार्यक्रम (अनुदान DMR-११२०२९६) के माध्यम से समर्थन कर रहे हैं । S.R.N. एक NSF स्नातक अनुसंधान फैलोशिप (अनुदान डीजीई-१६५०४४१) और डॉ दवे Holowka कैल्शियम प्रयोगों के साथ सहायता के लिए द्वारा समर्थन स्वीकार करता है । किसी भी राय, निष्कर्षों, और निष्कर्ष या सिफारिशों इस सामग्री में व्यक्त लेखकों (ओं) के वे कर रहे है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के विचारों को प्रतिबिंबित ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ruthenium Trichloride hydrate Pressure Chemical 3750
Concentrated hydrochloric acid J.T. Baker 9535
Concentrated ammonium hydroxide Mallinckrodt Chemical Works A669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 Mesh Alfa Aesar 13945
Calcium Green 5N Invitrogen C3737
Digitonin Aldrich 260746
DMSO Aldrich 471267
EGTA Aldrich E3889
KCl USB 20598
KH2PO4 Aldrich P3786
MgCl2 Fisher Scientific M33-500
HEPES Fluka 54466
Sodium Succinate Alfa Aesar 33386
EDTA J.T. Baker 8993-01
Glucose Aldrich G5000
200 Round bottom flask ChemGlass CG-1506-14
Glass stopper ChemGlass CG-3000-05
10 mm x 15 cm glass column with reservoirs Custom - similar to Chemglass columns Similar to CG-1203-20
DMEM Corning 10-017-CV
FBS Gibco 10437028
PBS Corning 21-040-CV
Round bottom Falcon tubes Fisher Scientific 14-959-11B 
500 cm2 petri dishes Corning 431110
Trypan blue ThermoFisher Scientific 15250061
Hemacytometer Aldrich Z359629
Acrylic Cuvettes VWR  58017-875
UV-Vis spectrometer Agilent Model Cary 8454 
Spectrofluorimeter SLM Model 8100C
IR spectrometer Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment
Centrifuge ALC Model PM140R
Inverted light microscope VWR  89404-462

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
  2. Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
  3. Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
  4. De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
  5. Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
  6. Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
  7. Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).
  8. Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
  9. Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
  10. Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
  11. Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
  12. Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
  13. Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
  14. Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).

Tags

केमिस्ट्री इश्यू १२८ Ru360 Mitochondria कैल्शियम Mitochondrial कैल्शियम Uniporter Ruthenium रेड Bioinorganic केमिस्ट्री
संश्लेषण और एक Ruthenium आधारित Mitochondrial कैल्शियम का मूल्यांकन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nathan, S. R., Wilson, J. J.… More

Nathan, S. R., Wilson, J. J. Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor. J. Vis. Exp. (128), e56527, doi:10.3791/56527 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter