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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

O efeito do estresse osmótico em vesículas secretoras e exocitose de monitoramento

Published: February 19, 2018 doi: 10.3791/56537
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology, 2Department of Chemistry and Molecular Biology, University of Gothenburg

Summary

Estresse osmótico afeta a exocitose e a quantidade de neurotransmissor liberado durante este processo. Demonstramos como combinando métodos eletroquímicos juntamente com microscopia eletrônica de transmissão pode ser usado para estudar o efeito da pressão osmótica extracelular na atividade de exocitose, vesículas quantal tamanho e a quantidade de neurotransmissor liberado durante a exocitose.

Abstract

Amperometry gravação de células submetidas a choque osmotic mostrar que as células secretoras respondem a este estresse físico, reduzindo a atividade de exocitose e a quantidade de neurotransmissor liberado de vesículas em eventos de exocitose único. Sugeriu que a redução de neurotransmissores expulso é devido a alterações nas propriedades biofísicas de membrana quando células encolhem em resposta a estresse osmótico e com as suposições feitas que secretoras vesículas no citoplasma celular não são afetadas pela pressão osmótica extracelular. Amperometry gravação de exocitose monitora o que é liberado das células no momento uma vesícula funde-se com a membrana plasmática, mas não fornece informações sobre o conteúdo da vesícula antes da fusão de vesículas é disparada. Portanto, combinando amperometry gravação com outros métodos analíticos complementares capazes de caracterizar as vesículas secretoras antes de exocitose em células é disparada oferece uma visão mais ampla para analisar como secretoras vesículas e o processo de exocitose são afetados pelo choque osmótica. Aqui descrevemos como complementar amperometry gravando com citometria eletroquímica intracelular e imagem de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão pode ser usado para caracterizar alterações no conteúdo de tamanho e neurotransmissor de vesículas secretoras no células cromafins em relação à atividade de exocitose antes e após a exposição ao estresse osmótico. Vinculando-se as informações quantitativas adquiridas com experimentos usando todos os três métodos analíticos, conclusões foram feitas anteriormente que vesículas secretoras responderem a pressão osmótica extracelular a encolher no tamanho e reduzindo o tamanho da vesícula quantal a manter uma concentração de neurotransmissor de vesículas constante. Portanto, isto dá algum esclarecimento sobre por vesículas, em resposta a estresse osmótico, reduzem os neurotransmissores montante lançados durante lançamento de exocitose. As gravações de amperométrico aqui indicam que este é um processo reversível e essa vesícula após choque osmotic são recarregados com neurotransmissores quando colocadas células são revertidas em um ambiente de isotônico.

Introduction

Células cromafins em glândulas supra-renais são células neuroendócrinas que liberam moléculas de neurotransmissor na corrente sanguínea. Isto ocorre através de um processo celular que envolve o encaixe e a fusão de vesículas cheias de neurotransmissores, resultando em liberação de conteúdo de vesículas para o espaço extracelular em um processo chamado exocitose. Os neurotransmissores (adrenalina e noradrenalina) nas células cromafins são ativamente transportados por proteínas de membrana em vesículas grande núcleo denso (LDCVs) e armazenados em altas concentrações (~0.5-1 M)1,2. Acúmulo de neurotransmissores dentro as LDCVs é conseguido a afinidade das moléculas de catecolaminas para a matriz de proteína intravesicular denso núcleo composta de cromogranina proteínas (~ 169 mg/mL),3,4,5 ,6e uma solução de cocktail intravesicular contendo componentes-chave para armazenamento e carregamento de catecolaminas da vesícula como o ATP (125-300mm)7, Ca2 + (50-100 µM na solução e ~ 40 mM ligado para o matriz de proteína)8, Mg2 + (5 mM)9, ascorbato (10-30 mM)10e um pH de11,de ~5.512. Os LDCVs mantenham uma condição de iso-osmótica com a célula citoplasma (310 mOsm/kg)13, mesmo que a concentração de soluto teórica dentro as vesículas soma até mais de 750 mM. A composição dos componentes intravesicular não só é essencial para o carregamento e armazenamento de catecolaminas, mas também para a agregação de solutos para a matriz de proteína de núcleo denso. Isto reduz significativamente a osmolaridade das vesículas é significativamente reduzida e pode afetar a catecolamina quantidade que é liberada durante a exocitose5,6.

Estudos sobre o efeito da pressão osmótica extracelular sobre o processo de exocitose por gravação amperométrico relataram essa alta pressão osmótica extracelular inibe a atividade de exocitose e reduz o número de neurotransmissores secretados de único vesículas compartimentos4,14,15,16,17,18,19. As explicações destas observações têm especulado sobre o possível reforço do apinhamento macromolecular em eventos de fusão de vesículas inibindo o célula citoplasma e uma alteração nas propriedades biofísicas de membrana que afetam o número de neurotransmissores liberados durante a exocitose. Estes pensamentos assumiram que alto estresse osmótico extracelular não afeta o tamanho de vesículas quantal, que define o número de moléculas de neurotransmissor armazenado em um compartimento de vesículas na fase prévia de exocitose desencadeada14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. em amperométrico medições de exocitose liberação de células únicas, um microeléctrodo de disco de fibra de carbono é colocado em contato com a superfície da célula, criando um conjunto experimental até imitando a configuração de sinapse, onde o amperométrico eletrodo serve como um detector pós-sináptico (Figura 1)22,23. Estimulando uma célula a exocitose, pode-se induzir vesículas cheias de neurotransmissores se fundem com a membrana plasmática de célula e liberar a parte ou o conteúdo completo da vesícula para o espaço extracelular. Estas moléculas de neurotransmissor liberadas na superfície do eléctrodo podem ser detectadas eletroquimicamente se os neurotransmissores são eletroativos (por exemplo, catecolaminas) aplicando um potencial redox de 700 mV vs um eletrodo de referência Ag/AgCl . Por conseguinte, uma série de picos de corrente marca a detecção de eventos individuais exocitose. A corrente contra rastreamento de tempo em uma gravação de amperométrico, a área sob cada espiga amperométrico único representa a carga detectada por evento de exocitose e pode ser convertida para a toupeira de neurotransmissores liberados, usando a equação de Faraday. Portanto, as gravações amperométrico fornecem informações quantitativas sobre os neurotransmissores quantidade expelidos de eventos único exocitose e relatam sobre a frequência de eventos de exocitose, mas não apresentam informações quantitativas sobre as vesículas secretoras iniciou-se o conteúdo antes da fusão de vesículas e liberação de neurotransmissores.

Portanto, para obter uma melhor compreensão de como secretoras vesículas na célula citoplasma responder ao estresse osmótico extracelular antes que a célula é acionada para se submeter a exocitose, outros métodos analíticos complementares podem ser usados para enriquecer esta informação. Por exemplo, para investigar se estresse osmótico altera o volume de vesículas, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) análise de imagem pode ser usada para medir o tamanho de vesículas de células após a fixação química. Para examinar se estresse osmótico afeta tamanho quantal vesículas, uma técnica recentemente desenvolvidos amperométrico chamada citometria eletroquímica intracelular, pode ser aplicado para a quantificação do conteúdo de neurotransmissor de vesículas em vesículas secretoras no seu estado nativo quando ainda residindo no citoplasma das células vivas,26. Na técnica de citometria de eletroquímica intracelular, um eletrodo cilíndrico de fibra de carbono de nanotip é delicadamente inserido no citoplasma das células vivas e, aplicando um potencial de mV 700 para o eletrodo (eletrodo de referência vs um Ag/AgCl), o conteúdo de catecolaminas nas vesículas pode ser quantificado pela detecção de um pico de corrente redox de vesículas único colidindo, fixando e posteriormente estocàstica ruptura na superfície do eletrodo e, assim, liberando seu conteúdo contra o eletrodo superfície26. Portanto, no amperométrico atual contra rastreamento de tempo, cada evento rompendo vesícula única pode resultar em uma corrente transitória e, integrando a área de cada pico atual, o tamanho quantal vesículas pode ser calculado usando a lei de Faraday´s.

Portanto, vinculando-se as informações quantitativas adquiridas com medições de tamanho de vesículas utilizando TEM imagens juntamente com a análise de tamanho de quantal de vesículas, como registrado por citometria de eletroquímica intracelular, concentração do neurotransmissor de vesículas pode também ser determinada. Isto permite a caracterização de vesículas quando as células estão expostas a diferentes condições osmóticos e fornece uma visão melhor sobre como vesículas podem responder ao estresse osmótico extracelular na fase antes da exocitose. Os resultados da combinação desses métodos demonstraram que na presença de extracelular alta pressão osmótica, vesículas encolhem e ajustar seu tamanho quantal e mostra que, comparar as informações quantitativas sobre alterações relativas a partir dessas medições enquanto a encolher, vesículas ajuste seus conteúdos e tamanho para manter um neurotransmissor constante concentração24. Assim, este entendimento é valioso em conexão com as observações feitas na liberação do neurotransmissor em células expostas ao estresse osmótico. Estes protocolos, descrevemos o uso dessas três metodologias complementares que permitem a caracterização das vesículas secretoras como em seu ambiente nativo responder a osmolalidade extracelular e os efeitos da resposta sobre a exocitose processo. Além de nossas observações anteriores sobre o efeito da alta pressão osmótica na exocitose24, apresentamos experimentos adicionais que descrevem a recuperação celular após choque osmótica e o efeito de vários estímulos de bário em cromafim células.

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Protocol

1. celular cultura de bovinas células cromafins isoladas por digestão enzimática de glândulas supra-renais

  1. Para isolar células cromafins coletadas de bovinos das glândulas supra-renais, esterilize células com solução de etanol 70%. Apare fora gordura e tecido conjuntivo usando um bisturi. Para remover o sangue, lave as veias adrenais usando solução de Locke (NaCl 154 mM, KCl 5.6 mM, NaHCO3 3.6 mM, hidroxietil piperazineethanesulfonic ácido (HEPES) 5,6 mM, pH 7,4) que tem sido termostatizada a 37 ° C.
  2. Digerir o tecido, inflar cada glândula injetando aproximadamente 2,5 mL de filtrado estéril 0,2% colagenase P solução morna na veia adrenal, usando uma seringa e incubar o tecido por 20 min a 37 ° C. Examine as glândulas para garantir que o processo de digestão da medula é concluído. O tecido deve se sentir mole e não tensa.
  3. Colete a medula digerida por cortar fora as glândulas no sentido longitudinal. Picar o tecido da medula usando um bisturi. Filtrar a suspensão de tecido sobre uma peneira de aço e diluir com solução de Locke está a aproximadamente um volume de 50 mL para reduzir a atividade da colagenase P.
  4. As células em 300 g de x em uma centrífuga durante 10 minutos à temperatura de pelotas e coletar em tubos de ensaio estéreis de 50 mL. Ressuspender o pellet obtido na solução de 20 mL do Locke e filtrar a solução ao longo de uma malha de nylon 100-µm estéril para tubos.
  5. Misturar a suspensão de células cromafins com Percoll estéril (1:1) e centrifugar a solução de célula a 18.600 x g por 20 min em temperatura ambiente. Recolher a camada superior do gradiente de densidade e filtrar a solução ao longo de uma malha de nylon de 100 µm para tubos.
  6. Para excluir Percoll, dilua a suspensão de células com Locke solução e centrifugar 300 x g por 10 min à temperatura ambiente antes de re-suspender a pelota na solução do Locke. A densidade estimada de célula de suspensão de células isoladas é aproximadamente 4 milhões células/mL.
  7. Para gravação amperométrico de exocitose e medições de citometria intracelular, células cromafins de placa no colagénio IV revestido 60 mm plásticos pratos em uma densidade de cerca de 17,5 × 103 células/cm2 e incubam a 37 ° C em um 5% CO2 células meio ambiente. Realizar os experimentos de eletroquímicos dentro de 1-3 dias de cultura de células.
  8. Para a temperatura de imagem experimentos, células cromafins do prato em frascos de cultura de células de 75 cm2 em uma densidade de 7 milhões de células por balão e incubar a 37 ° C, num ambiente 5% CO2 por 1 dia.

2. única célula exocitose Amperometry experimentos24

  1. Para fabricar fibra de carbono microeletrodos para estas experiências, tome um vidro capilar com um diâmetro externo apropriado para o eléctrodo na fase principal que será usado nesses experimentos. Use um capilar de vidro borosilicato com diâmetro exterior de 1,2 mm de diâmetro interno de 0,69 mm.
    1. Conecte uma das extremidades da capilares para um tubo de aspiração de água. Lugar 5 µm de diâmetro fibras de carbono em algo, como um pedaço de papel branco, para melhorar a visualização.
    2. Identificar uma única fibra de carbono e segure a fibra em uma extremidade com o dedo para manter a fibra de carbono no lugar enquanto a extremidade aberta do capilar de posicionamento em proximidade com a extremidade livre da fibra da carbono. Delicadamente, Aspire a fibra de carbono para o capilar de vidro para que a fibra de carbono se destaca através de ambas as extremidades do capilar. Afaste-se da força de aspiração.
  2. Colocar um extrator de micropipeta capilar com a fibra de carbono e puxar o vidro capilar em duas pontas de pipetas de vidro separado. Para desconectar a fibra de carbono que é conectada entre as pontas de dois vidros, use um par de tesouras para cortar a fibra de carbono e ganhar dois microeletrodos de fibra de carbono.
  3. Sob um microscópio, coloque a fibra de carbono em cima de uma lâmina de microscópio mais grossa que permite o corte manual da fibra carbono na borda de onde a fibra é alargar a partir do revestimento capilar de vidro, usando um bisturi.
  4. Depois de cortar a fibra de carbono, deixando uma ponta de vidro revestido de fibra de carbono, inserir alguns mm da ponta do eletrodo em uma solução de epóxi para 10 min puxar para cima da cola epoxy e selar qualquer possível espaço aberto entre a fibra de carbono e o vidro ao redor. Levante os eléctrodos lentamente fora a solução de epóxi para evitar que gotas de cola volumosos formando na ponta do eletrodo.
  5. Coloque os eléctrodos sobre um suporte (por exemplo, uma vara de madeira plana) com dois lados pegajosa fita resistente ao calor para que os eletrodos podem ser anexados. Asse os eléctrodos de epóxi tratada durante a noite em estufa a 100 ° C. O eletrodo dicas facilmente quebram se entram em contacto com uma superfície, para garantir os eléctrodos sempre são armazenados com segurança usando um suporte onde os eletrodos são fixados no lugar e dicas não o risco de ser tocado.
  6. Para obter uma superfície de eletrodo de disco liso, coloque o eletrodo no suporte de um microgrinder e bisel cada eletrodo de fibra de carbono em um anjo de 45°. Depois de chanfradura, marca o capilar na sua superfície usando um marcador permanente para depois saber como localizar a superfície do eletrodo de disco em um ângulo de 45°, quando da colocação do eletrodo perto de células para a medição de exocitose.
    Nota: Este passo é importante como estas experiências, o eletrodo de disco oval deve ser colocada horizontalmente em cima de células com sua superfície e paralelo à superfície da caixa de Petri. Também, chanfrando eletrodos são feitos no mesmo dia como experimentos para assegurar uma superfície de eletrodo fresco e limpo.
  7. Antes de usar, coloca cada microeletrodos de fibra de carbono em uma solução de teste (por exemplo, dopamina de 0,1 mM em tampão PBS (pH 7,4)) para monitorar o estado estacionário atual utilizando voltametria cíclica. Para uma verificação de voltametria cíclica, aplicar uma forma de onda potencial do triângulo de-0.2 V para mais 0,8 V vs um eletrodo de referência Ag/AgCl a 100 mV/s para garantir boa reação cinética dados obtidos que estão de acordo com valores teoricamente calculados para um disco de 5 µm de diâmetro fibra de carbono microeletrodos25.
  8. Para a gravação de amperometry de exocitose, coloque a placa de Petri com culturas de células cromafins em um microscópio invertido. É importante proteger o microscópio configurar com uma gaiola de Faraday, para eliminar o ruído eletrônico durante a gravação, devido as correntes muito pequenas sendo medidas amperometry. Use um microscópio de fase de aquecimento para manter uma temperatura de 37 ° C durante os experimentos de célula.
  9. Usar um instrumento de braçadeira do remendo de baixo ruído para aplicar um potencial constante de 700 mV para o eletrodo de trabalho contra um eletrodo de referência Ag/AgCl que também é colocado a placa de Petri longe o eletrodo de trabalho. Gravação de exocitose de células cromafins, digitalizar o sinal de 10 kHz e aplicar uma interna passa-baixa filtro de Bessel de 2 kHz para filtrar o sinal gravado.
  10. Para executar amperométrico gravação em células individuais, monte o microeléctrodo de disco recentemente testado e chanfrada da fibra do carbono no porta eletrodo do palco principal que é usado com o potentiostat.
    1. Cuidadosamente coloque o eletrodo com o disco oval plana forma eletrodo superfície virado para baixo em direção à superfície apical da célula e o eletrodo em contato com a membrana da célula, usando um micromanipulador.
    2. Ajustar a distância entre o eletrodo para a célula, monitorando a deformação da célula causada pelo eletrodo após colocação em cima da membrana celular e em seguida, retraia cuidadosamente o eletrodo para uma distância onde a célula recupera uma forma perto de sua forma original de célula . O ideal para gravação de cinética e quantitativa é criar uma fina película de líquido de 100 nanômetros para separar a superfície do eletrodo e células, que são de condições semelhantes para a deteção pós-sináptica de liberação química de uma sinapse.
  11. Para estimular as células a exocitose, posicionar uma micropipeta de vidro com um tamanho de bico de 2-3 µm de diâmetro, preenchido com solução de BaCl2 de 5mm a uma distância de pelo menos 20 µm longe da célula, para evitar qualquer solução vazando de ponta da pipeta para influenciar o experimentar e aplicar um pulso de injeção 5 s de 5 mM BaCl2 solução na superfície da célula para estimular a célula a exocitose.
  12. Para estudar os efeitos reversíveis da pressão osmótica no processo de exocitose, preparar uma solução-tampão isotônica (150 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, glicose de 5 mM, 10 mM HEPES, pH 7,4) com 310 mOsm/kg de pressão iso-osmótica e um buffer hipertónica feita ajustando o NaCl de concentração da solução-tampão isotônica com uma osmolalidade correspondente a 730 mOsm/kg.
  13. Coloque as pilhas no buffer isotônico e estimular a célula para exocitose aplicando um pulso de injeção de bário enquanto gravava as transientes de corrente amperométrico durante a atividade de exocitose iniciados por aproximadamente 3 min.
    1. Para comparar as respostas de exocitose em condições isotónicas às condições hipertónica, Incube as celulas por 10 min em solução tampão hipertônica e posteriormente aplicar um pulso de injeção de bário para estimular a exocitose e executar 3 min de gravação amperométrico.
    2. Para a resposta reversível das células, incubar as células novamente por 10 min em solução tampão isotônica e estimular células aplicando um 5s injeção de bário do pulso e executar 3 min de gravação a resposta de exocitose da célula.
  14. Como experimentos de controle para determinar o efeito sobre a atividade de exocitose por vários estímulos de bário, realizar uma gravação amperométrico de exocitose lançamento de três consecutivos BaCl2 estímulos na mesma célula colocados em tampão isotônico e usando o mesmo protocolo de tempo para os experimentos de incubação de células consecutivas com osmolaridade diferente.

3. intracelular Cytometry eletroquímica24,26

  1. Para fabricar eletrodos para medições de tamanho quantal vesículas, usar os mesmos materiais e começar a preparar um 5 µm em eletrodo de fibra de carbono de diâmetro de acordo com as descrições nas seções 2.1 e 2.2 da fabricação de microeletrodos para exocitose amperométrico medições.
  2. Sob um microscópio, use um bisturi para cortar a fibra de carbono estendendo fora a ponta do vidro para que uma fibra de carbono com um comprimento que varia de 30 a 100 µm é deixada de fora da ponta de vidro.
  3. Para preparar uma flama gravado ponta do eletrodo de fibra de carbono, use uma chama de butano. Para conseguir um uniformemente gravado, ponta de eletrodo em forma cilíndrica, segure o eletrodo cilíndrico em forma de fibra de carbono enquanto rodá-la e colocar a fibra de carbono estendendo-se desde o vidro na borda azul da chama do butano até a ponta do carbono desenvolve um vermelho Cor. Isso geralmente leva menos de 2 s. Se for bem sucedida, isso resulta em um tamanho de ponta de eletrodo gravado de 50 a 100 nm de diâmetro (uma imagem SEM de tal dica é mostrada na Figura 5B). Depois chama decapagem, coloque o eléctrodo sob um microscópio para avaliar a ponta do eletrodo.
  4. Inserir o microeléctrodo cilíndrico nanotip em solução de epóxi para 3 min, seguido por um 15 s mergulhando de ponta do eletrodo em uma solução de acetona. Isso permite que o epóxi selar o espaço potencial da lacuna entre a fibra de carbono e a parede capilar de vidro isolante, enquanto a acetona limpa o epóxi fora da superfície do eletrodo gravado da fibra do carbono. Para curar o epóxi, asse os eléctrodos em estufa durante a noite a 100 ° C.
  5. Antes de usar, testar a corrente de estado estacionário de microeletrodos cada fibra de carbono, conforme explicado na seção 2.7 utilizando voltametria cíclica. Para experiências, apenas usar eléctrodos que exibem um platô atual em torno de 1.5-2.5 at27.
  6. Para as medições amperometry intercelular, colocar as células em microscópio, conforme descrito em 2.8 e usar as mesmas configurações experimentais do potentiostat, conforme descrito em 2.9.
  7. Para executar a medição amperométrico intracelular e para evitar danos físicos significativos para a célula, insira o microeléctrodo cilíndrica de nanotip a célula adicionando um mecânico suave forçar, apenas o suficiente para empurrar o elétrodo através do plasma celular membrana e para o citoplasma da célula usando um micromanipulador.
  8. Após a inserção e com a membrana da célula, selado em torno do eletrodo cilíndrico, inicie a gravação de amperométrico in situ na célula viva. Na oxidação potencial que é aplicada ao eletrodo, vesículas irão adsorver na superfície do eletrodo e estocàstica romper.  Portanto, não há nenhuma necessidade para qualquer tipo de estímulo para iniciar este processo.
  9. Para determinar o efeito osmótico no tamanho quantal vesículas, colete as medições de citometria intracelular de um grupo de células que têm sido incubados em isotônica e hipertônica buffer usando a condição experimental, conforme descrito na seção 2.13.

4. dados análise de gravações Amperometry

  1. Para analisar os dados de amperometry gravado de exocitose e vesículas intracelulares tamanho quantal análise, use um programa de software que permite a análise de transientes atuais no atual gravado contra rastreamento de tempo assim tão cinético parâmetros de pico e a carga total integrada para picos de corrente individuais pode ser determinada. Para análise de dados, usamos software desenvolvido no laboratório de Sulzer, o que foi escrito para o programa de análise de dados Igor28.
  2. Quando analisar o amperométrico picos, selecione um limite para picos de três vezes o raiz da média quadrado (RMS) desvio-padrão do ruído para cada gravação.
  3. Coletar os picos amperométrico de cada gravação de célula manualmente para evitar picos de falsos que não siga a forma gaussiana, o dobro de pontos que podem ser o resultado de eventos exocitose mesclado e só aceita Gaussian em forma de picos com um limite de três vezes maior do que o ruído de RMS.
  4. Recolher os dados para o custo total por amperométrico único pico e usar a lei de Faraday (N = QnF) para calcular a quantidade molar de neurotransmissor de catecolamina detectado por exocitose ou evento de ruptura de vesícula única intracelular, onde N é os moles de neurotransmissores, passando por uma reação redox na superfície do elétrodo, Q = carga total detectada sob cada spike, n = número de elétrons transferidos na reação redox (n = 2 para catecolaminas) e o Faraday´s constante F = 96485 C/mol.
  5. Realizar análise estatística dos dados coletados pelo primeiro calcular a carga média detectada por evento para cada célula. Então para a variação entre as células, calcular a carga média entre as células e usar um de t-Student entre células assumindo Variância desigual. Este estudo utilizou o programa MATLAB para análise estatística.

5. TEM imagens para análise de tamanho de vesículas

  1. Para executar a imagem TEM de células em diferentes condições osmóticos, primeiro Incube as celulas em tampão isotônica ou hipertônica por 10 min a 37 ° C em 5% CO2 ambiente antes fixação química das células.
  2. Realize a fixação de células usando o método fixador de Karnovsky29. Usando esse método, incubar as células com uma solução contendo 0,01% de azida de sódio, 1% de formaldeído e glutaraldeído de 1,25%, em que a amostra pode ser armazenada a 4 ° C.
  3. Após a fixação, lavam-se as células com tampão de cacodylate de sódio 0,15 M.
  4. Manchar a célula amostras post fixação e em preparação para TEM imagem, incubam as células com uma solução de tetróxido de ósmio 1% para 2 h a 4 ° C, seguido de incubação de 1 h em solução de acetato de uranilo 0,5% à temperatura ambiente no escuro.
  5. Em uma etapa final da fixação, desidrata as células primeiro enxaguando as células em etanol 100% e depois enxaguar células com acetona.
  6. Incorporar as amostras de células em epoxyresin e posteriormente realizar a centrifugação a 4.000 x g por 30-40 min e permitir que a amostra de células polimerizar a 40 ° C por 15 h seguido de incubação de 48 h a 60 ° C.
  7. Em preparação para a imagem latente, seção amostra celular incorporado em ágar 100 resina em fatias com espessura de 60 nm, utilizando um ultramicrotome.
  8. Submeter as células a uma solução de etanol acetate/25% de uranilo 4% durante 4 min, seguido por 20 s de lavagem com água. Lavar as células com citrato de chumbo de Reynolds por 3 min, seguido por 20 s de lavagem com água.
  9. Imagem de microscopia eletrônica de transmissão de amostras de células de executar. Em nossos experimentos, nós usamos um microscópio eletrônico de transmissão que foi operado em 120 kV.
  10. De cada imagem gravada de uma seção de célula ilustrando a ultraestrutura celular que exibe uma população das vesículas no citoplasma celular, primeiro calibre o tamanho de pixel da imagem, relacionando os pixels para a barra de escala gravada em cada imagem TEM. Use o software de imagem para determinar os tamanhos de vesículas em cada imagem de células expostas a condições isotônicas ou hipertônica. Em nossos experimentos, utilizamos o software ImageJ para análise de imagem. É interessante notar que para análise de imagens de ultraestrutura celular de imagens TEM de células, ajuste do tamanho dessas medições com base na espessura das seções de célula precisa ser considerado e têm sido descritas anteriormente por Almers´s laboratório30.

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Representative Results

Aqui descrevemos o protocolo para como combinar imagens TEM juntamente com duas metodologias eletroquímicas, fibra de carbono amperometry e intracelular citometria de eletroquímica, pode fornecer informações que ganha uma visão mais ampla, aludindo ao efeito de pressão osmótica extracelular em vesículas secretoras e o processo de exocitose. Comparando o representante amperométrico gravações de liberação de exocitose no única células cromafins usando o experimental Setup (mostrado na Figura 1), uma redução significativa na atividade os foi exibida quando as células foram expostas a osmótica estresse em comparação com células em condições isotónicas (Figura 2A)24. Estas gravações e usando a lei de Faraday´s, a carga total detectado por cada amperométrico individual atual pico foi utilizado para calcular o número de moléculas expelido de eventos de exocitose de vesículas único em células expostas a diferentes osmótica condições. Por comparação, conforme exibido na Figura 2B , pela menor área do amperométrico média atual pico detectado pelas células em solução hipertônica, menos moléculas de neurotransmissor foram liberadas de cada vesícula por células sentindo estresse osmótico24 .

Para determinar a reversibilidade deste declínio no número de moléculas de neurotransmissor liberado, realizamos gravações amperométrico de exocitose em células expostas a um ambiente hipertônico e, posteriormente, em células depois colocado de volta em um isotônico meio ambiente. Nesses experimentos, células cromafins foram estimuladas três vezes consecutivas com BaCl2 solução: primeiro em um tampão isotônico, seguido de um segundo estímulo após as células foram incubadas durante 10 minutos em uma solução hipertônica e, finalmente, uma terceira estimulação após incubação de célula 10 min em condições isotónicas. Os resultados conforme exibido na Figura 3A apresentam-se de que a quantidade de neurotransmissores liberada foi reduzida em ~ 50% quando as células foram expostas à condição hipertônica em relação à primeira Ba2 + estimulação na condição isotônica. Posteriormente, quando as células foram trazidas de volta para um ambiente isotônico e submetidas a um terceiro estimulação2 + Ba, o neurotransmissor do montante lançado por evento de exocitose inverteu-se volta ao montante original gravado no primeiro estímulo, que confirmado anteriores observações14. Experiências de controle com três sucessivas estimulações2 + Ba de células na condição isotônica (ver Figura 3B) mostram que vários estímulos Ba2 + sequenciais em condições isotónicas não alterou o neurotransmissor quantidade lançado durante a exocitose. Isto sugere que vesículas quantal tamanho é reversível e rapidamente ajustado com osmolaridade extracelular.

No entanto, ao analisar os traços amperométrico destas experiências em termos de atividade de exocitose, tornou-se evidente, conforme exibido na Figura 4A, essa atividade de exocitose significativamente foi prejudicada quando as células foram expostas a estresse hipertónica. Durante o estresse osmótico, eventos de exocitose foram reduzidos para 12% da atividade em células na condição isotônica. Posteriormente, após o choque osmotic e células foram colocadas volta em um ambiente isosmotic, células recuperaram a 41% de sua atividade original de exocitose. Curiosamente, os experimentos de controle realizadas em condições isotónicas mostradas, conforme exibido na Figura 4B, que depois de realizar três consecutivos BaCl2 estimulações, a frequência de eventos de exocitose foi reduzida para 53% após um estímulo de segundo e ainda mais até 26% pela terceira estimulação em comparação com o primeiro estímulo. Daqui, é claro que consecutivos Ba2 + estimulações não parecem afetar o número de neurotransmissores liberados de cada vesícula quando exocitose é acionado, mas influencia significativamente a eficiência do processo de liberação de vesículas.

Para investigar como secretoras vesículas em seu ambiente nativo são afetados pelo estresse osmótico extracelular em termos de volume de vesículas ou tamanho quantal, análise de tamanho de vesículas utilizando imagens de temperatura foi combinado com citometria eletroquímica intracelular em células exposto a condições isotônicas e hipertônica. Nas experiências de citometria eletroquímica intracelular, um eletrodo de nanotip de fibra de carbono foi inserido no citoplasma das células cromafins ao vivo quando colocadas em solução isotônica e hipertônica (como mostrado na Figura 5.) O pico de corrente resultante amperométrico foi monitorado de cada vesícula no citoplasma celular colidindo, fixando e estocàstica romper e liberar o conteúdo de vesículas na superfície do eletrodo amperométrico após26a rebentar. A carga total integrada detectada para cada pico na corrente contra rastreamento de tempo foi usada para calcular o tamanho de quantal vesícula média em cada célula de gravação pela lei de Faraday´s. Estas medições intracelular cytometry eletroquímica, mostradas na Figura 6 e Figura 7B, demonstrada que o tamanho de quantal vesículas em células expostas ao estresse osmótico foram significativamente reduzidos em comparação com às células em condições isotónicas. Comparando a magnitude da alteração no tamanho quantal de vesículas, medido por citometria de eletroquímica intracelular, ao declínio da quantidade de neurotransmissor liberado durante a exocitose em células osmótica extracelular estressado fracionária , mostrou uma diminuição relativa de 60% no tamanho quantal e o neurotransmissor montante lançado em comparação com às células em condições isotónicas (Figura 7)24. Para relacionar o ajuste no tamanho quantal vesícula para uma potencial variação na concentração de neurotransmissores vesículas de células experimentando pressão osmótica, realizou-se análise de imagem TEM para determinar o tamanho de vesículas de células expostas a isotônica e hipertônica condições. Além disso, a coloração escura do núcleo denso da proteína matriz dentro do LDCVs que é visualizado nas imagens TEM como uma esfera escura na membrana ligado vesículas foi usada para medir o volume da matriz de núcleo denso nessas vesículas. Tal como apresentado na Figura 8, vesículas tamanho foi reduzido para 60% em células expostas ao stress osmótico extracelular, comparado com às células em condições isotónicas. Desde o volume calculado do diâmetro medido do LDCV e o núcleo denso, o volume da solução circundante auréola que aparece como uma solução clara dentro do LDCVs nas imagens TEM também foi calculada. Os resultados resumidos a partir da análise de imagem TEM mostrou, conforme exibido na Figura 8, que durante o choque de osmótica extracelular é principalmente reduzir o volume da solução de halo nos LDCVs que é24.

Figure 1
Figura 1 : Única célula exocitose amperometry. Um esquema do conjunto experimental acima para medição amperométrico de exocitose no single cromafins células24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: amperométrico traços de medições de exocitose.  (A) A gravação de amperométrico representativa de exocitose em células cromafins isotônica (cor preta) e ambientes extracelular hipertónica (cor vermelha). (B) alargamento de um pico de média amperométrico de medição exocitose das células cromafins de isotônico (preto) e hipertônica ambientes extracelular (vermelho)24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : A reversibilidade do número de catecolaminas liberado na exocitose após choque osmótica. (A) o número de moléculas liberado durante a exocitose de células cromafins (n = 4) por três consecutivos Ba2 + estímulos, com a primeira estimulação isotônica, o segundo em hipertônica e a terceira em tampão isotônico. São mostrados os resultados estatísticos do teste-t não pareado. O p -valor para comparação da primeira Ba2 + estimulação (Ba2 + stim 1) em tampão isotônico com a segunda Ba2 + estimulação (Ba2 + stim 2) no buffer hipertônica é p= 0.1088 e o p-valor para o a comparação da segunda Ba2 + estimulação em solução hipertônica com a terceiro Ba2 + estimulação (Ba2 + stim 3) em tampão isotônica é p = 0.059. Experimento de controle (B) demonstrando a quantidade de moléculas de neurotransmissor liberado em três consecutivas estimulações2 + Ba de células cromafins (n = 4) em tampão isotônico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : O efeito da pressão osmótica na atividade de exocitose. (A) o efeito da osmolaridade extracelular na atividade de exocitose é apresentado como a frequência de eventos de exocitose quando cromafins células (n = 4) são estimulados com solução de bário em isotônica e hipertônica e finalmente em condições de isotônicas. Os valores são apresentados como o número médio de picos de cada célula e a média de todas as células incluídas na amostra (erro padrão da média (SEM)). A significância estatística das mudanças é apresentada usando um teste t para dados não pareados (o p -valor para isotônico Ba2 + estimulação 1 e hipertônica Ba2 + estimulação 2 é p= 0.0126 e o p-valor para comparação de hipertónica Ba2 + estimulação isotônica e 2 Ba2 + 3 é estimulação p= 0.037). Experimento de controle (B) apresentar a frequência de eventos de exocitose após três estímulos de bário consecutivos em células cromafins (n = 4) em condições de isotônicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Eletroquímica citometria de vesículas intracelulares para monitorar as alterações no tamanho quantal vesículas. (A) um esquema do experimental setup usado por citometria de eletroquímica intracelular. (B) uma varredura microscopia eletrônica imagem de um típico nanotip cónico de fibra de carbono eletrodo24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : Medições de citometria eletroquímica intracelular mostrando (A) representante vestígios de gravações de citometria amperométrico intracelular em células cromafins de isotônico (preto) e hipertônica ambientes extracelulares (vermelhos). (B) alargamento de um pico de média amperométrico de medição cytometry intracelular em células cromafins de isotônico (preto) e hipertônica ambientes extracelular (vermelho)24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7 : Quantificação do número de catecolaminas liberados em exocitose e determinação do tamanho de quantal vesícula. (A) o número médio de moléculas lançado durante gravações de exocitose em células cromafins em isotônica (n = 22) e hipertônica (n = 20) ambientes. Os valores são apresentados como um número médio de moléculas lançado por evento de exocitose de cada célula e a média das células amostradas (± SEM). A significância estatística das mudanças são apresentados usando o teste t para dados não pareados (p -valor = 0.0003) (B) o número médio de moléculas por vesículas detectadas por citometria de eletroquímica intracelular em células cromafins em isotônica (n = 19) e hipertônica (n = 16) condições. Os valores são apresentados como o número médio de moléculas por spike, como detectado de cada célula e uma média de todas as células amostradas (± SEM). A significância estatística das mudanças é apresentada utilizando teste t para dados não pareados (p - valor = 0.0108)24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8 : Efeito da pressão osmótica no tamanho de núcleo denso grandes vesículas. O volume calculado das LDCVs, a proteína do núcleo denso e a solução de halo em torno da matriz de proteína núcleo denso foi calculado em attolitres (aL) de análise de imagem de imagens TEM de células cromafins em isotônica (n = 12) e hipertônica (n = 9) amortecedores. Os resultados foram coletados de uma média de 311 vesículas por célula e as médias de células únicas (± SEM). Os p-valores são relatados de testes t não pareados comparando buffers isotônicos e hipertônico. O P-valor é 0.0385 (*) para volume de vesículas 0.3967 para volume de núcleo denso 0.0047 (*) para halo volume24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui apresentamos um protocolo e as vantagens da combinação de três métodos analíticos complementares para análise de vesículas secretoras e o processo de exocitose para ganhar uma melhor compreensão de como uma força física, tais como a pressão osmótica pode afetar vesículas secretoras e o processo de exocitose em células secretoras. Estes métodos incluem amperometry de microeletrodos de fibra de carbono, que é um método estabelecido para gravar a atividade de exocitose, citometria eletroquímica intracelular, que é usada para determinar o tamanho quantal de vesículas em seu ambiente nativo, e análise de imagem transmissão microscopia eletrônica para monitorar o volume de vesículas secretoras. Neste trabalho, através da recolha de dados quantitativos de gravações de amperometry de eventos de exocitose vesícula única em células cromafins expostos a um isotônico e um ambiente extracelular hipertónica, confirmamos esse choque osmotic reduz significativamente a neurotransmissores do montante liberado durante a exocitose e que estas células reversível podem recuperar e liberar a quantidade original, se colocado de volta em um ambiente isotônico (Figura 3).

As gravações de amperométrico forneceram informações da frequência de eventos de exocitose versus tempo e, portanto, também podem ser usadas para monitorar alterações em atividade de exocitose em células em diferentes ambientes osmóticos. Esses dados podem ser interpretados e usados para discernir se a alterações na atividade ocorrerem instantaneamente ou em função do tempo. Como mostramos em trabalhos anteriores, embora stress osmótico dificultado os atividade, não parece impedir a fusão da piscina prontamente liberável de vesículas24. Os dados de atividade de exocitose também podem ser usados para analisar a atividade total os durante um período de tempo de gravação. Aqui nós apresentamos o número acumulado de exocitose eventos de uma gravação de 3 minutos de exocitose em células cromafins expostos às duas diferentes condições osmóticos. Estes dados mostram uma inibição na atividade de exocitose das células experimentando estresse osmótico e que uma recuperação parcial desta atividade pode ser alcançada depois de células retornam para um ambiente extracelular isotônico. No entanto, muito importante, os experimentos de controle mostrou que vários Ba2 + estímulos dentro do prazo usado nesses experimentos causaram uma redução significativa na atividade de exocitose por cada vez que uma célula foi estimulada a secreção. Pela terceira consecutiva Ba2 + estimulação, apenas um terço da atividade exocitose foi mantido, e claramente o bário e talvez também o timing de estímulos nestas experiências, estava afetando o ciclo de vesícula. Isto pode ser relevante para explicar por que os atividade foi recuperada em células colocadas em solução isotônica após o choque osmotic e porque estas células exibido uma redução semelhante relativa em atividade em comparação com células em condições isotónicas após três sequencial Ba2 + estimulações. Daí, amperometry gravação de exocitose fornece informações sobre secretoras vesículas a partir do momento em que as vesículas são acionadas para fundir com a membrana plasmática, liberando os neurotransmissores através do poro de fusão. Assim, dados quantitativos sobre o neurotransmissor única vesícula liberar e podem recolher informações sobre a atividade de exocitose.

A quantidade de neurotransmissor liberado pode ser regulada pelo modo de exocitose que é desencadeada, onde o conteúdo da vesícula completo ou parte do conteúdo é liberado. Estudando unicamente lançamento exocitose usando amperometry de fibra de carbono que só detecta o que é expulso de uma vesícula, é difícil distinguir se uma mudança na quantidade de neurotransmissor liberado a detectado está relacionada a uma alteração no modo de disparo de exocitose, uma mudança nas propriedades biofísicas celulares afetando a liberação de conteúdo de vesículas, ou a alterações no tamanho quantal vesículas. Portanto, complementando a gravação amperométrico de exocitose com medições utilizando a citometria de eletroquímica intracelular, em situ medições do tamanho quantal de vesículas em células vivas podem ser caracterizadas e portanto, usadas para comparar o fração do conteúdo liberação de vesículas de vesículas durante a exocitose26.

Neste trabalho, para investigar se o tamanho de quantal vesícula foi afetado pelo stress osmótico, aplicamos esta técnica para a quantificação e a avaliação do tamanho quantal de vesículas em células expostas a condições isotônicas e hipertônica. Como inserção do eléctrodo nanotip no citoplasma de uma célula viva é considerada bastante invasiva, os experimentos foram realizados apenas uma vez por célula e não foram repetidos na mesma cela. Portanto, estas experiências são preferencialmente executadas como medições individuais de grupos de células selecionadas aleatoriamente expostos a um isotônico e um ambiente extracelular hipertónica. Para comparar alterações no vesicle quantal tamanho medido por citometria de eletroquímica intracelular para alterações no neurotransmissor montante lançado no exocitose, deve-se considerar as condições experimentais de gravação intracelular de correspondência e também realize a gravação de amperometry de exocitose em celas separadas aleatórias. Se estudos são realizados na mesma célula única, é importante nestes protocolos experimentais a considerar também a influência de estímulos de2 BaCl consecutivos e para assegurar as condições experimentais coincidir com aqueles usados por citometria intracelular medições. É também interessante notar que é difícil controlar a colocação exata e a profundidade do eletrodo quando é inserido em uma célula. Assim, cada célula fornece uma amostra aleatória para análise de tamanho de quantal vesículas. Além disso, tamanho quantal vesículas, usando este método de sondagem não distingue diferenças em, por exemplo, maturidade de vesículas e, portanto, também pode adicionar variação para medições. Intracelulares experimentos mostraram que vesículas quantal tamanho foi reduzido em células expostas à pressão osmótica extracelular. A diminuição relativa da quantal tamanho detectado por este método foi comparada com as observações de alterações relativas na liberação de neurotransmissores durante a exocitose. Este estudo constatou que o relativo declínio no tamanho quantal foi na mesma ordem que a queda na liberação de neurotransmissor na células sentindo estresse osmótico.

Para verificar se o estresse osmótico foi alterando a concentração do neurotransmissor de vesículas, o volume da vesícula foi avaliado usando TEM imagem análise para quimicamente fixas células cromafins que tinha sido exposto a condições isotônicas e hipertônica. TEM imagem análise mostrou que vesículas encolhem quando as células estão expostas a um choque osmotic e que a redução relativa de tamanho é ajustada juntamente com o tamanho de vesículas quantal manter um neurotransmissor constante concentração24. A análise de imagem TEM, que fornece resolução de imagem do nanômetro pode distinguir as duas fases, a matriz de proteína de núcleo denso e a solução de halo ao redor dentro LDCVs e assim torna possível determinar o volume da matriz de proteína de núcleo denso e Calcule o volume da solução de halo. A partir desta análise, determinou-se o declínio no volume de vesículas principalmente relacionado a um diminuição do volume da solução halo em torno do núcleo denso da proteína matriz24.

Em resumo, este estudo apresenta um protocolo demonstrando como três métodos analíticos é combinado e permite a caracterização das vesículas secretoras antes neurotransmissor lançamento e que é liberado dessas vesículas quando as células são acionadas para exocitose, para obter uma melhor compreensão de como secretoras vesículas e funções como exocitose é prejudicado pelo estresse extracelular da pilha. Este protocolo também pode ser usado para ajudar a responder perguntas sobre como neurotransmissor liberar a exocitose e vesículas quantal tamanho é afetado por outras alterações no ambiente físico ou por drogas potenciais que podem afetar as células secretoras.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores gostaria de agradecer o Conselho Sueco de pesquisa (349-2007-8680) para financiamento e Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, Suécia) pela doação de bovinos das glândulas supra-renais.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma Aldrich S7653
KCl Sigma Aldrich P9333
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
HEPES Sigma Aldrich H3375
MgCl2 Sigma Aldrich M-2670
Glucose Sigma Aldrich G8270
Collagenase P Roche, Sweden 11 213 857 001
100-µM Nylon mesh Fisher Sientific 08-771-19
Percoll Sigma Aldrich P1677
Collagen IV coated 60 mm plastic dish VWR 354416
Centrifuge Avanti J-20XP
Borosilicate glass capillary Sutter instrument Co., Novato, CA
Micropipette puller Narishing Inc., Japan PE-21
Epoxy solutions (A and B) Epoxy technology, Billerica, MA
Beveller Narishing Inc. EG-400
Inverted Microscope Olympus IX81
Patch clamp Instrument Molecular Devices, Sunnyvale, CA Axopatch 200B
Micromanipulator Burleigh Instrument Inc., USA PCS-5000
Butane Flame Multiflame AB, Hässelholm, Sweden
Transmission electron microscopy Omega Leo 912 AB

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References

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