Summary
Proteina di integrasi del virus schiumoso prototipo ricombinante è spesso contaminata con una nucleasi batterica durante la purificazione. Questo metodo identifica contaminazione nucleasi e lo rimuove dalla preparazione finale dell'enzima.
Abstract
La proteina di integrasi (IN) del virus schiumoso del prototipo di retrovirus (PFV) è un enzima di modello per studiare il meccanismo di integrazione retrovirale. Rispetto IN da altri retrovirus, PFV IN è più solubile e più suscettibili di manipolazione sperimentale. Inoltre, è sensibile a inibitori dell'IN clinicamente rilevanti virus di immunodeficenza umana (HIV-1), suggerendo che il meccanismo catalitico di PFV IN è simile a che di HIV-1 pollici pollici catalizza l'Unione covalente di virale DNA complementare (cDNA) per destinazione DNA in un processo chiamato trasferimento strand. Questa reazione di trasferimento del filo introduce Nick al DNA dell'obiettivo. Analisi dei prodotti di reazione di integrazione possono essere confuso dalla presenza di nucleasi quel nick allo stesso modo del DNA. Una nucleasi batterica è stata indicata per co-purificare con ricombinante IN PFV espressa in Escherichia coli (Escherichia coli). Qui descriviamo un metodo per isolare PFV IN dalla nucleasi contaminante dalla cromatografia di affinità di eparina. Le frazioni sono facilmente schermate per contaminazione di nucleasi con un plasmide supercoiled e l'elettroforesi del gel dell'agarosi. PFV IN e i contaminante nucleasi display alternativo affinità per eparina sepharose permettendo una preparazione nucleasi-free of recombinant PFV IN adatto per analisi biochimiche o singola molecola di massa di integrazione.
Introduction
Gli studi biochimici e singola molecola delle interazioni della proteina con DNA richiedono proteine ricombinanti eccezionalmente pure. Contaminando nucleasi da batteri possa oscurare i risultati di queste analisi. Una nucleasi contaminante è stata trovata in preparazioni a base di proteine ricombinanti ossigeno scavenger protocatecuato-3,4-diossigenasi (PCD) e prototipo virus schiumoso (PFV) integrasi (IN) isolato da Escherichia coli (Escherichia coli)1 , 2 , 3.
Integrazione retrovirale saggi si basano sulla conversione del DNA supercoiled ai prodotti intaccati o lineare come una misura di attività4. Durante l'infezione cellulare IN unisce le due estremità di un cDNA virale per l'host della cromatina5. Ogni estremità unendo la reazione è chiamato filo trasferimento. Saggi di ricombinante IN attività possono aderire due oligomeri del DNA che imita il cDNA virale termina ad un target di DNA in un'integrazione concertata reazione4,5,6,7,8. In alternativa IN ricombinante possono aderire solo un'estremità del DNA in un non-fisiologicamente rilevanti metà sito integrazione reazione9,10. Quando il DNA del plasmide supercoiled è la destinazione di integrazione, i prodotti sono concordate linearizzato DNA e mezza sito integrazione prodotti sono cerchi rilassati. Questi prodotti di reazione sono individuati dalla loro mobilità relativa nel corso di elettroforesi su gel di agarosio1. Se il ricombinante IN ha una nucleasi contaminante, ci saranno spurie cerchi rilassati o un plasmide linearizzato possibilmente confondendo i risultati sperimentali. Oligomeri del DNA virali possono essere etichettati fluorescente per identificare i prodotti di integrazione, al contrario di prodotti nuclease conclusivamente. Tuttavia, IN notevolmente favorisce target DNA supercoiled; qualsiasi perdita del plasmide supercoiled a cerchi rilassati o DNA lineare di contaminante nucleasi potrebbe inclinare risultati e interpretazione di dati11. Quindi è assolutamente necessario rimuovere nucleasi batteriche da retrovirali nelle preparazioni.
PFV IN ha una diversa affinità per l'eparina sepharose rispetto alla nucleasi batterica1. PFV IN e le nucleasi possono essere separati da un'eluizione di pendenza lineare da eparina sepharose. Le nucleasi non è rilevata prontamente da un'assorbanza di ultravioletti (UV) a 280 nm picco o di elettroforesi di analitica sodio dodecil solfato del gel di poliacrilammide (SDS-PAGE). Invece, la nucleasi viene rilevata da un'analisi di attività della nucleasi che impiegano la conversione di un plasmide supercoiled a cerchi rilassati o prodotti lineari. Ogni frazione seguendo cromatografia sepharose eparina è testato per attività della nucleasi. PFV IN e il contaminante nucleasi non hanno alcuna differenza nell'affinità per resina anionica Mono-Q. C'è una piccola differenza di affinità per resina del catione Mono-S. Tuttavia, la risoluzione di Mono-S di nucleasi batterica e PFV IN non consentirebbe efficiente separazione delle proteine. In definitiva, la purificazione di affinità di eparina sepharose offre la migliore separazione di nucleasi batterica da PFV IN e ha il vantaggio di volume di carico illimitato.
Test per attività della nucleasi di contaminanti possono essere adattati ad altre proteine. La proteina di interesse probabilmente avrà caratteristiche di affinità alternativi rispetto IN PFV; la differenza nelle caratteristiche della proteina di interesse e il contaminante di nucleasi di associazione deve essere determinata empiricamente. Questa metodologia per l'identificazione di contaminazione nucleasi può essere adattata a altre resine tra cui Mono-S catione o resine a scambio anionico Mono-Q. Affinità e scambio ionico resine possono offrire un metodo affidabile per isolare una proteina ricombinante di interesse da parte di contaminanti nucleasi senza limiti sul volume della proteina durante la cromatografia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. indurre PFV nell'espressione in e. coli
-
Aggiungere 1 μL di plasmide di espressione IN PFV (10 ng / µ l) a 20 μL di e. coli BL21 (DE3) pLysS (aliquota da 20 μL di celle disponibili in commercio è > 2 x 106 CFU/μg plasmide) in una provetta da 1,5 mL. Mescolare delicatamente dal dito toccando o sfogliando il tubo. Incubare in ghiaccio 5 min.
- Calore shock per esattamente 30 s in un 42 ˚ c bagno d'acqua e quindi tornare immediatamente in ghiaccio per 2 min.
- Aggiungere 80 µ l di brodo super ottimale di temperatura ambiente con media di repressione (SOC) dei cataboliti. Incubare per 1 h a 37 ° c con 225 giri al minuto (rpm) agitazione.
- Piastra 25 µ l della miscela su un 100 mm x 15 mm di Petri contenente 25 mL di agar di brodo (LB) di Luria (L 1 LB agar: bacto-tryptone di 10 g, 10 g NaCl, 5 g Estratto di lievito, 15 g di agar) e 100 μg/mL ampicillina (100 mg/mL di soluzione madre).
- Il restante 75 μL di cellule trasformate in un secondo piatto identico della piastra. Incubare le piastre con i coperchi giù durante la notte a 37 ° C.
-
Recuperare le piastre di trasformato Escherichia coli. Utilizzare una singola Colonia per inoculare 3 mL di LB (1 L LB: 10 g di bacto-tryptone, 10 g di NaCl, 5 g di lievito estratto) completati con 100 ampicillina μg/mL in una provetta di polipropilene cultura fondo tondo 14-mL. Incubare per ~ 8 h a 37 ° c con agitazione 225 giri/min.
- Aggiungere 3 mL di cultura a 50 mL LB completati con 100 μg/mL ampicillina e cloramfenicolo 34 μg/mL (34 mg/mL di soluzione madre) in una beuta da 250 mL. Incubare la coltura durante la notte a 37 ° C con agitazione 225 giri/min.
- Trasferire i 53 mL di coltura LB 1 L, 100 µ g/mL ampicillina e 34 cloramfenicolo μg/mL in un matraccio di Erlenmeyer 4L. Incubare a 37 ° C con agitazione 225 giri/min.
- Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) della cultura periodicamente. Inizialmente, controllare la cultura OD600 ogni h. Come la cultura raggiunge il desiderato OD600, controllare ogni 15 min per non invadere. Far crescere la cultura a un OD600 tra 0,9 e 1.0. Trasferire il pallone in un bagno di ghiaccio e agitare per ridurre la temperatura della cultura.
-
Trasferire 1 mL della coltura in una provetta da 1,5 mL per un'analisi successiva denaturando analisi SDS-PAGE.
- Agglomerare le cellule nel tubo da 1,5 mL mediante centrifugazione per 1 minuto in un microfuge a 14.000 x g a temperatura ambiente. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 150 μL Tampone fosfato salino (PBS) di pipettaggio. Il PBS può essere con o senza CaCl2 e MgCl2.
- Aggiungere 150 µ l di tampone di SDS-PAGE: 2x (150 mM Tris-HCl, pH 6.8, SDS 1,2%, 30% glicerolo, 15% β-mercaptoetanolo (βME), blu di bromofenolo 0,0018%) e mescolare accuratamente da dispensare o vortice. Far bollire per 3 min. Conservare a-20 ° C.
- Aggiungere la coltura batterica: una concentrazione finale di 0,25 mM isopropilico-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, soluzione di riserva di 0,25 M) e 50 μM ZnCl2 (soluzione 50 mM). IPTG induce l'espressione del gene PFV IN dal promotore T7 e ZnCl2 viene aggiunto come un supplemento per il corretto ripiegamento di un dominio del dito di zinco terminale amminico in PFV IN. Incubate la cultura a 25 ° C con agitazione immediatamente a 225 giri/min per 4 h. trasferire il pallone in un bagno di ghiaccio. Salvare 1 mL di coltura per analisi SDS-PAGE, seguendo lo stesso protocollo come sopra al punto 1.3.
-
Trasferire la coltura batterica bottiglie di dimensioni appropriate della centrifuga. Ad esempio, una cultura di 1 L può essere trasferita a quattro bottiglie di polipropilene fondo conico sterile monouso da mL 250. Girare le bottiglie in una centrifuga refrigerata da tavolo a 3000 x g per 20 min a 4 ° c. Scartare i surnatanti versando.
- Tutti i pellet da una coltura batterica 1 L in un volume totale di 25 mL (6,25 mL per flacone) PBS freddo (con o senza CaCl2 e MgCl2) Risospendere pipettando. Combinare e trasferire le sospensioni batteriche in una provetta conica da 50 mL. Girare in una centrifuga refrigerata a 3.000 x g per 20 min a 4 ° C. Scartare il surnatante di versamento o di pipettaggio.
- Risospendere il pellet batterico in 10 mL di tampone di risospensione (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl e l'inibitore della proteasi phenylmethylsulfanoxide (PMSF) 500 μM) di pipettaggio. Snap congelare il pellet inserendo il tubo in un pallone Dewar con azoto liquido sufficiente per immergere il tubo da 50 mL. Rimuovere il tubo da azoto liquido con cautela e conservare a-80 ° C.
Nota: Pellet batteriche possono essere conservati per diversi mesi a-80 ° C. Non abbiamo visto nessuna perdita di proteina attiva dopo stoccaggio di-80 ° C per due anni. -
Analizzare i campioni di pre- induzione e post-induzione di 8,3 cm di larghezza, 7,3 cm di altezza, 0,75 mm spessore SDS-PAGE gel con poliacrilammide 6% 1,5 mL accatastamento strato (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 6% di acrilammide, 0.1% SDS, 0,1% ammonio persolfato, 0.001% TEMED) e 3,5 mL 10% poliacrilammide risoluzione strato (375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10% di acrilammide, 0.1% SDS, 0,1% ammonio persolfato, 0.001% TEMED)12.
- Dopo aver versato il gel d'impilamento, inserire un pettine di ben 10. Quando il gel è polimerizzato, montare l'apparecchiatura di pagina e aggiungere sufficienti buffer in esecuzione di SDS-PAGE (25 mM Tris, glicina 192 mM, 0,1% SDS).
- Caricare 10 µ l di ogni campione e 4 μL di standard di proteina precolorati. Eseguire a 16,5 V/cm fino a quando la parte anteriore della tintura raggiunge il fondo del gel, circa 60 min.
- Smontare le lastre di gel e trasferire il gel in una vasca di plastica. Aggiungi Coomassie Brilliant Blue macchiatura soluzione (0,1% R-250 di blu brillante Coomassie, 40% metanolo, acido acetico 10%) per generosamente coprire il gel e macchiare per 20 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione colorante versando e Sostituisci con decolorare soluzione (40% metanolo, 10% acido acetico) fino a quando le bande sono facilmente visibili. Rimuovere la soluzione decolorante versando e sostituire con acqua deionizzata. PFV IN dovrebbe essere facilmente identificati nel campione post-induzione. PFV IN con un tag di hexahistidine ha un peso molecolare di 47374 Da.
- Se non è visibile IN PFV, ripetere l'induzione a partire con una colonia di diversa da una delle piastre trasformazione.
2. nickel cromatografia di affinità
- Scongelare una batterica precipitato sul ghiaccio.
Nota: Questo richiederà molto tempo (circa 2-3 h). Quando la pallina si è sciolto per liquami una cella, aggiungere un ulteriore 500 μM PMSF (soluzione 100 mM). - Tenere il tubo da 50 mL di batteri dei residui sul ghiaccio. Sottoporre ad ultrasuoni i batteri ad ampiezza di 30% per 30 s (1 s on, 1 s off) a pellet derivato dalla cultura 1L utilizzando un sonicatore con un corno di bio del diametro di 0,5 pollici con un diametro di 0,125 pollici conica microtip, una frequenza di 20 kHz e potenza massima di 400 w.
- Trasferire il campione di cellule in una provetta di freddo ultracentrifuga. Utilizzare in policarbonato bottiglia assembly (diametro 25 mm, 89 mm altezza) compatibile con un rotore ad angolo fisso tipo 60 Ti. Rotori e tubi alternativi possono essere utilizzati se non si ottiene la stessa forza di gravitazione. Spin di 120.000 x g per 60 min a 4 ° C. Ci dovrebbe essere una pallina di ovvia. Il supernatante può avere un colore giallo.
- Trasferire il surnatante da versarsi o pipettare in una provetta conica freddo 50 mL. Nota il volume; Questo volume dovrebbe essere circa il volume di tampone di risospensione utilizzato prima del congelamento di snap. Se il supernatante è viscoso, può essere contaminato da DNA batterico che poteva intasare la colonna di cromatografia. In questo caso, ripetere l'ultracentrifugazione per pellet il DNA batterico.
-
Preparare 500 mL Tampone un (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) e 500 mL Tampone B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, imidazolo 200 mM).
Nota: In questo protocollo, mantenere il sistema di cromatografia in fase liquida (FPLC) proteine veloci, tutti i buffer e il campione a 4 ° C in una camera fredda.- Filtro sterile buffer A e B, con 0,2 μm filtro monouso. A seconda del sistema FPLC, lavare pompa A e pompa B con tampone A e B di Buffer, rispettivamente. Flusso di tampone al 90% e 10% tampone B attraverso il sistema fino a stabilizzano la conducibilità e letture di UV. La portata massima dipenderà sullo strumento; utilizzare una portata di 5 mL/min con un limite di pressione massima di 1,0 MPa.
- Preparare una colonna FPLC 110mm Diametro 5 mm long, con 1,5 mL di resina carica di nichel (capacità di legame massimo 50 mg/mL, massima pressione di 1 MPa). La colonna può essere preparata il giorno prima purificazione e conservata a 4 ° c.
- Collegare la colonna allo strumento FPLC. Equilibrare la colonna con 20 mL di tampone al 90% e 10% tampone B (imidazolo 20 mM) con una portata di 0,5 mL/min con un limite di pressione di 0,5 MPa. Lo strumento dovrebbe essere raccolta dati in tempo reale di conducibilità e di capacità di assorbimento UV a 280 nm (A280). Si dovrebbero stabilizzare la conducibilità e letture di UV. Se queste letture non sono stabilizzati, continuare a buffer del flusso attraverso la colonna fino a quando non sono stabili.
-
Caricare il campione della proteina (~ 10 mL / pellet) alla colonna ad un flusso di 0,15 mL/min con un limite di pressione di 0,5 MPa. La portata e colonna la pressione rimane la stessa durante la purificazione. Raccogliere il flusso attraverso in una provetta da 50 mL.
- Lavare la colonna con 20 mL di tampone al 90% e 10% Buffer B. raccogliere il lavaggio in un tubo da 50 mL. Eluire le proteine con una sfumatura lineare di 20 mL di 10% a 100% tampone B (20mm-imidazolo 200 mM).
- Infine, lavare la colonna con 5 mL 100% tampone B (imidazolo 200 mM). Raccogliere il lavaggio gradiente e finale in frazioni 0,27 mL.
-
Combinare 15 μL di tampone del campione SDS-PAGE 2 x con 15 μL del flusso attraverso, lavare e le frazioni di picco A280 . Bollire i campioni per 3 min.
- Preparare due 10% SDS-PAGE gel come descritto in precedenza nel passaggio 1.6 tranne con ben 15 pettini. Caricare 10 µ l di ogni campione per il gel e 4 μL di standard di proteina precolorati. Eseguire, macchia e analizzare i gel come descritto al punto 1.6.
- Combinare le frazioni che sembrano contenere quasi puro IN PFV basato su ispezione visiva. Misurare il volume di pipettaggio, solitamente 8-10 mL.
- Misurare A280 delle frazioni combinate con uno spettrofotometro e calcolare la quantità totale di PFV di proteine; il nostro rendimento tipico è ~ 10 mg / L di cultura indotta. Il coefficiente di estinzione di PFV IN con il tag hexahistidine è 59360 cm-1 M-1.
- Per rimuovere il tag hexahistidine, supplemento al PFV IN con 10 mM dithiothreitol (DTT, soluzione madre 1 M) e 0,1 mM EDTA, pH 8.0 (soluzione 0,5 M). Aggiungere 15 μg di proteasi 3C rhinovirus umano (HRV) per mg PFV IN. Incubate a 4 ˚ c durante la notte. Clivaggio riduce il peso molecolare IN PFV da 47374 Da a Da 44394 e può essere verificato dall'analisi di 10% SDS-PAGE.
3. cromatografia di affinità eparina
-
Preparare 250 mL C Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF) e 250 mL Tampone D (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF, NaCl di 1m).
Nota: In questo protocollo, il sistema FPLC, buffer e campione sono tenuti in una cella frigorifera a 4 ˚ c.- Filtro sterile buffer C e D con 0,2 unità di filtrazione monouso μm. A seconda del sistema FPLC, lavare pompa A e pompa B con Buffer C e D del Buffer, rispettivamente. Flusso di Buffer C l'80% e 20% Buffer D attraverso il sistema fino a stabilizzano la conducibilità e letture di UV. La portata massima dipenderà sullo strumento; Utilizziamo abitualmente una portata di 5 mL/min con un limite di pressione massima di 1,0 MPa.
-
Preparare una colonna FPLC lunga, 5 mm diametro 80 mm con 1 mL di resina di sepharose eparina (massima capacità legante 2,0 mg di bovino in resina di antitrombina III / mL; pressione massima 1,4 MPa). La colonna può essere preparata il giorno prima purificazione e conservata a 4 ° C. Collegare la colonna allo strumento FPLC.
- Equilibrare la colonna con 20 mL di Buffer C l'80% e 20% D Buffer (200 mM NaCl) ad una portata di 0,5 mL/min con un limite di pressione di 1 MPa. Lo strumento dovrebbe essere raccolta dati in tempo reale di conducibilità e di capacità di assorbimento UV a 280 nm (A280). Si dovrebbero stabilizzare la conducibilità e letture di UV. Se queste letture non sono stabilizzati, continuare a buffer del flusso attraverso la colonna fino a quando non sono stabili.
- Ridurre la concentrazione di NaCl del campione PFV IN a 200 mM con l'aggiunta di 1,5 volumi C. Buffer Ad esempio, aggiungere 15 mL di Buffer C 10ml PFV in. Il nostro volume totale è in genere ~ 25 mL.
-
Il campione diluito IN PFV alla colonna di sepharose eparina a 0,5 mL/min di portata con pressione massima di carico limite 1,0 MPa. La portata e colonna la pressione rimane la stessa durante la purificazione. Raccogliere il flusso attraverso in una provetta conica da 50 mL.
- Lavare la colonna con 20 mL di Buffer C l'80% e 20% D Buffer (200 mM NaCl), raccogliendo il lavaggio in una provetta conica da 50 mL. Eluire la colonna con una sfumatura lineare di 30 mL di 20% a 100% D Buffer (200 mM a 1 M NaCl).
- Lavare la colonna con 5 mL di 100% Buffer D. raccogliere il gradiente e lavaggio finale in frazioni di 0,37 mL.
- Analizzare il carico, il flusso attraverso, lavare e frazioni dell'8% SDS-PAGE come descritto in 2.9. PFV IN seguito clivaggio del tag hexahistidine ha un peso molecolare di 44394 Da e il coefficiente di estinzione rimane 59360 cm-1 M-1 senza il tag hexahistidine. Memorizzare tutte le frazioni a 4 ˚ c fino al completamento di un'analisi di nucleasi.
4. analisi di nucleasi
-
Identificare le frazioni di sepharose eparina che sembrano contenere quasi puro PFV poll. combinare 3 μL di frazione di eparina e 50 ng di 3 kb plasmide supercoiled DNA nella reazione del buffer (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 μM ZnCl2 10 mM DTT) con un volume finale di 15 μL. Incubare a 37 ° c per 90 min Include un controllo negativo con nessun PFV IN.
- Fermare la reazione con proteinasi K di 1 mg/mL (20 mg/mL di soluzione madre) e 0,5% SDS (10% soluzione di riserva). Incubare a 37 ° C per 1 h. campioni possono essere conservati a-20 ° C per un'analisi successiva.
-
Preparare un gel 125 mL di 1% in peso per volume (p/v) agarose in tampone di x TAE 1 (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) con 0.1 µ g/mL etidio bromuro (10 mg/mL di soluzione madre)13. Sciogliere la soluzione di agarosio e versate ad un vassoio di colata di gel 15 x 10 cm. Inserire un pettine di ben 15 con ampia, pozzi di spessore 0,75 mm 5 mm. Pozzi sottile resa migliore risoluzione di banda rispetto ai pozzi spessore 1,5 mm. Lasciare che il gel a solidificare a temperatura ambiente.
- Immergere il gel in 1 x TAE con 0,1 µ g/mL di bromuro di etidio. Aggiungere 3,5 μL di 6x loading dye (50% glicerolo, 0,15% Orange G tintura) per le reazioni di dosaggio di nucleasi. Caricare l'intero volume al gel. Esegua il gel a tensione costante, 10 volt per centimetro (100 V) a temperatura ambiente per 1 ora o fino a quando la parte anteriore della tintura di Orange G raggiunge la fine del gel.
-
Immediatamente l'immagine del gel dell'agarosi con uno scanner fluorescente impostato per rilevare il bromuro di etidio. DNA lineare deve essere eseguito con taglia indicata 3 kb, DNA supercoiled dovrebbe più veloce (~ 2 kb), e rilassato cerchio DNA va più lento (~3.5 kb).
- Utilizzando software di analisi di immagine, calcolare il volume di pixel del plasmide supercoiled, lineare e rilassante cerchio in ogni corsia. Chiamare la somma del pixel volumi per queste tre forme di DNA "DNA totale" valore e utilizzano per calcolare la percentuale dei cerchi lineare e rilassati. Ad esempio, il volume di pixel dei cerchi rilassati è diviso per il valore del pixel del DNA totale in quanto Vicolo, moltiplicare questo numero per 100 per determinare una percentuale. Le frazioni che contengono contaminante nucleasi visualizzano una percentuale più elevata dei cerchi lineare e rilassati rispetto al controllo negativo.
- Combinare le frazioni di sepharose eparina che non vengono visualizzati attività della nucleasi contaminanti. Dializzare in 10 mm 6-8 kDa peso molecolare in taglio tubi dialisi (MWCO) a 4 ° C durante la notte contro 1 L di 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl2, 10 mM DTT, 20% glicerolo.
- Recuperare il campione di PFV IN nucleasi-free da tubi di dialisi. A280 di misurare e calcolare la concentrazione finale di proteine. Aliquotare e snap congelamento in azoto liquido. Conservare le aliquote a-80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ricombinante IN PFV è spesso contaminato con una nucleasi batterica1. Le analisi biochimiche integrazione dipendono la quantificazione della conversione del DNA del plasmide supercoiled cerchi rilassati e prodotti lineari. La presenza di una contaminante nucleasi potrebbe portare a spuria quantificazione di queste analisi. Espressione di PFV IN con un tag hexahistidine è indotta in e. coli (Figura 1) e prima purificati mediante cromatografia di affinità di nichel (Figura 2). Le frazioni con quasi puro PFV IN sono combinate e il tag hexahistidine è clivato da una proteasi. Abbiamo determinato che PFV IN e le nucleasi contaminante hanno diverse affinità per l'eparina sepharose cromatografia (Figura 3)1. Frazioni di PFV IN seguito cromatografia sepharose eparina sono incubate con un plasmide supercoiled analizzare per cerchi rilassati e plasmide linearizzato, i prodotti dell'attività della nucleasi (Figura 4). Questo test consente l'identificazione delle frazioni proteiche senza nucleasi (Figura 5). Queste frazioni possono essere combinate, dializzate e congelate per futuri esperimenti.
Figura 1: Induzione di PFV IN e. coli . Cellule da culture prima (lane 2) e dopo induzione (corsia 3) sono analizzati per la presenza di campioni da. PFV IN, 47374 erano separate da 10% SDS-PAGE e macchiato con l'azzurro brillante di Coomassie. Lane 1, marcatori di peso molecolare (kDa). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Le frazioni di cromatografia di affinità del nichel. Lisati batterici solubili sono stati separati mediante cromatografia di affinità di nichel. PFV IN con un tag di hexahistidine è stato eluito con una sfumatura lineare di 20mm-imidazolo di 200 mM. Le frazioni sono state valutate di 10% SDS-PAGE e macchiato con l'azzurro brillante di Coomassie. Da PFV IN, 47374, è prontamente apparente nel campione caricato alla colonna (carico), ma è meno evidente nel flusso attraverso o lavare. Le frazioni che eluire presto nella sfumatura imidazolo comunemente visualizzare un contaminante di mobilità più lento vicino 75 kDa, nonché alcuni contaminanti di mobilità più veloce pari o inferiore a 25 kDa. Alle più alte concentrazioni di imidazolo non ci sono nessun contaminanti prontamente apparente e PFV IN sembra essere relativamente puro. In questo esempio, frazioni #33 e #84 sono state combinate e ulteriormente purificate. Marcatori di peso molecolare (kDa) sono a sinistra di ogni gel. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Cromatografia di sepharose eparina of PFV IN 1 . A seguito di rimozione di affinità e proteasi di nichel del tag hexahistidine, PFV IN (44394 Da) è stato frazionato da eparina sepharose. Proteine sono state eluite con una sfumatura lineare da 200 mM a 1 M di NaCl. Anche frazioni #12 e #44 sono state valutate 8% SDS-PAGE macchiato con Coomassie blu. Marcatori di peso molecolare (kDa) sono a sinistra di ogni gel. Queste frazioni sono state testate per l'attività della nucleasi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Dosaggio di nucleasi di frazioni di sepharose eparina 1 . Ogni frazione di sepharose eparina è stato aggiunto al DNA del plasmide supercoiled. Frazione numeri correlano a quelli mostrati nella Figura 3. A seguito di incubazione, le reazioni di nucleasi erano deproteinato e separati da 1% di agarosio con etidio bromuro. Controlli negativi includono il DNA del plasmide con nessuna proteina (solo destinazione) e una purificazione precedente di tipo selvaggio IN PFV privi di nucleasi (PFV IN WT). Un controllo positivo per contaminare l'attività della nucleasi è una purificazione precedente of cataliticamente inattivo IN PFV che è noto per avere contaminante nucleasi (PFV IN D128N). Indicatori di dimensione del DNA sono mostrati in kb. Plasmide supercoiled (SC), plasmide lineare (L) e rilassate cerchi (RC) sono indicati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Quantificazione dell'analisi della nucleasi 1. dell'agarosi gel sono stati scannerizzati e i valori dei pixel sono stati quantificati per supercoiled (SC), lineare (L) e bande di cerchio rilassato (RC) in ogni corsia. Frazione numeri correlano a quelli mostrati nelle figure 3 e 4. Le percentuali dei cerchi lineare e rilassati sono state calcolate utilizzando i valori dei pixel e l'equazione indicata. Ad esempio, il pixel valori per le bande della frazione #12 sono: plasmide supercoiled 817636, 50467 lineare plasmide e 112052 cerchi rilassati. Il valore del pixel del DNA totale per frazione #12 è la somma di questi valori, 980155. La percentuale di DNA lineare è 50467 moltiplicato per 100 per la percentuale e diviso per il valore di DNA totale pari al 5,1%. La percentuale di cerchi rilassati è 112052 moltiplicato per 100 e diviso per il valore di DNA totale pari al 11,4%. La somma delle percentuali di cerchio lineare e rilassato è 16,5%. DNA plasmidico di controllo negativo con nessuna proteina (non IN, grafico in basso) indica che questa preparazione del plasmide incluso 4,4% del DNA totale come cerchi lineare o rilassati. Un secondo controllo negativo era una purificazione precedente di tipo selvaggio PFV IN (WT) che visualizzato 8,6% del DNA totale come cerchi lineare o rilassati. Queste corsie di due controllo indicano il livello di sfondo del plasmide linearizzato o intaccato presente con il substrato da solo e con PFV poll. Un controllo positivo è una purificazione precedente of cataliticamente inattivo IN PFV (D128N) che aveva il 23% del DNA totale come cerchi lineare e rilassati. Il DNA esposto alle frazioni di eparina sepharose #12 e #22 ha provocato > 10% del DNA come cerchi lineare e rilassati. In questo esempio, frazioni 24 # a #42 visualizzate < 10% conversione ai cerchi lineare e rilassati. Queste frazioni sono state combinate e dializzate. Le aliquote sono state congelate e conservate a-80 ° C per un uso futuro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proteine ricombinanti che interagiscono con il DNA, come proteine, spazzini di ossigeno per le applicazioni di microscopia di singola molecola, o retrovirali integrases, di riparazione del DNA dovrebbero essere liberi di contaminanti batterici nucleasi2,3. Questi contaminanti possono confondere l'interpretazione dei risultati durante saggi biochimici o singola molecola alla rinfusa.
Abbiamo trovato che una nucleasi batterica frequentemente co-purifica con PFV poll. Tuttavia, PFV IN Visualizza un'affinità per l'eparina sepharose che è facilmente distinguibile dalla nucleasi batterica contaminante1. La chiave per preparazione di nucleasi-free IN PFV è l'attenta quantificazione di attività di nucleasi in ogni frazione seguendo eluizione di pendenza da eparina sepharose. La pendenza deve essere sufficientemente bassa per consentire la separazione di PFV IN dal contaminante nucleasi; una pendenza non sarebbe compatibile con una separazione efficace. Inoltre, il substrato di DNA del plasmide dovrebbe avere una bassa percentuale di cerchi rilassate per ridurre lo sfondo del dosaggio della nucleasi. Se il substrato di DNA del plasmide ha un'alta priorità bassa dei cerchi rilassate, dovrebbe essere effettuata una nuova purificazione di DNA plasmidico. L'analisi di attività della nucleasi rivela la presenza dei contaminanti nucleasi e frazioni che devono essere eliminate.
In alcuni casi, cromatografia di esclusione di formato (SEC) può essere un metodo efficace per la rimozione di un contaminante nucleasi2. Gruppi precedenti hanno usato SEC durante la purificazione di PFV IN4. SEC ha un volume di carico limitata e tende a ridurre la concentrazione finale di proteine. Il vantaggio principale di affinità e cromatografia a scambio ionico è la possibilità di caricare una quantità significativamente maggiore rispetto SEC.
Test per l'attività della nucleasi possono essere adattati a diverse proteine che co-purificano con una nucleasi batterica. Qui ci identifichiamo IN PFV e una nucleasi contaminante possono essere separata mediante cromatografia a sepharose eparina. Precedentemente abbiamo indicato che PFV IN ha un profilo simile a nucleasi con Mono-S catione e cromatografia a scambio anionico Mono-Q che rende queste resine inadatto per questa proteina. A seconda delle caratteristiche di affinità della proteina voluta in relazione alla nucleasi, questo protocollo può essere usato con resine di affinità o scambio ionico ed eluizione di pendenza. La chiave efficace rimozione di contaminazione della nucleasi da una proteina di interesse è una differenza di affinità per una resina. Ogni frazione deve essere analizzati per attività della nucleasi. Le resine di cromatografia del presente protocollo non possono essere applicate direttamente a tutte le proteine che co-purificano con nucleasi batteriche. Tuttavia, il concetto generale dell'utilizzo di un'affinità o resina a scambio ionico per separare le nucleasi da una proteina di interesse e testando le frazioni per attività della nucleasi può essere ampiamente applicabile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NIH AI099854 e AI126742 a chiave.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21/DE3 Rosetta E. coli | EMD Millipore | 70956-4 | |
| LB broth | EMD biosciences | 1.10285.0500 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| IPTG | Denville Scientific | CI8280 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF | Amresco | 0754 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250 | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Heparin Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0998-01 | |
| HRV14 3C protease | EMD Chemicals | 71493-3 |
References
- Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
- Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases. Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Li, M., Craigie, R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration. J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).
- Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. Jr, Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).
- Sinha, S., Grandgenett, D. P. Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells. J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).
- Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase. J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).
- Vora, A. C., Grandgenett, D. P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. , Cambridge, MA (2017).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
