Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento e cultivo de rato adulto cardiomyocytes ventricular (ARVC). ARVC isolado pode ser usado para o cultivo de curto e longo prazo. O isolamento e cultivo da ARVC podem desempenhar um papel chave no desenvolvimento de novos esquemas de tratamento para doenças cardíacas.
Abstract
Em um coração intacto, células adjacentes influenciam cardiomyocytes adulto. Com o método de isolamento e cultivo de adultos cardiomyocytes, uma investigação precisa do comportamento dessas células sob ambientes e tratamentos específicos é possível. Este manuscrito apresenta um protocolo para a bem sucedido isolamento e cultivo de rato adulto cardiomyocytes ventricular (ARVC).
O rato é sacrificado por deslocamento cervical sob anestesia profunda. Então, é extraído o coração e a aorta é descoberta. Posteriormente, a perfusão do sistema de perfusão de Langendorff com depleção de cálcio e tratamento de colagenase é executada. Depois, tecido ventricular Obtém picado recirculado e filtrado, seguido por três etapas de centrifugação com adição gradual de CaCl2 até que seja alcançada a concentração de cálcio fisiológica. ARVC são banhados em pratos de cultura de células. Após atualizar o meio de cultura celular, ARVC pode ser cultivada por até seis dias sem alterar o meio de cultura contendo soro. Isolamento da ARVC é um processo sensível de cálcio. Pequenas alterações da concentração de cálcio intracelular causar uma diminuição na qualidade e viabilidade das células isoladas.
Recentemente isolado ARVC são em forma de haste. Nos primeiros dias de cultivo, eles perdem os bacilares morfologia e forma pseudópodos estruturas (espalhar). Durante esta formação morfológica ARVC inicialmente degradar seus elementos contráteis, seguidos por uma reforma através de fibras de estresse de actina e sarcomerogenesis de novo . Após uma semana de cultivo, a maioria ARVC mostrar uma aparência generalizada com uma faixa transversal claramente detectável. Este processo é sensível à concentração de cálcio intracelular, como tratamento com ionomycin atenua a propagação. Marcadores chaves neste processo de - e re - differentiation são cadeia pesada de miosina-β (β-MHC), oncostatin M (OSM) e swiprosin-1 (EFHD2). Estudos recentes têm sugerido que cardíaca re e de differentiation ocorrendo em condições de cultura imita características visto na vivo durante a remodelação cardíaca. Portanto, isolamento e cultivo da ARVC desempenham um papel chave na compreensão da biologia dos cardiomyocytes.
Introduction
Cardiomyocytes adulto na vivo funciona como um sincício elétrico baseado em contatos de celular entre myocytes. Além disso, eles são influenciados por células adjacentes como cardíacos fibroblastos, células endoteliais, neurônios e células inflamatórias1. Para estudar a capacidade dos cardiomyocytes para adaptar sua organização intracelular para alterou as condições de carga, como visto durante a hipertrofia cardíaca, que é um passo inicial levando a insuficiência cardíaca, o isolamento e cultivo de adulto rato ventricular cardiomyocytes (ARVC) é necessário2,3,4. Historicamente, cardiomyocytes primeiro foram isoladas de garota embrionárias corações5,6. Alguns anos mais tarde, o primeiro isolamento de cardiomyocytes terminalmente diferenciada foi descrito por meio de depleção de cálcio7. No entanto, esses adultos cardiomyocytes não eram tolerantes de cálcio e, portanto, não podiam ser utilizados para os ensaios funcionais. Finalmente, em 1976, um novo protocolo habilitado Powell e torcer para investigar adulto cardiomyocytes ventricular sob condições fisiológicas8. Como primeiro passo, isolaram cardiomyocytes adulto sob concentrações baixas de cálcio e cálcio posteriormente aumentado para concentrações fisiológicas em um processo gradual. Hoje, a maioria dos protocolos para isolamento e cultivo de adultos cardiomyocytes trabalharcom com este protocolo de cálcio e usam colagenase para a digestão enzimática da célula-célula densa contatos1.
Para um cultivo bem sucedido, é necessário soro fetal bezerro (FCS) ou oncostatin M (OSM). ARVC executar um de - e re - differentiation extensas alterações estruturais, incluindo o sarcômero desmontagem e reforma9,10,11,12. Este processo é acompanhado por uma re-expressão de genes fetais-tipo, como β-miosina de cadeia pesada (MHC-β), como conhecido de hipertrofia e uma formação de pseudópodos-como estruturas, também chamado de espalhamento4,11, 13. Além disso, swiprosin-1 (EFHD2), uma proteína recém identificada, desempenha um papel importante no processo de re-diferenciação de cultivada ARVC11. Como resultado, ARVC na cultura transformar-se em células generalizadas, polimórficas, que mostram espontaneamente contrações após duas a três semanas em cultura2,4,14.
Descobertas recentes têm revelado que cardíaca differentiation re e de como ocorre em condições de cultura imita possui visto na vivo durante cardíaca remodelação10,15. Remodelação cardíaca é um processo chave durante doenças cardíacas16. Como doenças cardíacas ainda são a principal causa de morte nas sociedades industrializadas, uma melhor compreensão da biologia da cardiomyocytes adulto é importante (quem; 2015). Isolamento e cultivo da ARVC podem ajudar a desenvolver novas estratégias e medicamentos para o tratamento de doenças cardíacas. Com este manuscrito, é fornecido um protocolo para o isolamento e cultivo da ARVC. Além disso, algumas partes críticas deste método são destacadas na seção de discussão.
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Protocol
a investigação é conduzida de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório publicado por nos National Institute of Health (NIH publicação n º 85-23, revista em 1996). Em geral, ratos wistar machos com 3 a 4 meses de idade e com um peso médio de 250-350 g são utilizados para este protocolo. Um coração de rato é suficiente para 20 pratos de cultura (1 mL por prato; diâmetro interno: 35 mm) com uma densidade celular aproximada de 1,5 x 10 4 células/1000 mm 2.
1. preparação de meios e reagentes
- meio de creatina-carnitina-taurina (meio CCT)
Nota: CCT medium é um meio complexo, baseado no meio 199 com a adição de creatina, carnitina e taurina.- Preparar 1 L de meio 199: Adicione 3,6 g Hepes e misture por 1h. Em seguida, adicione creatina 655,5 mg (5 mM), carnitina 395,4 mg (2 mM) e taurina 625,5 mg (5 mM). Carnitina e taurina alteram o pH a < 7. A fim de inibir o crescimento de células, por exemplo, células endoteliais ou fibroblastos contaminante, adicione 10 µM citosina β-D-arabinofuranoside ao meio. Ajuste o pH com NaOH (2 mM) ao filtro de 7,4 e estéril o meio. Armazenar o meio CCT em 4 ° C.
- Médio de Powell
- por meio de 1 L Powell, dissolver 6,43 g NaCl (110 mM) com 0,19 g KCl (2,5 mM), 0,16 g KH 2 PO 4 mM (1,2), 0,3 g de MgSO 4 7 H 2 O (1,2 mM), 5,96 g Hepes (25 mM) e 1,98 g D (+ )-Monohydrate da glicose (10 mM) no Aqua estéril. Ajuste o pH com NaOH (M 2) 7.4 e estéril filtro o meio. Médio de Powell loja a 4 ° C.
- De cloreto de cálcio (CaCl 2)
- preparar uma solução de 100 mM CaCl 2 (50 mL) e preparar alíquotas contendo 500 µ l de CaCl 2. Congelar as alíquotas a -20 ° C.
- Preparação do meio de cultura
- preparar três meios de cultura celular: Pré-chapeamento médio, chapeamento médio e médio de lavagem. Use meio de CCT como a base para todas as três mídias (tabela 1). Calcule a média CCT com 1ml por prato de cultura. Portanto, prepare-se 20 mL de meio de CCT para 20 pratos de cultura (diâmetro interno: 35mm).
- Célula cultura placas: revestir cada placa de cultura de células (diâmetro interno: 35mm) com 1 mL Pré-chapeamento médio. Armazenar as placas revestidas a 37 ° C durante a noite ou pelo menos 2 h antes de usar.
2. Isolamento de adulto Cardiomyocytes
- sistema de preparação de Langendorff perfusão
- calor médio de chapeamento e lavagem médio a 37 ° C. um tubo de 500 µ l de CaCl 2 de descongelar e pesar em 25 mg de colagenase.
- Irrigue o sistema de perfusão de Langendorff com aqua estéril, depois deixe médio Powell circular o sistema 5 min.
- Encher o sistema de perfusão de Langendorff com 80 mL de meio de Powell, sem qualquer ar bolhas e gás médio com 95% de oxigênio.
- Preparar um tubo (50 mL) com 40 mL de meio de Powell, aquecê-lo a 37 ° C e gás-com 95% de oxigênio.
- Preparar um segmento de cerca de 25 cm de comprimento para prender o coração removido para a cânula.
- Desengordurar uma lâmina de barbear com álcool (70% em volume) e aperte-o para o helicóptero. Fixar um disco de plástico no helicóptero.
- Extração de coração
- anestesiar um rato wistar machos com 4 a 5% de isoflurano e sacrificá-lo com deslocamento cervical. Abrir o abdômen para trás o arco costal com uma tesoura abdominal e, com a mesma tesoura, corte através do diafragma para abrir a cavidade torácica.
- Remover o coração, junto com o pulmão e o timo, cortando acima o Timo altamente craniano na cavidade torácica. Transferir o material para solução salina gelada imediatamente.
- Remover o pulmão e Timo do coração com uma tesoura de dissecação (grande) e pela fixação do material com cápsula fórceps, transferir este último para uma nova solução salina.
- Isolamento
- remover o excesso de tecido, como resíduos de timo, traqueia, gordura e tecido conjuntivo do coração usando fórceps da cápsula e uma tesoura de dissecação (grande ou pequena). Descubra a aorta e é cortar com uma tesoura de dissecação (grande ou pequena) entre o primeiro e segundo branquial arq
- Começar a pingar do sistema de perfusão de Langendorff. Coloque o coração sobre a cânula do sistema de perfusão de Langendorff e fixá-lo primeiro com uma pinça de crocodilo e mais tarde com o segmento preparado. Enxágue o coração até que ele está livre do sangue.
- Dissolver 25 mg colagenase em 5-6 mL de meio de Powell quente e adicionar 12,5 µ l CaCl 2 (30 µM).
- Fechar a circulação movendo um funil de vidro, que é conectado com o sistema de perfusão de Langendorff, sobre o coração de gotejamento e adicionar a colagenase resolvido para o sistema de perfusão. Iniciar a perfusão para 25 min com uma velocidade de queda de 1 gota por segundo.
Nota: Durante a perfusão, o coração vai inchar e obter uma aparência cerosa. - Parar a perfusão após 25 min e retirar o coração do sistema de perfusão de Langendorff. Remover a aorta, átrios e tecido conjuntivo do coração e abrir os ventrículos direito e esquerdos.
- Corta o coração duas vezes em um ângulo de 90° (largura de corte: 0,7 mm; velocidade: 0,15 cm/s). Repita este processo manualmente com dois bisturis para 10 s cada lado.
- Transferir 12 mL do meio de perfusão para um novo tubo (50 mL). Despeje o chorume de célula este médio e digerir células por mais cinco minutos a 37 ° C. Mix a solução cada minuto.
- Filtrar a solução com o coração digerido através de uma malha de nylon (200 µm) para um tubo novo (50 mL).
- Centrifugar a solução filtrada em 29 x g, durante 3 min. descartar o sobrenadante e adicionar 6 mL quente Powell de meio incluindo 12,5 µ l CaCl 2 (250 µM) para o centrifugado. Resuspenda o pellet através de movimentos de agitação suaves. Centrifugar novamente a 29 x g por 2 min. descartar o sobrenadante e adicionar 6 mL quente médio Powell substituído com 25 µ l CaCl 2 (500 µM). Dissolver o centrifugado através de movimentos suaves de agitação e adicione 12 mL quente Powell médio incluindo 120 µ l CaCl 2 (1 mM). Centrífuga para uma terceira vez em 16 x g por 1 min. Novamente, remover o sobrenadante.
- Misturar o centrifugado com o médio pré-aquecido chapeamento.
- Remover Pré-chapeamento médio de placas de cultura. Transferi 1 mL do chapeamento médio, incluindo o cardiomyocytes isolada, para cada placa de cultura. Incube fresco cardiomyocytes isolado a 37 ° C por 1 h.
- Remover o meio de chapeamento de placas de cultura. Adicione 1 mL de lavagem média para cada placa de cultura e armazenar as placas a 37 ° C até seis dias sem alterar o meio.
- Para investigar a influência de diferentes produtos químicos e tratamentos na ARVC, primeiro atualizar o chapeamento médio médio de lavagem e posteriormente adicionando produtos químicos diferentes.
Nota: Avaliação com microscopia de luz: com preparação cada célula, 150 a 300 cardiomyocytes deve ser monitorados por dia por microscopia de luz. Subdividir a cardiomyocytes todos contados em grupos de acordo com a sua aparência (por exemplo, " em forma de haste ", " redonda para baixo ", " espalhando ", e " aparência incomum "). A categoria " espalhando " inclui todos cardiomyocytes com pseudópodos-como estruturas. " Aparência incomum " inclui todos ARVC com uma superfície irregular e não detectável intacta da membrana celular.
3. Exemplo de Experimentos
- fluorescência/imunofluorescência coloração dos adultos cardiomyocytes
- análise morfológicas e estruturais conversões da ARVC durante o cultivo por microscopia confocal do laser. Use a faloidina-TRITC para investigar estruturas F-Actina em " em forma de haste ", " redonda para baixo ", e " espalhando " ARVC. Realizar a coloração de acordo com o fabricante ' protocolo s. Um exemplo para a faloidina-TRITC coloração é dada em referência Nippert et al 11. com coloração de fluorescência/imunofluorescência, diferenças no de - e re - differentiation do aparato contrátil em cardiomyocytes adultos cultivadas entre tratamentos experimentais (por exemplo, com Swiprosin-1, ionomycin) pode ser investigado.
- RT-PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR)
- executar qRT-PCR para investigar alterações na expressão do mRNA de genes diferentes (por exemplo, OSM, Swiprosin-1, β-MHC) durante o cultivo da ARVC. Para o tamanho de amostra suficiente, use pratos de cultura maiores (diâmetro interno: 60 mm) com volume de 2 mL. ARVC de cinco pratos de cultura produz uma amostra. Realizar isolamento do mRNA e a transformação do cDNA de acordo com o fabricante ' protocolo de s.
- Immunoblot técnicas
- realizar borrões ocidentais para investigar alterações na expressão de proteínas (por exemplo, para Swiprosin-1) durante o cultivo da ARVC. Use um prato de cultura (1 mL) por exemplo.
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Representative Results
Adulto cardiomyocytes na cultura: A Figura 1 mostra uma visão geral dos cardiomyocytes adultos recentemente isolado 2 h após a última lavagem. Aproximadamente 75% de todos os cardiomyocytes tinha uma morfologia de forma cilíndrica. Os restantes 25% mostrou uma aparência incomum com uma morfologia redonda e não detectável membrana celular intacta (Figura 1). No final do cultivo (dia 6), até 15% de todos os cardiomyocytes mostrou-se espalhando, cerca de 10%, manteve-se em uma morfologia redonda sem estruturas pseudópodos, e 75% de todos os cardiomyocytes apresentou uma aparência incomum, com uma superfície irregular e sem uma membrana de célula intacta detectável (dados não mostrados).
Figura 1: visão geral do rato recém isolado cardiomyocytes. A fração de cardiomyocytes recém isoladas, que mostrou uma morfologia em forma de haste elevou-se a 75% dos cardiomyocytes, em média. Os restantes 25% de células apresentou uma aparência incomum com uma superfície irregular e não detectável intacta da membrana celular. Gravação foi conduzida por microscopia de luz 2 h após a lavagem o cardiomyocytes recém isoladas. Microscopia de luz 2 X ampliação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Com microscopia de luz, recentemente isolado ARVC apareceu em forma de haste e cerca de 100 µm de tamanho (Figura 2A). Recentemente isolado ARVC o contrato espontaneamente não eram tolerantes de cálcio. Todas as células que eram redondos e sem uma membrana de célula intacta detectável foram danificadas e não viável (Fig. 2A-B). Nos dias seguintes, a maioria da haste em forma de ARVC perdeu esta morfologia. Células tem arredondadas com uma membrana de célula intacta detectável. Estes ARVC eram viáveis. Começando no terceiro dia, as último células formou estruturas pseudópodos. Alguns destes ARVC mantiveram sua aparência arredondada durante a propagação (Figura 2B). Outros convertidos em apartamento, ARVC polimórfica (Figura 2B).
Figura 2: isolado de rato cardiomyocytes. (A) ARVC recém isolada foram geralmente de forma cilíndrica. (B) depois de seis dias em cultura, estruturas pseudópodos (espalhar) foram claramente detectáveis na ARVC agora arredondada. Alguns ARVC mudou completamente a uma morfologia generalizada. ARVC com uma aparência incomum exibido uma superfície irregular e não detectável intacta da membrana celular. Microscopia de luz 10 X ampliação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Recentemente isolado ARVC eram tipicamente haste moldada com uma visível estrias transversais (Figura 3, dia 0). Durante os dias seguintes, na cultura, foram observadas alterações na morfologia celular. Primeiro, ARVC perdeu todos os seus elementos contráteis (Figura 3, dias 1 e 2). Isto foi seguido por uma reforma, implicando sarcomerogenesis de novo . A reforma foi precedida pela formação de estruturas pseudópodos (espalhando, Figura 3, dias 3 a 6). Sarcomerogenesis de novo começou com o aparecimento das fibras de estresse de actina (Figura 3, dia 3). Além disso, feixes de actina, apareceu na região perinuclear e formado recentemente montado sarcômeros (Figura 3, dias 4 e 5). Este último cresceu ao longo das fibras de estresse de actina pré-formadas para a periferia (Figura 3, dia 6). No final do período de cultivo (dia 6), uma típica estrias transversais de sarcômeros recém montados na propagação ARVC foi observada.
Figura 3: fluorescência manchando. O de - e re - differentiation da ARVC na cultura com 20% de FCS é mostrado. Recentemente isolado ARVC com sua forma típica de haste (dia 0) tornou-se redondo degradando sarcômeros durante os primeiros dias da cultura (1 dia). Eles perderam todos os seus contrátil elementos (dia 2) seguidos de formação de estruturas pseudópodos (propagação; Dias 3-5) e posterior reforma dos seus elementos contráteis, indicando de novo sarcomerogenesis (dia 6). No sexto dia em cultura, estrias transversais foi claramente detectável novamente (dia 6). Coloração com faloidina-TRITC de acordo com o protocolo do fabricante; "flechas": estruturas pseudópodos (exemplo mostrado); *: feixes de actina na região perinuclear (exemplar mostrado). Partes desta figura são publicadas no11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 mostra a cinética do processo de espalhamento durante o cultivo. A fração da ARVC mostrando estruturas pseudópodos em cada momento do exame é dado como se espalhando em % (Figura 4). Espalhando começou por volta do terceiro dia e aumentou constantemente durante o tempo de cultivo. 14,7% ± 1.39% de todos os contados ARVC mostrou pseudópodos estruturas após seis dias de cultivo.
Figura 4: espalhar cinético aumento cardiomyocytes com pseudópodos estruturas normalizadas para todos os cardiomyocytes contados (se espalhando em %) durante seis dias de tempo de cultivo (n = 33 preparações da pilha). Os dados são apresentados como média ± SEM. Esta figura é publicada em11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Efeito de ionomycin sobre a propagação da ARVC: O isolamento e cultivo da ARVC é um processo sensível de cálcio1,8. Tratamento da ARVC com ionomycin (1 µM), que aumenta a concentração de cálcio intracelular, causou uma diminuição significativa de (≤0.01 p) na formação de pseudópodos-como estruturas em comparação aos controles (Figura 5). Quando comparado diretamente, 17,19% ± 2,45% de todos os contados ARVC mostrou-se espalhando sob condições de controle, mas apenas 9,87% ± 2,77% de todos os contados ARVC formado pseudópodos estruturas na presença de ionomycin (dia 6 de cultivo). Assim, ionomycin reduzidos se espalhando por 42,58%.
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Figura 5: espalhando cinética sob tratamento com ionomycin. Tratamento com ionomycin (1 µM) no dia 0 causou uma redução altamente significativa na cela se espalhando em relação ao controle. Os dados são apresentados como média ± SEM; n = 4 preparações da pilha; Teste de Mann-Whitney-U; * ≤0.05 p; * * p ≤0.01 clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Além disso, ionomycin aumentou a percentagem de ARVC com uma aparência incomum em relação às condições de controle (Figura 6). No dia seis, 71.11% ± 4,65% de todos os contados ARVC tratado com ionomycin mostrou uma aparência incomum. No entanto, sob condições de controle, apenas 51.35% ± 3,55% da ARVC foram categorizados neste grupo.
Figura 6: ARVC com uma aparência insalubre. Tratamento com ionomycin (1 µM) no dia 0 causou um aumento significativo no número de ARVC, que mostrou uma aparência incomum. No dia 6, a diferença entre controle e ARVC tratados com ionomycin foi significativa. Os dados são apresentados como média ± SEM; n = 4 preparações da pilha; Teste de Mann-Whitney-U; * p ≤0.05 clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
No dia 3 de cultivo, sob tratamento com ionomycin, qRT-PCR revelou uma diminuição na expressão de RNAm de β-MHC (≤0.01 p) e OSM, que desempenham um papel distinto na diferenciação da ARVC (Figura 7A e C). Swiprosin-1, foi um marcador para re-diferenciação da ARVC significativamente ativador, também (Figura 7B).
Figura 7: De - e re - differentiation da ARVC cultivada sob tratamento com ionomycin
(1 µM) no dia 0 causado um mRNA diminuição da expressão de oncostatin M (OSM) e β-MHC, que ambos desempenham papéis-chave na diferenciação dos adultos cardiomyocytes. Além disso, a expressão de RNAm de Swiprosin-1, um jogador-chave na re-diferenciação de adultos cardiomyocytes, foi também diminuiu ionomycin tratamento. Dia 3 de cultivo; Os dados são apresentados como média ± SEM; n = 30 placas de cultura de células por grupo; Teste de Mann-Whitney-U; * ≤0.05 p; * * p ≤0.01 clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Pré-chapeamento médio |
| 20 mL de meio de CCT |
| 2% Vol. penicilina/estreptomicina (400 μL) |
| 4% vol FCS (800 μL) |
| Médio de chapeamento |
| 20 mL de meio de CCT |
| 2% Vol. penicilina/estreptomicina (400 μL) |
| Médio de lavagem |
| 20 mL de meio de CCT |
| 2% Vol. penicilina/estreptomicina (400 μL) |
| Nota: FCS de Vol. 4% médio e pré-chapeamento pode ser substituído por 1 Vol.-% laminina (0.5 μg/cm2). Além disso, para cultivar cardiomyocytes durante vários dias adicione 20 Vol.-% FCS para o meio de lavagem. Armazenar o chapeamento médio e o meio de lavagem, de 4-8 ° C até usando. |
Tabela 1: meios de cultura utilizados para isolamento de casos
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Discussion
O comportamento do adulto cardiomyocytes na vivo é influenciado por muitas interações com outras células (por exemplo, os neurônios, células endoteliais, fibroblastos, células inflamatórias) e o sincício elétrico que formam1. Portanto, estudar a adaptação de estresse de adultos cardiomyocytes exclusivamente requer o isolamento e cultivo da ARVC. Os principais efeitos de isolar e cultivar ARVC são: 1) desconectá-los de matriz extracelular e contatos do celular; 2) desconectá-los de estímulos contráteis; 3) forçando-os a adaptar-se de um tecido tridimensional ao ambiente bidimensional. Nestas condições, ARVC começar de e re differentiation conforme descrito acima e executar várias adaptações, que também são vistas durante cardíaca remodelação na vivo (β-adrenoceptores dessensibilização, remontagem de sarcômeros, etc.) 4. por conseguinte, o isolamento dos cardiomyocytes adulto representa um método válido para investigar estas células e a sua reacção a diferentes tratamentos. Esses insights podem ser usados posteriormente para experiências na vivo , que ajudam na evitando experiências desnecessárias e reduzindo o número de animais de teste. Certamente, alguns achados vistos em vitro não ocorrerá na vivo (por exemplo, a formação de estruturas semelhantes a pseudópodos). Os célula-célula-contatos existentes dentro do sincício elétrico vão dificultar o crescimento excessivo sob condições fisiológicas17. Não obstante, ARVC isolado e cultivado pode ser usado para investigar o comportamento de adultos cardiomyocytes. Além disso, primeiros testes de novas estratégias de tratamento contra doenças cardíacas nos seres humanos podem ser realizados com ARVC.
O método descrito para o isolamento e cultivo de cardiomyocytes adulto contém alguns pontos críticos. Para obter resultados de sucesso, os seguintes itens devem ser considerados.
1. tolerância de cálcio: historicamente, a tolerância de cálcio dos cardiomyocytes adulto foi um dos fatores mais críticos levando a uma bem sucedido isolamento e cultivo de adultos cardiomyocytes1,7, 8. hoje em dia, os protocolos são estabelecidos para garantir o cultivo sob condições de cálcio fisiológicas1,3. Este manuscrito mostra a influência de uma concentração de cálcio intracelular alterados na qualidade da ARVC isolado. Ionomycin, que aumenta a concentração de cálcio intracelular, causou uma diminuição significativa na divulgação e um aumento significativo no número de cardiomyocytes com uma aparência incomum. Além disso, causou uma downregulation dos principais marcadores para cardíaca de - e re - differentiation: β-MHC, OSM e Swiprosin-1. Portanto, alterando a concentração de cálcio intracelular durante o cultivo dificulta a capacidade da ARVC para se adaptar a novos ambientes. Embora alguns ARVC foram capazes de se espalhar e se adaptar (9,87% ± 2,77% de todos os contados ARVC; A Figura 5), uma investigação exata da ARVC nestas condições não é possível. Consequentemente, para um isolamento preciso e cultivo da ARVC um protocolo estabelecido de cálcio deve ser usado. Além disso, deve ser assegurada que nenhum dos tratamentos investigados interferem com a hemostasia de cálcio da ARVC.
2. colagenase: existem diferentes lotes de colagenase disponíveis. Cada lote mostra diferenças na qualidade e eficácia1. Portanto, os autores recomendam a ordenação e testar amostras de diferentes lotes. Além disso, o tempo de digestão e a quantidade de colagenase de cada novo lote usado necessidades a ser avaliada separadamente. Por conseguinte, a concentração e o tempo de digestão no protocolo descrito podem diferir ligeiramente para outros protocolos.
3. tempo até perfusão do coração: para garantir uma elevada qualidade de ARVC, o tempo entre a extração do coração do corpo e o início da perfusão com o sistema de Langendorff deve ser tão curto quanto possível. Um tempo prolongado provoca danos ao coração e resulta em um maior número de ARVC inviáveis.
Além disso, o aquecimento da solução de perfusão durante a perfusão e digestão por 5 minutos depois de cortar o tecido é essencial para rendendo um bom resultado. Para evitar danos desnecessários do tecido biológico, ele deve ser manuseado com cuidado nos pontos de todos os tempos. Além disso, deve ser salientado que o tratamento com OSM ou concentrações de FCS também permitem ARVC para de - e re - differentiate4,10,18,19. No entanto, sem estes tratamentos nutritivos, ARVC degenerado dentro de alguns dias2.
Em conclusão, o isolamento e cultivo da ARVC é um método sensível que oferece uma variedade de possibilidades para investigar o comportamento de adultos cardiomyocytes exclusivamente.
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Disclosures
Os resultados mostrados são parte da tese de doutorado de Franziska Nippert.
Acknowledgments
Os autores graças a Nadine Woitasky e Peter Volk para assistência técnica. Além disso, os autores graças a Sra. Claudia Lorenz (médico escritor, ACCEDIS) por sua ajuda na preparação do manuscrito. Este manuscrito foi apoiado financeiramente pelo DFG (Schlu 324/7-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
References
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