Summary
Här presenterar vi ett protokoll för isolering och odling av vuxen råtta ventrikulära hjärtmuskelcellerna (ARVC). Isolerade ARVC kan användas för kort- och långsiktig odling. Isolering och odling av ARVC kan spela en nyckelroll i utvecklingen av nya behandlingsregimer för hjärtsjukdomar.
Abstract
I en intakt hjärta påverka intilliggande celler vuxen hjärtmuskelcellerna. Med metoden för isolering och odling av vuxen hjärtmuskelceller är en noggrann undersökning av beteendet hos dessa celler under specifika behandlingar och miljöer möjligt. Detta manuskript presenterar ett protokoll för framgångsrika isolering och odling av vuxen råtta ventrikulära hjärtmuskelcellerna (ARVC).
Råttan offras av cervikal dislokation under djup anestesi. Sedan hjärtat utvinns och aorta är avtäckt. Därefter utförs perfusion på systemet av perfusion med kalcium utarmning och kollagenas behandling. Efteråt, ventrikulär vävnad får malet, återcirkuleras, och filtreras, följt av tre centrifugering steg med gradvis tillsats av CaCl2 tills fysiologiska kalciumkoncentration uppnås. ARVC är pläterade på cell kultur rätter. Efter uppfriskande i cellodlingsmedium, kan ARVC odlas upp till sex dagar utan att ändra odlingssubstratet som innehåller serum. Isolering av ARVC är en känslig process som kalcium. Små förändringar i den intracellulära kalcium koncentrationen orsaka en minskning av den kvalitet och hållbarhet av isolerade celler.
Nymalen isolerade ARVC är stången formad. Inom de första dagarna av odling förlorar de stavformade morfologi och form pseudopodia-liknande strukturer (spridning). Under denna morfologiska formation ARVC initialt försämra deras kontraktila element följt av en reformation genom aktin stress fibrer och de novo sarcomerogenesis. Efter en vecka av odling, de flesta ARVC visar en utbredd utseende med en klart påvisbar cross strimmor. Denna process är känsliga för intracellulär kalciumkoncentration, som behandling med ionomycin dämpar spridning. Viktiga markörer i denna process av de - och re - differentiation är β-myosin heavy chain (β-MHC), oncostatin M (OSM) och swiprosin-1 (EFHD2). Nyligen genomförda studier har föreslagit att hjärt re - och de - differentiation uppstår under kultur härmar funktioner ses i vivo under hjärt remodeling. Därför, isolering och odling av ARVC spela en nyckelroll i att förstå biologin av hjärtmuskelceller.
Introduction
Adult hjärtmuskelcellerna i vivo fungerar som en elektrisk syncytium baserat på cell-cell kontakter mellan myocyter. Dessutom påverkas de av angränsande celler som hjärt fibroblaster, endotelceller, nervceller och inflammatoriska celler1. För att studera hjärtmuskelcellerna förmåga att anpassa organisationen intracellulära till ändrats belastning förhållanden, som sett under hjärthypertrofi, som ett första steg leder till hjärtsvikt, isolering och odling av vuxen ventrikulära råtta hjärtmuskelcellerna (ARVC) är nödvändiga2,3,4. Historiskt, isolerades hjärtmuskelceller först från embryonala chick hjärtan5,6. Några år senare, beskrevs den första isoleringen av terminalt differentierade hjärtmuskelcellerna med hjälp av kalcium utarmning7. Dock dessa vuxna hjärtmuskelcellerna var inte kalcium tolerant och därför inte kunde användas för funktionella analyser. Ett nytt protokoll aktiverad slutligen, 1976 Powell och Twist att undersöka vuxna ventrikulära hjärtmuskelcellerna under fysiologiska betingelser8. Som ett första steg isolerade de vuxen hjärtmuskelcellerna under låg kalcium koncentrationer och därefter ökad kalcium till fysiologiska koncentrationer i ett stegvis förfarande. Idag, de flesta protokoll för isolering och odling av vuxen hjärtmuskelcellerna arbetar med detta kalcium protokoll och använda kollagenas för enzymatisk nedbrytning av tät cell-cell kontakter1.
För en lyckad odling krävs fetalt kalvserum (FCS) eller oncostatin M (OSM). ARVC utföra en de - och re - differentiation med omfattande strukturella förändringar inklusive sarcomere demontering och reformationen9,10,11,12. Denna process åtföljs som av ett nytt uttryck av fostrets-typen gener, som β-myosin heavy chain (β-MHC), känd från hypertrofi och ett bildande av pseudopodia-liknande strukturer, som också kallas fördelande4,11, 13. Dessutom swiprosin-1 (EFHD2), ett nyligen identifierade protein, spelar en viktig roll i processen re differentiering av odlade ARVC11. Som ett resultat, förvandla ARVC i kultur till utbredd, polymorf celler, som spontant visar sammandragningar efter två till tre veckor i kultur2,4,14.
Senaste upptäckter har visat att hjärt re - och de - differentiation som det inträffar under odlingsbetingelser härmar har sett i vivo under hjärt remodeling10,15. Hjärt remodeling är en viktig process under hjärtsjukdomar16. Hjärtsjukdomar är fortfarande den främsta dödsorsaken i industrialiserade samhällen, en bättre förståelse av biologin av vuxen hjärtmuskelcellerna är viktigt (som, 2015). Isolering och odling av ARVC kan bidra till att utveckla nya strategier och läkemedel för behandling av hjärtsjukdomar. Med detta manuskript ges ett protokoll för isolering och odling av ARVC. Dessutom markeras vissa kritiska delar av denna metod i diskussionsavsnittet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
utredningen bedrivs enligt guiden för skötsel och användning av laboratoriedjur publiceras av oss National Institute of Health (NIH publikation nr 85-23, reviderad 1996). I allmänhet manliga wistar råttor åldern 3 till 4 månader och med en genomsnittlig vikt på 250-350 g används för detta protokoll. En råtta hjärta räcker för 20 kultur rätter (1 mL per maträtt; inre diameter: 35 mm) med en ungefärlig cell densiteten av 1,5 x 10 4 celler/1000 mm 2.
1. förberedelse av Media och reagenser
- kreatin-karnitin-taurin medium (CCT medium)
Obs: CCT medium är ett komplext medium baserat på medium 199 med tillägg av kreatin, carnitin och taurin.- Förbereda 1 L av medium 199: lägga till 3,6 g Hepes och blanda i 1 h. Lägg sedan till 655.5 mg kreatin (5 mM), 395.4 mg karnitin (2 mM) och 625.5 mg taurin (5 mM). Carnitin och taurin ändra pH till < 7. För att hämma tillväxten av kontaminerande celler, e.g. endotelceller eller fibroblaster, lägga 10 µM cytosin β-D-arabinofuranoside till medium. Justera pH-värdet med NaOH (2 mM) till 7,4 och sterila filter mediet. Lagra CCT medium vid 4 ° C.
- Powell medium
- för 1 L Powell medium, lös 6.43 g NaCl (110 mM) med 0,19 g KCl (2,5 mM), 0.16 g KH 2 PO 4 (1,2 mM), 0,3 g MgSO 4 7 H 2 O (1,2 mM), 5.96 g Hepes (25 mM), och 1.98 g D (+ )-Glukos monohydrat (10 mM) i Aqua sterila. Justera pH med NaOH (2 M) till 7,4 och sterila filter mediet. Store Powell mediet vid 4 ° C.
- Kalciumklorid (CaCl 2)
- Bered en 100 mM CaCl 2 (50 mL) och förbereda alikvoter som innehåller 500 µL CaCl 2. Frysa alikvoter vid -20 ° C.
- Beredning av odlingsmedium
- förbereda tre cell kultur medier: före plätering medium, plätering medium och tvätt medel. Använda CCT medium som grund för alla tre medier (tabell 1). Beräkna CCT medium med 1 mL per kultur maträtt. Därför förbereda 20 mL CCT medium 20 kultur rätter (inre diameter: 35 mm).
- Cell kultur plattor: Coat varje cell kultur platta (inre diameter: 35 mm) med 1 mL före plätering medium. Lagra belagda plattorna vid 37 ° C över natten eller minst 2 h innan du använder.
2. Isolering av vuxen hjärtmuskelcellerna
- beredning av av perfusion system
- värma plätering medium och tvätt medium till 37 ° C. Defreeze en tub av 500 µL CaCl 2 och väga in 25 mg kollagenas.
- Spola av perfusion systemet med aqua sterila, därefter låta Powell medium cirkulerar systemet för 5 min.
- Fylla systemet av perfusion med 80 mL Powell medium utan någon luft bubblor och gas mediet med 95% syre.
- Förbereda en tub (50 mL) med 40 mL Powell medium, Värm till 37 ° C och gas det med 95% syre.
- Förbereda en tråd av ca 25 cm i längd för att fästa bort hjärtat till kanylen.
- Avfetta ett rakblad med alkohol (70% av volymen) och fästa den till helikoptern. Klämma en plast skiva in i helikoptern.
- Utvinning av hjärtat
- söva en manlig wistar råtta med 4% till 5% isofluran och offra det med cervikal dislokation. Öppna buken bakom costal bågen med en buk skjuvning och, med den samma sax, skära igenom membranet att öppna brösthålan.
- Ta bort hjärtat, tillsammans med lung och tymus, genom att skära ovan bräss mycket kraniala i brösthålan. Överföra materialet till iskall saltlösning omedelbart.
- Bort lung och bräss från hjärtat med en dissekera sax (stor) och av fixerande material med kapsel pincett, överföra dessa till en ny saltlösning.
- Isolering
- ta bort överflödig vävnad, som rester av tymus, luftstrupen, fett och bindväv från hjärtat med kapsel pincett och en dissekera sax (stor eller liten). Avslöja aorta och bryta det med en dissekera sax (stor eller liten) mellan den första och andra gäl arch.
- Starta droppande av systemet av perfusion. Placera hjärtat på kanylen i systemet av perfusion och fixera det först med en krokodil klämma och senare med förberedda tråden. Skölj hjärtat tills den är fri från blod.
- Lös 25 mg kollagenas i 5-6 mL varm Powell medium och tillsätt 12,5 µL CaCl 2 (30 µM).
- Stänger cirkulationen genom att flytta en glastratt, som förbinds med systemet av perfusion, över droppande hjärtat och lägga den löst kollagenas till perfusion systemet. Starta perfusionen i 25 min med en droppe hastighet på 1 droppe per sekund.
Obs: Under perfusion, hjärtat kommer att svälla och få en vaxartad utseende. - Stoppa perfusionen efter 25 min och ta bort hjärtat från av perfusion systemet. Ta bort den stora kroppspulsådern, atria och bindväv från hjärtat och öppna höger och vänster ventriklarna.
- Hugga hjärtat två gånger vid en vinkel av 90° (klippbredd: 0,7 mm, hastighet: 0,15 cm/s). Upprepa den här processen manuellt med två skalpeller för 10 s varje sida.
- Överför 12 mL av perfusion medium till en ny tub (50 mL). Häll den cell flytgödsel i detta medium och digest celler i ytterligare fem minuter vid 37 ° C. Blanda lösningen varje minut.
- Filtrera lösningen med smälta hjärtat genom en nylon mesh (200 µm) in i en ny tub (50 mL).
- Centrifugera filtrerade lösningen vid 29 x g i 3 min. Kassera supernatanten och lägga till 6 mL varm Powell medium inklusive 12,5 µL CaCl 2 (250 µM) till cellpelleten. Återsuspendera pelleten genom smidig skakande rörelser. Centrifugera igen 29 x g under 2 min. Kassera supernatanten och tillsätt 6 mL varm Powell medium ersättas med 25 µL CaCl 2 (500 µM). Lös cellpelleten genom skonsam skakande rörelser och tillsätt 12 mL varm Powell medium inklusive 120 µL CaCl 2 (1 mM). Centrifug en tredje gång på 16 x g för 1 min. Igen, avlägsna supernatanten.
- Blanda cellpelleten med pre värmde plätering mediet.
- Ta bort före plätering medium från kultur plattor. Över 1 mL plätering medium, inklusive isolerade hjärtmuskelcellerna, varje kultur plattan. Inkubera färska isolerade hjärtmuskelcellerna vid 37 ° C under 1 h.
- Ta bort plätering mediet från kultur plattor. Tillsätt 1 mL tvätt medium till varje kultur plattan och lagra plattorna vid 37 ° C upp till sex dagar utan att ändra mediet.
- För att undersöka påverkan av olika kemikalier och behandlingar på ARVC, först uppdatera plätering medium genom tvättning medium och därefter lägga olika kemikalier.
Obs: Utvärdering med ljusmikroskopi: med varje cell förberedelse, 150 till 300 hjärtmuskelcellerna övervakas per dag av ljusmikroskop. Indela alla räknade hjärtmuskelcellerna i grupper enligt deras utseende (t.ex. " stavformade ", " runda ner ", " sprida ", och " ovanligt utseende "). Kategorin " sprida " inkluderar alla hjärtmuskelceller med pseudopodia-liknande strukturer. " Ovanligt utseende " omfattar alla ARVC med oregelbunden yta och inga detekterbara intakt cellmembranet.
3. Exempel Experiment
- fluorescens/immunofluorescens färgning av vuxen hjärtmuskelcellerna
- analysera morfologiska och strukturella omvandlingar av ARVC under odling av confocal laser mikroskopi. Använda Phalloidin-TRITC för att undersöka F-aktin strukturer i " stavformade ", " runda ner ", och " sprider " ARVC. Utföra färgning enligt tillverkaren ' s-protokollet. Ett exempel för Phalloidin-TRITC färgning ges i referens Nippert o.a. 11. med fluorescens/immunofluorescens färgning, skillnader i den de - och re - differentiation av kontraktila apparaten i odlade vuxen hjärtmuskelcellerna mellan experimentella behandlingar (t.ex. med Swiprosin-1, ionomycin) kan undersökas.
- Realtid kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR)
- utföra qRT-PCR för att undersöka förändringar i mRNA uttryck av olika gener (t.ex. OSM, Swiprosin-1, β-MHC) under odling av ARVC. För tillräcklig urvalsstorlek, använda större kultur rätter (inre diameter: 60 mm) med 2 mL volym. ARVC fem kultur rätter ger ett prov. Utföra isolering av mRNA och omvandling av cDNA enligt tillverkaren ' s protokollet.
- Immunoblot tekniker
- utföra Western blotting att undersöka förändringar i proteinuttryck (t.ex. för Swiprosin-1) under odling av ARVC. Använda en kultur maträtt (1 mL) per prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vuxen hjärtmuskelcellerna i kultur: Figur 1 visar en översikt över nymalen isolerade vuxen hjärtmuskelcellerna 2 h efter den sista tvättningen. Cirka 75% av alla hjärtmuskelceller hade en stavformad morfologi. Resterande 25% visade en ovanliga utseende med en rund morfologi och inga detekterbara intakt cellmembranet (figur 1). I slutet av odling (dag 6), upp till 15% av alla hjärtmuskelceller visade sprider, ca 10% kvar i en runda morfologi utan pseudopodia-liknande strukturer och 75% av alla hjärtmuskelceller presenteras ett ovanligt utseende med oregelbunden yta och utan en detekterbara intakt cellmembranet (inga data anges).
Figur 1: översikt över nymalen isolerade råtta hjärtmuskelcellerna. Fraktionen av nymalen isolerade hjärtmuskelceller som visade en stavformad morfologi uppgick till 75% av hjärtmuskelceller, i genomsnitt. Resterande 25% av cellerna presenteras ett ovanligt utseende med oregelbunden yta och inga detekterbara intakt cellmembranet. Inspelningen genomfördes av ljusmikroskop 2 h efter tvättning nymalen isolerade hjärtmuskelcellerna. Ljusmikroskop 2 X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Med ljusmikroskop visades nyligen isolerade ARVC stav formad och cirka 100 µm i storlek (figur 2A). Nymalen isolerade ARVC att kontraktet spontant var inte kalcium tolerant. Alla celler som var runda och utan en detekterbar intakt cellmembranet var skadad och inte livskraftig (figur 2A-B). I de följande dagarna förlorat de flesta av stången formad ARVC denna morfologi. Celler fick rundade med en detekterbar intakt cellmembranet. Dessa ARVC var livskraftig. Start på dag tre sistnämnda cellerna bildade pseudopodia-liknande strukturer. Några av dessa ARVC höll sin rundade utseende under spridning (figur 2B). Andra omvandlas till platt, polymorfa ARVC (figur 2B).
Figur 2: isolerade råtta hjärtmuskelcellerna. (A) färskt isolerade ARVC var vanligtvis stavformade. (B) efter sex dagar i kultur, pseudopodia-liknande strukturer (spridning) var klart påvisbara i den nu rundade ARVC. Vissa ARVC förändrat helt till en utbredd morfologi. ARVC med ett ovanligt utseende visas en oregelbunden yta och inga detekterbara intakt cellmembranet. Ljusmikroskop 10 X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Nymalen isolerade ARVC var vanligtvis stav formad med en klart synlig cross strimmor (figur 3, dag 0). Förändringar i cellmorfologi observerades under de följande dagarna i kultur. Först, ARVC förlorade alla sina kontraktila element (figur 3, dag 1 och 2). Detta följdes av en reformation, ifrågasätta de novo sarcomerogenesis. Reformationen föregicks av bildandet av pseudopodia-liknande strukturer (spridning, figur 3, dagar 3 till 6). De novo sarcomerogenesis började med utseendemässigt av aktin stress fibrer (figur 3, dag 3). Dessutom monterade aktin buntar visades i regionen perinukleära och bildade nya sarkomerer (figur 3, dagar 4 och 5). Den senare växte längs förformade aktin stress fibrerna in i periferin (figur 3, dag 6). Vid slutet av perioden odling (dag 6a), en typisk cross strimmor från nyligen monterade sarkomerer i spridningen ARVC observerades.
Figur 3: fluorescens färgning. Den de - och re - differentiation av ARVC i kultur med 20% FCS visas. Nymalen isolerade blev ARVC med deras typiska rod form (dag 0) rundan av förnedrande sarkomerer under de första dagarna av kultur (dag 1). De förlorat alla sina kontraktila element (dag 2) följt av bildandet av pseudopodia-liknande strukturer (spridning. 3-5 dagar) och efterföljande reformationen av deras kontraktila element som anger de novo sarcomerogenesis (dag 6). På dag sex i kultur, cross strimmor var klart påvisbara igen (dag 6a). Färgning med Phalloidin-TRITC enligt tillverkarens protokollet; ”pilar”: pseudopodia-liknande strukturer (exemplet); *: aktin buntar i regionen perinukleära (exemplariskt visat). Delar av denna siffra publiceras i11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 visar den kinetiska fördelande processen under odling. Fraktionen av ARVC visar pseudopodia-liknande strukturer på varje gång av undersökning ges som sprider sig i % (figur 4). Sprida började runt dag tre och ökade kontinuerligt under tiden för odling. 14,7 ± 1,39% av alla räknade ARVC visade pseudopodia-liknande strukturer efter sex dagar i odling.
Figur 4: sprider kinetisk ökning av hjärtmuskelceller med pseudopodia-liknande strukturer normaliserade till alla räknade hjärtmuskelcellerna (spridning i %) under sex dagar odling tid (n = 33 cell preparat). Data presenteras som betyder ± SEM. Denna siffra är publicerad i11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Effekten av ionomycin på fördelningen av ARVC: Isolering och odling av ARVC är en kalcium känsliga process1,8. Behandling av ARVC med ionomycin (1 µM), vilket ökar intracellulär kalciumkoncentration, orsakade en signifikant (p ≤0.01) minskning i bildandet av pseudopodia-liknande strukturer jämfört med kontroller (figur 5). Vid direkt jämförelse, 17.19% ± 2,45% av alla räknade ARVC visade sprida kontroll villkor men bara 9,87% ± 2,77% av alla räknade ARVC bildade pseudopodia-liknande strukturer i närvaro av ionomycin (dag 6 av odling). Således ionomycin minskad spridning av 42,58%.
= ”jove_content” fo:keep-together.within-sida = ”1” >
Figur 5: sprida kinetik under behandling med ionomycin. Behandling med ionomycin (1 µM) vid dag 0 orsakade en mycket betydande minskning cell spridning jämfört med kontrollgruppen. Data presenteras som betyder ± SEM; n = 4 cell preparat. Mann-Whitney-U test; * p ≤0.05; ** p ≤0.01 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Dessutom ökar ionomycin andelen ARVC med ett ovanligt utseende jämfört med kontrollförhållanden (figur 6). I dag räknas sex, 71.11 ± 4,65% av alla ARVC behandlas med ionomycin visade en ovanliga utseende. Dock under kontrollförhållanden, var enda 51,35% ± 3,55% av ARVC kategoriseras i denna grupp.
Figur 6: ARVC med en ohälsosam utseende. Behandling med ionomycin (1 µM) vid dag 0 orsakade en betydande ökning i antalet ARVC, som visade en ovanliga utseende. På dag 6 var skillnaden mellan kontroll och ARVC behandlas med ionomycin betydande. Data presenteras som betyder ± SEM; n = 4 cell preparat. Mann-Whitney-U test; * p ≤0.05 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
På dag 3 av odling, under behandling med ionomycin, visade qRT-PCR en minskning av mRNA uttryck för β-MHC (p ≤0.01) och OSM, som båda spelar en tydlig roll i de differentiering av ARVC (figur 7A och C). Swiprosin-1, en markör för förnyad differentiering av ARVC var betydligt nedreglerade, alltför (figur 7B).
Figur 7: De - och re - differentiation av odlade ARVC under behandling med ionomycin
(1 µM) på dag 0 orsakade en minskad mRNA uttryck för oncostatin M (OSM) och β-MHC, som både spela viktiga roller i de differentiering av vuxen hjärtmuskelcellerna. Dessutom minskade mRNA uttryck för Swiprosin-1, en viktig aktör i förnyad differentieringen av vuxen hjärtmuskelceller, också med ionomycin behandling. Dag 3 av odling; Data presenteras som betyder ± SEM; n = 30 cell kultur plattor per grupp; Mann-Whitney-U test; * p ≤0.05; ** p ≤0.01 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Före plätering medium |
| 20 mL CCT medium |
| 2% vol. Penicillin/Streptomycin (400 μL) |
| 4% vol. FCS (800 μL) |
| Plätering medium |
| 20 mL CCT medium |
| 2% vol. Penicillin/Streptomycin (400 μL) |
| Tvätt medel |
| 20 mL CCT medium |
| 2% vol. Penicillin/Streptomycin (400 μL) |
| Obs: 4% Vol. FCS i före plätering medium kan ersättas med 1 Vol.-% laminin (0,5 μg/cm2). Dessutom för odla hjärtmuskelcellerna för flera dagar lägga till 20 Vol.-% FCS till tvätt medium. Lagra plätering medium och tvätt medium genom 4-8 ° C fram till använder. |
Tabell 1: odlingssubstrat som används för hjärtmuskelcellen isolering
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beteendet hos vuxna hjärtmuskelcellerna i vivo påverkas av många interaktioner med andra celler (t.ex., nervceller, endotelceller, fibroblaster, inflammatoriska celler) och den elektriska syncytium som de utgör1. Därför kräver studera stress anpassning av vuxen hjärtmuskelcellerna uteslutande isolering och odling av ARVC. De huvudsakliga effekterna att isolera och odla ARVC är: 1) koppla bort dem från extracellulär matrix och cell-cell kontakter; (2) koppla bort dem från kontraktila stimuli; (3) tvingar dem att anpassa sig från en tredimensionell vävnad till tvådimensionella omgivningar. Under dessa förhållanden ARVC starta de - och re - differentiation som beskrivs ovan och utföra flera anpassningar, vilket också ses under hjärt remodeling i vivo (β-behovsmedicinering desensibilisering, ihopsättning av sarkomerer, etc.) 4. därför isoleringen av vuxen hjärtmuskelcellerna representerar en giltig metod för att undersöka dessa celler och deras svar på olika behandlingar. Dessa insikter kan användas efteråt för in-vivo -experiment, som skulle hjälpa i att undvika onödiga experiment och minska antalet försöksdjur. Visst, vissa rön visat in vitro- inte inträffar i vivo (t.ex., bildandet av pseudopodia-liknande strukturer). De befintliga cell-cell-kontakterna inom den elektriska syncytium kommer att hämma överdriven tillväxt under fysiologiskt villkorar17. Isolerade och odlade ARVC kan dock användas för att undersöka beteendet hos vuxna hjärtmuskelcellerna. Första prövningar av nya behandlingsstrategier mot hjärtsjukdomar hos människor kan dessutom utföras med ARVC.
Den beskrivna metoden för isolering och odling av vuxen hjärtmuskelcellerna innehåller några kritiska punkter. För att få lyckade resultat, måste följande beaktas.
1. kalcium tolerans: historiskt, kalcium toleransen för vuxna hjärtmuskelcellerna var en av de mest kritiska faktorerna som leder till en framgångsrik isolering och odling av vuxen hjärtmuskelcellerna1,7, 8. numera protokoll fastställs för att säkerställa odling under fysiologiska kalcium villkor1,3. Detta manuskript visar påverkan av en ändrade intracellulära kalciumkoncentration på kvaliteten på isolerade ARVC. Ionomycin, vilket ökar intracellulär kalcium koncentrationer, orsakade en signifikant minskning av spridning och en betydande ökning i antalet hjärtmuskelceller med ett ovanligt utseende. Dessutom det orsakade en nedreglering av viktiga markörer för hjärt de - och re - differentiation: β-MHC, OSM och Swiprosin-1. Därför hämmar förändras den intracellulära kalcium koncentrationen under odling ARVC förmåga att anpassa sig till nya miljöer. Även om vissa ARVC kunde sprida och anpassa (9,87% ± 2,77% av alla räknade ARVC; (Se figur 5), en noggrann undersökning av ARVC under dessa förhållanden är inte möjligt. För en exakt isolering och odling av ARVC följaktligen användas ett etablerade kalcium protokoll. Det bör dessutom säkerställas att ingen av de undersökta behandlingarna stör den kalcium hemostas av ARVC.
2. kollagenas: det finns olika partier av kollagenas. Varje parti visar skillnader i kvalitet och effektivitet1. Författarna rekommenderar därför beställa och testa prover av olika partier. Tidpunkten för matsmältningen och mängden kollagenas varje ny sats används dessutom behov ska utvärderas separat. Följaktligen den koncentration och tid för matsmältningen i protokollet beskrivs kan skilja sig något till andra protokoll.
3. tid tills hjärtat perfusion: för att säkerställa en hög kvalitet av ARVC, tiden mellan extrahera hjärtat från kroppen och i början av perfusion med av systemet bör vara så kort som möjligt. En långvarig tid orsakar skador på hjärtat och resulterar i ett högre antal icke-viabla ARVC.
Dessutom värmer perfusion lösningen under perfusion och matsmältningen för 5 minuter efter att hugga vävnaden är viktigt att ge ett bra resultat. För att undvika onödiga skador av biologisk vävnad, bör det behandlas varsamt vid all-time punkter. Dessutom det bör påpekas att behandling med OSM eller lägre koncentrationer av FCS också aktivera ARVC till de - och re - differentiate4,10,18,19. Dock utan dessa nutritive behandlingar, ARVC degenererade inom några dagar2.
Sammanfattningsvis, är isolering och odling av ARVC en känslig metod som erbjuder en mängd möjligheter att undersöka uppförandet av vuxen hjärtmuskelcellerna uteslutande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Resultaten visas ingår i doktorsavhandlingen av Franziska Nippert.
Acknowledgments
Författarna tackar Nadine Woitasky och Peter Volk för tekniskt bistånd. Dessutom tackar författarna Mrs. Claudia Lorenz (medicinsk författare, ACCEDIS) för hennes hjälp med att förbereda manuskriptet. Detta manuskript stöddes ekonomiskt av DFG (Schlu 324/7-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
References
- Schlüter, K. -D. Cardiomyocytes - Active Players in Cardiac Disease. , Springer International Publishing AG Switzerland. (2016).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Schlüter, K. -D., Schreiber, D. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. Fabbro, D., McCormick, F. 290, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 305-314 (2005).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).
- Burrows, M. T. The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body. JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).
- Cavanaugh, M. W. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).
- Muir, A. R. Further observation on the cellular structure of cardiac muscle. J. Anat. 99, 27-46 (1965).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).
- Schwarzfeld, T. Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat. J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).
- Kubin, T., et al. Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling. Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schlüter, K. -D. The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and β-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes. PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).
- Moses, R. L., Claycomb, W. C. Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells. J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).
- Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. Reexpression of α-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes. Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).
- Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III). Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).
- Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P.
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).
- Alberts, B., et al. Molecular biology of the cell. , Garland Science Taylor and Francis Group. New York, NY. (2015).
- Pöling, J., et al. The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease. Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).
- Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes. Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).
