Summary
经尿道灌注是一项具有挑战性的手术, 在文献中没有得到很好的描述。本手稿的目的是描述一种技术, 经尿道插入导尿管膀胱灌注液体的活性物质进入膀胱和/或前列腺的成年雄性小鼠。
Abstract
经尿道灌注可用于提供不同的解决方案与活性成分 (例如,药物, 化学药品, 细菌和病毒) 当地进入膀胱, 要么诱发动物模型膀胱病理或评估膀胱灌注治疗的有效性。大多数啮齿动物模型的下尿路 (查找) 病理是诱导雌性小鼠, 由于容易膀胱灌注的物质通过女性尿道。然而, 由于女性与男性之间的解剖差异, 经尿道灌注的雄性小鼠被认为是一个非常具有挑战性的过程, 并没有事先描述。在这份手稿中, 我们提供了一个详细的描述如何准备聚乙烯 (PE) 油管后插入到尿道的雄性鼠标。此外, 我们还讨论了理想的 PE 管的类型, 要根据所需的接种地点使用。此外, 我们还描述了如何准备一个成功的经尿道灌注的动物, 以避免对尿道的伤害, 并确保提供的解决方案的理想地点。手术的开始是通过缩回包皮和头来暴露尿道口的开口。其次, 用钝 non-crushing 钳抓住阴蒂, 稳定小弟弟和 PE 管。PE 导管首先插入到与动物身体平行的尿道道中, 然后通过倾斜导管来调整它的角度来操纵它以遵循尿道的自然曲率。这项技术可用于诱导小鼠膀胱病理模型和/或评估的有效性, 在雄性老鼠的治疗。
Introduction
在以往的研究中, 采用经尿道灌注法作为建立膀胱疾病模型的方法之一1,2,3,4 , 可用于评估当地提供的治疗小鼠的效果。虽然动物模型不能完全重述人类的病症, 但在动物研究中的基本机制的识别更能更好地理解人类的查找障碍, 如间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合症, 神经原膀胱炎, 自身免疫性膀胱炎, 前列腺炎症5。
在成年雄性小鼠身上进行的经尿道灌注手术比在成年雌性老鼠6中的膀胱灌注更具有技术挑战性。男性尿道的自然弯曲解剖和它的小直径使它在技术上难以完成经尿道插入导管。因此,详细说明对经尿道感染的小鼠泌尿道传染病的诱导6和查找源性炎症7,8,910,12,13,14,15通过膀胱插入导管之前只对雌性小鼠进行了概述。这份手稿的目的是提供一个 step-by 一步的描述的技术, 在男性小鼠经尿道注入的物质, 包括视频剪辑, 图像和插图。经尿道灌注手术的成年雄性小鼠可以执行的变量接种类似于以前所描述的雌性鼠标7和合并的其他技术, 如肌电图记录visceromotor 响应 (VMR)16。
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Protocol
所有与动物有关的程序, 包括麻醉的方法和持续时间, 以及术后护理, 都与兽医进行了讨论, 并得到了机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。附属机构。在这份手稿中, 所有的程序都是用8到15周大的 C57BL/6 雄性小鼠进行的, 该协议遵循 IACUC 在科罗拉多大学批准的动物保育指南.
1. 油管的制备
注: 为了灌输接种, 一根针连接到聚乙烯 (PE) 油管 ( 图 1A ) 或一个小的量规 (和 #60; 24 克) angiocatheter 可以使用 ( 图 1G )。使用 angiocatheter 不需要除绝育以外的70% 乙醇 (乙醇)。接种是被灌输/注入/沉积到泌尿道中的物质。这可以是一种含有细菌、病毒或化学物质的溶液。这是提前准备的时间和研究的协议。例如, 如果研究的目的是评估 大肠杆菌 感染对下尿路的影响, 研究者将需要准备含有细菌的接种, 该菌可以在下尿路接种/灌输.
- 用于 pe 导管的针的制备简单, 包括以下内容: 根据靶器官和动物的年龄选择 pe 导管的尺寸。对于年龄小于12周的动物, 使用 PE-10 管 (外径为0.024 英寸, 内径为0.011 英寸)。PE-10 导管建议适用于 (1) 在前前列腺 (AP) 和精囊 (SV) 的接种的一次播种, 或 (2) 接种在一个小于12周龄的动物的膀胱中的一次播种。pe 管材的直径较大的 pe 50 (外径可达0.038 英寸, 内径可达0.023 英寸) 可用于接种在较年长动物的膀胱中的一次播种.
- 切割大约2.5 英寸的 PE 油管.
- 选择将适合所选 PE 直径的针。27克针能装入 PE-10 管的流明, 并且 22 g 针适合 PE-50 管的流明.
- 在将针的锋利边缘与商业可用的油石 ( 图 1A -b ) 进行摩擦之前, 先准备针插入 PE 管, 使其变钝, 或使用商业上可用的钝针.
- 将钝针 ( 图 1C ) 引入 PE 管的流明中。通过确保针头保持在流明中心, 避免对流明或进入假腔的损伤。( 图 1D -e )。如果 PE 管在插入钝针时损坏, 请切断损坏的端部并重新启动过程.
- 将针附着 PE 导管放置在70% 的乙醇中以进行灭菌, 直到其用于程序。冲洗70% 乙醇通过针 pe 油管, 以消毒腔, 并确保没有从 PE 油管泄漏的过程中, 插入针。如果有泄漏, 丢弃的针 PE 管.
注: 在插管前, PE 导管的尖端需要平滑。为避免将 pe 导管引入尿道的问题, 建议在导管插入前立即切断 pe 导管的尖端 ( 图 1F )。建议的 PE 管的最小长度是1.5 英寸, 其中包括针周围的部分.
2。插管过程
- 在诱导麻醉之前, 清空鼠标的膀胱。
- 对鼠标下腹应用柔和的压力和按摩。这些演习通常导致自发排尿。一个完整的膀胱可能导致稀释或立即泄漏任何灌输接种.
注: 一个额外的选项, 以确保一个空的膀胱在老鼠是剥夺动物的水至少1小时之前开始的经尿道灌注手术。作为动物议定书的一部分, 该机构应批准水资源匮乏.
- 对鼠标下腹应用柔和的压力和按摩。这些演习通常导致自发排尿。一个完整的膀胱可能导致稀释或立即泄漏任何灌输接种.
- 使用带有异氟醚流 (2%) 的麻醉机来诱导麻醉。
- 一旦该动物被麻醉, 将它放在温暖的电热毯上, 用一个蓝色的垫子盖在一个 nosecone 内, 用于维持连续麻醉.
- 通过检查踏板反射 (脚趾捏) 确认该动物正在接受麻醉.
- 一旦踏板反射不存在, 通过缩回包皮进行操作.
- 用一只手的拇指和食指 ( 图 2A 和 2B ) 按耻骨区域, 用另一只手的拇指和食指拉出腺体的阳具 ( 图 2C )。当这是正确的完成, 包皮, 头阴蒂, 和生殖器保持暴露。( 图 2D 和 图 2F )。不要用钳子拔出腺体的阳具, 因为这会导致组织受损.
- 在插入导管之前, 用不育的手术润滑剂润滑导管和头的顶端。这将促进 PE 导管的插入.
注: 个别包装的外科润滑剂的平方, 而不是一个大的管, 建议每一个使用, 以保持不育的条件. - 用钝钳轻轻握住小弟弟的尖端, 轻轻地挤压阴蒂, 使尿道口张开.
- 用针附着的 pe 油管或 pe 导管将注射器固定, 并通过尿道口插入 pe 导管.
注意: 建议使用拇指、食指和中指的注射器的三脚架握针与 pe 油管或 pe 管材本身的稳定性.
注: 导管的路径应该是弯曲的, 这是由于尿道的自然曲率, 在成年雄性小鼠的头状生殖器和阳具中所包围, 如 图 3A 和 图 3B 所示。插管 pe 导管在插管过程中可能会遇到阻力, 因此建议通过将导管向上或向下倾斜来调整角度, 以帮助进一步向靶器官推进 pe 导管。如果需要, PE 管可以稍微旋转, 以帮助它机动通过各种尖锐的尿道。当有太多的阻力, 油管应拉回, 然后再次前进, 以最小的压力。完全拉动 PE 油管, 使用更多的润滑可能是有帮助的. - 当 PE 导管到达所需的器官时, 通过推针柱塞来注入所需的接种 (5-200 和 #181; 建议采用 L 音量).
- 用于将接种注入膀胱, 将 pe 导管向前推进, 直到插入 pe 油管大约0.75 英寸 ( 图 3A ).
注: 对接种在 AP 和 SV, 一般, th 的灌输插入的导管一旦到达前前列腺的开口点, 就会遇到阻力。通过倾斜油管向上或向下调整角度, pe 导管将进一步向前推进, 直到插入了大约1英寸 pe 油管 ( 图 3B ).
- 用于将接种注入膀胱, 将 pe 导管向前推进, 直到插入 pe 油管大约0.75 英寸 ( 图 3A ).
3。 在体内 下尿路和肾脏的影像学
注意: 在本手稿中, 活体 成像的目的是: (1) 确定接种的空间定位; (2) 评估接种的反流发生率肾脏.为此, 可以使用麻醉或安乐死的鼠标.
- 对成年雄性小鼠下尿路进行可视化, 进行下腹中线剖腹探查, 以暴露膀胱、前列腺和精囊炎.
- 用剪刀将中线上的皮肤从耻骨切割到剑过程的下方.
- 将皮下组织的皮肤抬高.
- 确定位于中线的缺血性式阿尔巴, 并将其切开以进入所有脏器所在的腹膜腔.
- 通过可视化蓝色染料或其他合适的跟踪代理来确认空间定位.
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Representative Results
通过 pe 50 导管经尿道注入蓝染料后, 将染料滴入膀胱 (图 4A), 并通过 pe 10 导管在 SV 和 AP (图 4B) 着色中分别进行。为了评价经尿道电切术是否使接种的即刻回流到肾脏, 肾脏和输尿管被观察到, 然后注入100µL 的蓝色染料和荧光染料 (图 4A-b)。没有使用两种不同尺寸的 PE 导管和两种不同的染料的灌输法导致输尿管或肾脏着色。
图 1:22 G 针准备插入聚乙烯 (PE) 导管 50.锋利的针 (A) 被研磨对油石头 (B) 钝锋利的边缘 (C)。一旦针头是钝的, 针插入到 PE 管 (D) 的流明中, 并在针上用细钳 (E) 推进。然后将油管切割到大约1.5 英寸 (F)。24 g angiocath (g) 也可以使用。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2:雄性小鼠包皮盖住了头和尿道口 (A) , 与轻微牵引包皮的头可暴露 (B) , 并与轻微牵引的头 (C) , 整个包皮可以缩回 (D) , 从而允许方便地进入尿道和尿道。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3:下泌尿道器官的图示;膀胱, 前列腺, 精囊 (sv) 显示经尿道灌注使用 pe 50 管 (A) 和 pe 10 管 (B) 的主要播种膀胱和 SV/前前列腺, 分别。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4:上、下泌尿道器官图像;肾脏, 膀胱, 前列腺和精囊 (SV) 经尿道灌注后使用 pe 50 管 (A) 和 pe 10 油管 (B)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本手稿详细介绍了经尿道灌注法在成年雄性小鼠中的应用。采用不同直径的 PE 管材, 可达到差异主播种面积。PE-50 是建议成功达到膀胱腔, 而较大的直径 PE-10 是用来达到 AP 和 SV (图 3A-b)。除了选择 PE 管的大小和靶器官的接种外, 其他因素, 如注入量的接种, 也发挥了作用的最终位置和分布的解决方案。我们的实验证明, 经尿道灌注100µL 的蓝色染料使用 PE-10 或 PE-50 不触发立即回流染料的肾脏。然而, 尿液对肾脏的回流可能发生在 post-instillation 期间, 并可能导致肾脏感染, 如先前所示的成年雌性小鼠8。因此, 强烈建议对肾脏进行组织学评价, 以确认没有经尿道灌注的肾脏间接污染。
有几个重要的关键步骤, 以执行成功的经尿道灌注接种。首先, PE 管应该有足够的长度-至少2.5 英寸。这将允许额外的调整油管长度, 如有必要, 在油管制备过程中, 或继经尿道灌注程序。在本协议步骤9中的多次尝试和失败都可能导致 PE 导管的插入端被体液堵塞。在这种情况下, PE 导管的尖端应该被切断, 以便有一个明确的提示为以后的尝试。一旦 PE 管的尖端被切断, 手术润滑剂应重新。其次, 一个适当的手柄, 无论是注射器或 PE 油管本身确实增加了成功率。第三, 应插入足够长度的 PE 导管, 并在导尿过程中, 将包皮、头头、和阳具僵硬地排在不握手的情况下。否则, 当注射器柱塞被推挤时, 接种可能发生回流。
经尿道灌注手术的效果较好, 可在手术过程中避免尿道及靶器官损伤。性能结果可以通过使用有色染料或荧光染料作为确认接种的主要定位和肾脏回流的任何迹象的程序来验证。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者没有任何致谢。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 10 | BD Medical | 63019-004 | |
| BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 50 | BD Medical | 63019-048 | |
| BD Insyte-N Autoguard/ Angiocath | BD Medical | 311411 | |
| Ethanol (EtOH) | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| BD Needle Only 22 Gauge (G) 1 inch | Becton Dickson | 205155 | |
| BD Needle Only 27 Gauge (G) 1/2 inch | Becton Dickson | 305129 | |
| Luer stub, 22 G X 0.5 in / Blunt Needle | Instech | LS22 | |
| Luer stub, 27 G X 0.5 in / Blunt Needle | Instech | LS27 | |
| 6" Long x 2" Wide x 1" Thick, Aluminum Oxide Sharpening Stone / Oil Stone | Norton | 40204034 | |
| Surgical Lubricant Sterile Bacteriostatic Folilpac | Surgilube | 281020543 | |
| Isoflurane | Fluriso | 13985-528-60 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Dissecting Forceps, Curved | vwr | 82027-392 | |
| BD 1 ml Syringe | BD Medical | 309626 | |
| India Ink Solution., 0.2% in PBS buffer | Alfa Aesar | J61007 | |
| 8~12 weeks old male C57B/6 Mice | Jackson Lab | #000664 |
References
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