Summary
Transuretrale instillatietest is een uitdagende procedure en is niet goed beschreven in de literatuur. Het doel van dit manuscript is om een techniek voor transuretrale inbrengen van een katheter voor intravesicale levering van vloeistoffen met werkzame stoffen in de urineblaas en/of de prostaat bij volwassen mannelijke muizen te beschrijven.
Abstract
Transuretrale instillation kan worden gebruikt voor het leveren van verschillende oplossingen met werkzame bestanddelen (bijvoorbeeld drugs, chemische stoffen, bacteriën en virussen) lokaal in de urineblaas diermodellen aandoeningen van de blaas veroorzaken of evalueren de effectiviteit van intravesicale behandelingen. Meest knaagdier modellen van de lagere urinewegen (LUT) pathologieën zijn geïnduceerd in vrouwelijke muizen verschuldigd aan gebruiksgemak intravesicale instillation van de stoffen via de vrouwelijke urinebuis. Echter, als gevolg van anatomische verschillen tussen de vrouwelijke en mannelijke LUT, transuretrale instillation in een mannelijke muis heeft een zeer uitdagend procedure geacht, en het is niet eerder beschreven. In dit manuscript bieden wij een gedetailleerde beschrijving van het opstellen van polyethyleen (PE) slang voor latere inbrengen in de urinebuis van een mannelijke muis. Daarnaast bespreken we de ideale soorten PE buizen worden gebruikt afhankelijk van de gewenste plaats van inoculatie. Daarnaast beschrijven we punt door punt hoe voor te bereiden van een dier voor een succesvolle transuretrale instillation te voorkomen van schade aan de urethra en zorgen voor de levering van de oplossing naar de gewenste locatie. De procedure wordt gestart door het intrekken van de voorhuid en de eikel bloot van de opening van de urethrale neusgang. Vervolgens zijn de glans begrepen door botte niet breken pincet te stabiliseren van de penis en de PE-buis. De PE slang eerst wordt ingevoegd in de urethrale neusgang parallel aan het dierlijk lichaam, dan de hoek wordt aangepast door het kantelen van de katheter om te manoeuvreren om te volgen de natuurlijke kromming van de urinebuis. Deze techniek kan worden gebruikt om geïnduceerde lymfkliertest modellen van aandoeningen van de blaas en/of de doeltreffendheid van intravesicale behandelingen bij mannelijke muizen.
Introduction
De transuretrale instillation aanpak in eerdere studies is gebruikt als een van de methoden om knaagdieren modellen van blaas pathologieën1,2,3,4 te maken en kan worden gebruikt voor het evalueren van de effectiviteit van lokaal geleverde behandelingen in muizen. Hoewel diermodellen kunnen niet volledig menselijk pathologieën recapituleren, biedt identificatie van de onderliggende mechanismen in dierstudies een beter begrip van de menselijke LUT aandoeningen zoals interstitiële cystitis/blaas pijnsyndroom, neurogene blaasontsteking, auto-immune blaasontsteking en prostaat ontsteking5.
De transuretrale instillation procedure uitgevoerd op een volwassen mannelijke muis is meer technisch uitdagend dan intravesicale instillation in een volwassen vrouwelijke muis6. De natuurlijk gebogen anatomie van de mannelijke urethra samen met zijn kleine diameter maken het technisch moeilijk te bereiken het transuretrale inbrengen van een katheter. Daarom, gedetailleerde instructies voor de transuretrale inductie van muis urinewegen infectie6 en LUT ontsteking7,8,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 via katheter blaas-ingevoegd werden eerder geschetst voor vrouwelijke muizen alleen. Dit manuscript heeft tot doel een stapsgewijze beschrijving van de techniek voor transuretrale instillation van stoffen in mannelijke muizen met inbegrip van de videofragmenten, afbeeldingen en illustraties. Transuretrale instillation procedures in een volwassen mannelijke muis kunnen worden uitgevoerd met variabele inoculates vergelijkbaar met die eerder beschreven in de vrouwelijke muis7 en samengevoegd met aanvullende technieken zoals electromyogram opnames van visceromotor Reacties (VMR)16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle procedures met dieren, met inbegrip van de methode en de duur van de verdoving, evenals de postoperatieve zorg, werden met een dierenarts besproken en goedgekeurd door de institutionele dier zorg en gebruik Comité (IACUC) op de gelieerde instelling. In dit manuscript, alle procedures werden uitgevoerd met 8 to 15-week-oude C57BL/6 mannelijke muizen en het protocol volgt de dierenverzorgers richtsnoeren goedgekeurd door de IACUC aan de Universiteit van Colorado.
1. voorbereiding van buizen
Opmerking: om het entmateriaal inboezemen, een naald die gekoppeld is aan de polyethyleen (PE)-buis ( figuur 1A) of een kleine gauge (< 24 G) angiocatheter kan worden gebruikt () figuur 1G). Het gebruik van een angiocatheter vereist geen voorbereiding dan sterilisatie met 70% ethanol (EtOH). Het entmateriaal is de stof die is ingeprent/geïnjecteerd/gestort in de urinewegen. Dit kan een oplossing met bacteriën, virussen of een chemische stof. Dit is bereid tevoren en per het onderzoeksprotocol. Bijvoorbeeld, als de studie beoogt te evalueren van de effecten van E. coli infectie van de lagere urinewegen, de onderzoeker moet voorbereiden het entmateriaal met bacteriën, die geënt/ingeprent in de lagere urinewegen worden kunnen.
- Voorbereiding van de naald gekoppeld aan PE buis is eenvoudig en bestaat uit de volgende: Kies de grootte van PE-buis op basis van het doel-orgel en de leeftijd van een dier. Gebruik voor een dier jonger dan 12 weken, PE-10 buis (buitendiameter is 0.024 inch en binnendiameter is 0.011 inch). PE-10 buis wordt voorgesteld om gelden voor (1) het primaire zaaien van entmateriaal in de voorste prostaat (AP) en de zaadblaasjes (SV), of (2) het primaire zaaien van entmateriaal in de blaas van een dier jonger dan 12 weken oud. PE buizen met een grotere diameter van tot en met maat 50 van PE (buiten diameter tot 0.038 inch en binnendiameter tot 0.023 inch) kan worden gebruikt voor het primaire zaaien van entmateriaal in de blaas van de oudere dieren.
- Knippen van ongeveer 2,5 inch PE buis.
- Selecteer een naald die passen bij de geselecteerde PE-diameter worden gebruikt. Een 27 G naald past in het lumen van PE-10 buis, en een naald 22 G past de lumen van buizen van PE-50.
- Voorbereiden de naald vóór opneming in de PE-buis door het wrijven van de scherpe rand van de naald op een commercieel verkrijgbare olie steen ( figuur 1A -B) om er saai, of gebruik een commercieel beschikbare bot naald.
- Introduceren de saaie naald ( Figuur 1 c) in het lumen van de PE-buis. Schade aan de lumen of de inwerkingtreding van een valse lumen voorkomen door ervoor te zorgen de overblijfselen van de naald in het midden van lumen. ( Figuur 1 d -E). Als de PE buis is beschadigd tijdens het inbrengen van de saaie naald, knipt u het beschadigde einde en het proces opnieuw starten.
- Plaats de naald-ingeschrevenen PE-buis in 70% van EtOH voor sterilisatie tot het gebruik ervan voor de procedure. Flush de 70% EtOH via de naald-PE-buis te steriliseren de lumen en er geen lekkage van de PE-buis van is schade tijdens het inbrengen van de naald. Wanneer er lekkage, verwijderd de naald-PE-buis.
Opmerking: Het puntje van de PE-buis moet glad vóór catheterisatie. Om problemen te vermijden met de invoering van de PE-buis in de urinebuis, is het aanbevolen om snijd het puntje van de PE-buis vóór catheterisatie ( figuur 1F). De voorgestelde minimale lengte van de PE-buis is 1,5 inch, waarin het deel rond de naald.
2. Catheterisatie Procedure
- voorafgaand aan de inductie van de anesthesie, het legen van de blaas van een muis.
- Zachte druk uitoefenen en massage naar de onderbuik van de muis. Deze manoeuvres leiden meestal tot spontane ongeldig te verklaren. Een volle blaas kan leiden tot de verwatering of onmiddellijke lekkage instilled entmateriaal.
Opmerking: Een extra optie om een lege blaas in een muis is te beroven van het dier water gedurende ten minste 1 uur vóór het begin van de procedure transuretrale instillation. Water vrijheidsstraf dient te worden goedgekeurd door de instelling als onderdeel van de dierlijke protocol.
- Zachte druk uitoefenen en massage naar de onderbuik van de muis. Deze manoeuvres leiden meestal tot spontane ongeldig te verklaren. Een volle blaas kan leiden tot de verwatering of onmiddellijke lekkage instilled entmateriaal.
- Een verdoving machine gebruiken met Isofluraan stroom (2%) voor het opwekken van anesthesie.
- Zodra het dier wordt verdoofd, plaatst u deze op een warme Verwarming Deken en bedek het met een blauwe pad met zijn neus in een neuskegel voor het onderhoud van continue verdoving.
- Bevestigen dat het dier onder narcose is door het controleren van de pedaal reflex (Teen snuifje).
- Zodra de pedaal reflex afwezig is, gaan door het intrekken van de voorhuid.
- Press de schaamstreek regio met de duim en wijsvinger van één hand ( cijfers 2A en 2B), en trek uit de penis van de klieren met behulp van de duim en wijsvinger van de andere hand ( figuur 2C). Als dit correct is gedaan, blijven de voorhuid, glans-penis en penile lichaam blootgesteld. ( figuur 2D en figuur 2F). Gebruik geen pincet te trekken aangezien dit in schade aan het weefsel resulteren zal klieren penis.
- Smeer het uiteinde van de katheter en de glans met steriele chirurgische glijmiddel voorafgaand aan het inbrengen van de katheter. Dit inbrengen van de PE-buis zal vergemakkelijken.
Opmerking: Individueel verpakte kwadraten van chirurgische smeermiddel, in plaats van één grote buis, worden aanbevolen voor elk gebruik te handhaven van de steriele condities. - Zachtjes Houd het puntje van de penis met behulp van saaie pincet en zachtjes knijp de glans als u wilt dat de urethrale neusgang openen.
- Houdt de spuit met de naald-ingeschrevenen PE-buis of PE buizen zelf en invoegen van de PE slang via de urethrale neusgang.
Opmerking: Een statief grip van de spuit met de naald-ingeschrevenen PE-buis of de PE buizen zelf met behulp van de duim, index en middelste vingers wordt aanbevolen voor stabiliteit.
Opmerking: Het pad van catheterisatie moet worden gebogen als gevolg van de natuurlijke kromming van de plasbuis die omgeven door de glans penis en penile lichaam in de volwassen mannelijke muis zoals getoond in figuur 3A en 3B van de figuur. De catheterized PE buis kan weerstand tijdens catheterisatie voldoen, daarom wordt aangeraden om de hoek door het kantelen van de slang omhoog of omlaag om de hulp vooraf de PE slang naar aanleiding van de doel-orgel. Indien nodig, kan de PE-buis iets worden gedraaid om zo te kunnen manoeuvreren door middel van de verschillende scherpe bochten van de urinebuis. Wanneer er teveel weerstand, de buis moet worden trok zich terug en dan weer verder met minimale druk. Trekken van de PE-buis volledig uit en met behulp van meer smering nuttig kan zijn. - Instillation van het entmateriaal uitvoeren zodra de PE-buis de gewenste orgel bereikt door het indrukken van de zuiger van de naald naar het inprenten van het gewenste volume van het entmateriaal (5-200 µL volume wordt gesuggereerd).
- Voor instillation van het entmateriaal in de urineblaas, verder de PE-buis tot ongeveer 0.75 inch PE buis wordt ingevoegd ( figuur 3A).
Opmerking: voor instillation van het entmateriaal in de AP en SV, in het algemeen, the ingevoegd buis voldoet aan weerstand zodra het het punt van de opening in de voorste prostaat bereikt. Door de hoek aan te passen door het kantelen van de slang, omhoog of omlaag, zal de PE slang verder verder tot ongeveer 1 inch PE buis is ingevoegd ( figuur 3B).
- Voor instillation van het entmateriaal in de urineblaas, verder de PE-buis tot ongeveer 0.75 inch PE buis wordt ingevoegd ( figuur 3A).
3. In Vivo Beeldvorming van de lagere urinewegen en nieren
Opmerking: het doel voor in vivo imaging in dit manuscript is: (1) om te bevestigen de ruimtelijke lokalisatie van het entmateriaal; en (2) te beoordelen van de incidentie van de Terugvloeiing van het entmateriaal aan de nieren. Voor dit doel, ofwel een narcose of euthanized muis kan worden gebruikt.
- Uitvoeren om te visualiseren van de lagere urinewegen volwassen mannelijke muizen, lagere buik middellijn laparotomie blootstellen van de blaas, de prostaat en de zaadblaasjes.
- Incise van de huid in de middellijn van het schaambeen tot net onder de xiphoid proces met behulp van schaar.
- Verheffen van de huid af het subcutane weefsel.
- Identificeren de avasculaire linea alba in de middellijn gelegen, en dit voer de peritoneale holte waar alle de organen zich bevinden incise.
- Bevestigen de ruimtelijke lokalisatie door visualisatie van de blauwe kleurstof of een andere geschikte tracking agent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transuretrale instillation van blauwe kleurstof via PE 50 buis resulteerde in instillation van de kleurstof in de urineblaas (figuur 4A), en via PE 10 buizen in kleuring van de SV en AP (figuur 4B), respectievelijk. Om te beoordelen of de uitgevoerde transuretrale instillation een instant terugvloeiing van het entmateriaal aan de nieren of niet veroorzaakt, werden de nier en de ureter waargenomen gevolgd door toediening van 100 µL van de blauwe kleurstof en fluorescente kleurstof (figuur 4A-B). Geen van de instillation procedure met behulp van twee verschillende maten van PE buizen en twee verschillende kleurstoffen resulteerde in kleuring van de urineleiders of nieren.
Figuur 1: 22 G naald voorbereiding voor plaatsing in polyethyleen (PE) buizen 50. De scherpe naald (A) is gemalen tegen een steen van de olie (B) te saai de scherpe randen (C). Zodra de naald saai is, is de naald ingevoegd in het lumen van de PE-buis (D) en schoof over de naald met fijne pincet (E). De buis wordt dan verlaagd tot ongeveer 1,5 inch (F). 24 G angiocath (G) kan ook worden gebruikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Mannelijke muis voorhuid dekt de glans en urethrale neusgang (A), met lichte tractie van de voorhuid van de glans kan worden blootgesteld (B) en met lichte tractie van de glans (C), de gehele voorhuid kan worden ingetrokken (D), dus waardoor voor eenvoudige toegang tot de urethrale neusgang en urethra. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Illustraties van de lagere urinewegen organen; blaas, prostaat en zaadblaasje (SV) tonen transuretrale instillation met behulp van PE 50 buis (A) en 10 PE buizen (B) voor de primaire zaaien van de urineblaas en SV/anterior prostaat, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Beelden van de bovenste en onderste urinewegen organen; nieren, blaas, prostaat en zaadblaasje (SV) na transuretrale instillation met 50 PE buis (A) en 10 PE buizen (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript wordt een methode van transuretrale instillation in volwassen mannelijke muis in detail beschreven. Differentiële primaire seeding gebied kan worden bereikt met behulp van PE leidingen van verschillende diameters. PE-50 wordt aanbevolen voor het succesvol bereiken van de urineblaas lumen, terwijl een grotere diameter die PE-10 wordt gebruikt voor het bereiken van de AP en SV (figuur 3A-B). Naast de keuze van de grootte van PE buizen en doel orgel voor inoculatie spelen andere factoren, zoals de hoeveelheid ingeprent entmateriaal, ook een rol in de eind locatie en de distributie van de oplossing. Onze experimenten tonen dat transuretrale instillation van 100 µL van blauwe kleurstof met behulp van beide PE-10 of PE-50 doet niet leiden tot de onmiddellijke terugvloeiing van de kleurstof aan de nieren. Echter de Terugvloeiing van urine aan de nieren kan gebeuren tijdens de periode na toediening en kan leiden tot nier-infectie, zoals bleek eerder in volwassen vrouwelijke muizen8. Histologische evaluatie van de nieren wordt daarom sterk aanbevolen ter bevestiging van de afwezigheid van indirecte besmetting van de nieren van transuretrale instillations.
Er zijn verscheidene belangrijke belangrijke stappen voor het uitvoeren van een succesvolle transuretrale instillation van het entmateriaal. Eerste plaats de PE-buis moet een voldoende lengte — ten minste 2,5 inch. Hierdoor zouden voor extra aanpassingen van de lengte van de buis, indien nodig, tijdens het voorbereidingsproces van de slang, of naar aanleiding van de transuretrale instillation procedure. Meerdere pogingen en storingen tijdens stap 9 van dit protocol kan een blokkade van het ingevoegde einde van de PE-buis door de lichaamsvloeistoffen. In deze situatie moet het puntje van de PE-buis worden weggesneden hebben een duidelijke tip voor vervolgpogingen. Zodra het puntje van de PE-buis wordt gesneden, is de chirurgische smeermiddel moeten opnieuw toegepast. Ten tweede, een goede grip op de spuit of PE buizen zelf verhoogt het slagingspercentage. Ten derde, een voldoende lengte van de PE-buis moet worden ingevoegd en de voorhuid, glans-penis en penile lichaam moeten worden streng opgesteld zonder handgreep tijdens het proces van catheterisatie. Anders, terugvoer van de entmateriaal kan gebeuren wanneer de zuiger van de spuit is geduwd.
Betere resultaten voor de transuretrale instillation-procedure kunnen een gevolg zijn van praktijk begeleid door het vermijden van schade aan de urethra en doel orgel tijdens de procedure. Prestaties resultaten kunnen worden gevalideerd door het gebruik van gekleurde kleurstoffen of fluorescente kleurstoffen als de procedure om primaire lokalisatie van het entmateriaal en geen symptomen van reflux aan de nieren te bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs hebben niet alle bevestigingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 10 | BD Medical | 63019-004 | |
| BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 50 | BD Medical | 63019-048 | |
| BD Insyte-N Autoguard/ Angiocath | BD Medical | 311411 | |
| Ethanol (EtOH) | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| BD Needle Only 22 Gauge (G) 1 inch | Becton Dickson | 205155 | |
| BD Needle Only 27 Gauge (G) 1/2 inch | Becton Dickson | 305129 | |
| Luer stub, 22 G X 0.5 in / Blunt Needle | Instech | LS22 | |
| Luer stub, 27 G X 0.5 in / Blunt Needle | Instech | LS27 | |
| 6" Long x 2" Wide x 1" Thick, Aluminum Oxide Sharpening Stone / Oil Stone | Norton | 40204034 | |
| Surgical Lubricant Sterile Bacteriostatic Folilpac | Surgilube | 281020543 | |
| Isoflurane | Fluriso | 13985-528-60 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Dissecting Forceps, Curved | vwr | 82027-392 | |
| BD 1 ml Syringe | BD Medical | 309626 | |
| India Ink Solution., 0.2% in PBS buffer | Alfa Aesar | J61007 | |
| 8~12 weeks old male C57B/6 Mice | Jackson Lab | #000664 |
References
- Lee, S., Yang, G., Bushman, W. Prostatic inflammation induces urinary frequency in adult mice. PLoS One. 10 (2), e0116827 (2015).
- Wong, L., Hutson, P. R., Bushman, W. Prostatic inflammation induces fibrosis in a mouse model of chronic bacterial infection. PLoS One. 9 (6), e100770 (2014).
- Elkahwaji, J. E., Zhong, W., Hopkins, W. J., Bushman, W. Chronic bacterial infection and inflammation incite reactive hyperplasia in a mouse model of chronic prostatitis. Prostate. 67 (1), 14-21 (2007).
- Boehm, B. J., Colopy, S. A., Jerde, T. J., Loftus, C. J., Bushman, W. Acute bacterial inflammation of the mouse prostate. Prostate. 72 (3), 307-317 (2012).
- Bjorling, D. E., Wang, Z. Y., Bushman, W. Models of inflammation of the lower urinary tract. Neurourol Urodyn. 30 (5), 673-682 (2011).
- Thai, K. H., Thathireddy, A., Hsieh, M. H. Transurethral induction of mouse urinary tract infection. J Vis Exp. (42), (2010).
- Bjorling, D. E., Wang, Z. Y., Boldon, K., Bushman, W. Bacterial cystitis is accompanied by increased peripheral thermal sensitivity in mice. J Urol. 179 (2), 759-763 (2008).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infect Immun. 66 (6), 2798-2802 (1998).
- Dinis, P., Charrua, A., Avelino, A., Cruz, F. Intravesical resiniferatoxin decreases spinal c-fos expression and increases bladder volume to reflex micturition in rats with chronic inflamed urinary bladders. BJU Int. 94 (1), 153-157 (2004).
- Cayan, S., et al. Botulinum toxin type A may improve bladder function in a rat chemical cystitis model. Urol Res. 30 (6), 399-404 (2003).
- Jerde, T. J., Bjorling, D. E., Steinberg, H., Warner, T., Saban, R. Determination of mouse bladder inflammatory response to E. coli lipopolysaccharide. Urol Res. 28 (4), 269-273 (2000).
- Saban, M. R., et al. LPS-sensory peptide communication in experimental cystitis. Am J Physiol Renal Physiol. 282 (2), F202-F210 (2002).
- Schilling, J. D., Mulvey, M. A., Vincent, C. D., Lorenz, R. G., Hultgren, S. J. Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli through a lipopolysaccharide-dependent mechanism. J Immunol. 166 (2), 1148-1155 (2001).
- Saban, M. R., et al. Discriminators of mouse bladder response to intravesical Bacillus Calmette-Guerin (BCG). BMC Immunol. 8, 6 (2007).
- Bjorling, D. E., et al.
- Sadler, K. E., Stratton, J. M., Kolber, B. J. Urinary bladder distention evoked visceromotor responses as a model for bladder pain in mice. J Vis Exp. (86), (2014).
