Summary
פרוטוקול זה ממחיש את הצעדים החשובים רצופים הנדרש כדי להעריך את הרלוונטיות של ניטור חיוניות פרמטר בתהליכי תיקון ה-DNA להחיות Bacillus subtilis נבגים לאחר הטיפול עם לחץ נמוך פלזמה על-ידי מעקב מתויג פלורסצנטיות DNA תיקון חלבונים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים זמן לפתור קונפוקלית וסריקה.
Abstract
פלזמה-עיקור הוא אלטרנטיבה מבטיחה שיטות העיקור קונבנציונאלי למטרות תעשייה, קליני, ומטרות בחלל. לחץ נמוך פלזמה (LPP) הפרשות מכיל קשת רחבה של מינים הפעילים, אשר להוביל איון מיקרוביאלי מהירה. ללמוד את היעילות ואת מנגנוני עיקור מאת ל"י/נ, אנו משתמשים נבגים של האורגניזם מבחן Bacillus subtilis בגלל עמידותם יוצאת דופן מפני תהליכי עיקור קונבנציונלי. אנו מתארים את הייצור של B. subtilis נבג monolayers, תהליך עיקור פלזמה לחץ נמוך ב כור פלזמה inductively בשילוב כפול, אפיון מורפולוגיה נבג באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה (SEM), ו ניתוח של נביטה, תוצר של נבגים על ידי מיקרוסקופ תא חי. יעד עיקרי של מינים פלזמה הוא חומר גנטי (DNA), תיקון פלזמה-induced נגעים DNA בעת התחייה נבג הוא חיוני להישרדות של האורגניזם. כאן, אנחנו לומדים את קיבולת נביטה של נבגים ותיקון התפקיד של ה-DNA במהלך נבג, תוצר לאחר הטיפול עם ל"י/נ באיתור מתויג fluorescently DNA תיקון חלבונים (רקה) עם זמן לפתור פלורסצנטיות קונאפוקלית מיקרוסקופ. מטופלים, נבג לא מטופל monolayers הם מופעלים עבור נביטה, דמיינו במיקרוסקופ הפוכה קונאפוקלית תא חי לאורך זמן לעקוב אחרי התגובה של נבגים בודדים. התצפיות שלנו לחשוף השבר של הנבטת ו. הנוכחי נבגים תלויה משך הטיפול-LPP להגיע למינימום לאחר 120 ס' רקה-YFP קרינה פלואורסצנטית (חלבון פלורסצנטיות צהוב) זוהה רק כמה נבגים ופיתח בכל . הנוכחי תאים עם העלאה קלה בנבגים שטופלו ל"י/נ יתר על כן, חלק מהחיידקים וגטטיבי נגזר שטופלו LPP נבגים הראו עלייה ציטופלזמה, נטו lyse. השיטות שתואר לניתוח של נבגים בודדים יכול להיות למופת לחקר היבטים אחרים של נבג ותוצר.
Introduction
יעד מרכזי של חקר החלל הוא החיפוש אחר חתימות של צורות חיים ושל מולקולות על גופים פלנטריים וירח אחרים במערכת השמש שלנו. העברת מיקרואורגניזמים או מולקולות כדור הארץ לאזורים קריטי של חקר הוא סיכון מסוים לפגיעה פיתוח, שלמות של החיים-זיהוי משימות על גופים פלנטריים כגון מאדים ואת אירופה1. ההנחיות הבינלאומי של הגנה על כוכבי הלכת, הוקמה על ידי הוועדה של שטח מחקר (COSPAR) בשנת 1967, לכפות חוקים נוקשים על משימות רובוטיות ומזומן כוכבי לכת אחרים, ירחים שלהם, אסטרואידים וגופים שמימיים אחרים ולווסת ניקוי ועיקור של חללית, רכיבי חומרה קריטיים מוקדמת להשיק כדי לשלול זיהום מיקרואורגניזמים יבשתי ולמנוע זיהום לחצות של גופים שמימיים2. במהלך העשור האחרון, היישום של הלא-thermal פלזמות צבר רחב לב במחקר ביו-רפואי, תזונה, כמו גם בחלל יישומים3,4,5. פלזמה-עיקור הוא אלטרנטיבה מבטיחה שיטות העיקור קונבנציונאלי כפי שהוא מציע איון חיידקים מהיר ויעיל6, בעת היותו עדין כדי רגיש וחומרים יציב חום. פלזמה הפרשות מכילות תערובת של תגובתי סוכני כגון פוטונים אולטרה סגול (UV) ולאחר ספקטרום אולטרה סגול ואקום (VUV) אשר להוביל איון מיקרוביאלי מהירה3אטומים מתרגש/נייטרלי, חלקיקים טעונים, רדיקלים חופשיים. במחקר זה, אנו משתמשים בלחץ נמוך פלזמה שנוצר על ידי זוגי בשילוב inductively פלזמה בלחץ נמוך (DICP) מקור7,8 כדי להשבית Bacillus subtilis endospores מופץ על זכוכית בדיקת השטח.
חיידקים גראם חיוביים של משפחת Bacillaceae מופצים באופן נרחב בבתי-גידול טבעיים של אדמה, משקעים אוויר כמו כמו דופן סביבות כגון מתקני חדר נקי, תחנת החלל הבינלאומית9,10 ,11. התכונה ברורים ביותר של הסוג של Bacillus היא יכולת ליצור עמידים מאוד endospores רדום (ןלהל נבגים) כדי לשרוד את התנאים שלילי, כגון דלדול מזין12. הנבגים עמידים בדרך כלל הרבה יותר מאשר עמיתיהם תא וגטטיבית מגוון של טיפולים, לחצים סביבתיים, כולל חום, UV, הקרנה גמא, לייבוש, הפרעה מכנית של כימיקלים רעילים, כגון המחמצנים חזק או סוכני שינוי ב- pH (נבדקה הפניות13,14) ולכן הם אובייקטים האידיאלי לבדיקת היעילות של שיטות איון מיקרוביאלי. מאז הדנ א הגנומי יעד עיקרי של טיפול פלזמה של15,חיידקים16, תיקון פלזמה-induced נגעים דנ א (למשל שוברת הד כפול) על נבג התחייה חיונית להישרדות של חיידקים13, 17.
לכן, אנחנו לומדים את קיבולת נביטה של נבגים ואת התפקיד של DNA לתקן במהלך נבג, תוצר לאחר בטיפול את הנבגים עם לחץ נמוך ארגון פלזמה על-ידי נבגים בודדים הבאים ותיקון שלהם ביטוי של DNA מתויג קרינה פלואורסצנטית חלבון רקה עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות קונאפוקלית זמן לפתור. אנחנו נותנים הוראה צעד אחר צעד של הכנת B. subtilis נבגים ב monolayers להשגת תוצאות הבדיקה לשחזור, הטיפול של ספורה monolayers עם לחץ נמוך פלזמה עבור עיקור, הכנת פלזמה מטופלים נבגים עבור ultrastructural הערכה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM), וניתוח מיקרוסקופיה של תא חי ברמה של נבגים בודדים בהופעה עם ניטור פעיל הדנ א תיקון תהליכים המתרחשים בתוך התא בתגובה טיפול פלזמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור נבג bacillus subtilis , טיהור
- לייצור נבג, להעביר לילה מ ל תרבות של בהתאמה זן B. subtilis , בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה, 200 מ ל כפול-כוח נוזלי שפר הנבגה לבינוני (לכל ליטר 16 גרם מרק מזין, אשלגן כלורי 2 g, 0.5 ג'י MgSO 4* 7 שעות2O, 2 מ ל 1 מ' Ca (3)2, 2 מ ל- 0.1 M-MnCl-2 * • 4 H2O, 2 mL מ"מ 1 מכל4, 2 מ ל- 50% (w/v)-גלוקוז-18) ולטפח אותו עם לערבב נמרצת ב 37 ° C 72 h או עד > 95% של התרבות יש sporulated. הנבגים של זנים הבאים משמשים: B. subtilis PY79 (סוג פראי) B. subtilis PY79Δרקה:: ניאו (לקויה של חלבון תיקון ה-DNA רקה) PY79 B. subtilis רקה-yfp:: חתול (רקה התמזגו עם צהוב חלבון פלואורסצנטי [YFP]19).
- הקציר נבגים על ידי צנטריפוגה למשך 15 דקות ב 3000 g x 50 מ ל צינורות ולטהר את הדוגמאות על-ידי כביסה חוזרות שלבים (עד 15 פעמים) באמצעות סטרילי מזוקקים H2O ולבדוק לקבלת מעמד של טוהר, נביטה על-ידי ניגודיות שלב מיקרוסקופ. ודא נבג המתלים מורכבות מתוך שלב בהיר נבגים (> 99%) הינם ללא תאים וגטטיבי (מוטות), נבגים מונבטים (מראה שחור / אפור) ופסולת תאים, אחרת עוד ניסויים מיקרוסקופ יכול לעשות. לשטוף את הדגימה עד טוהר הרצוי.
- קבוע כייל הנבג על ידי ציפוי החוצה µL 50 של דילולים טורי 10-fold על LB-אגר (קרי: שימוש 30 מדגם µL + 270 µL במים סטריליים לקבלת 1:10 דילול. לקחת µL 30 מ דילול מסוים 270 µL H2O לדילול מטריים וכך הלאה) לחשב את CFU (המושבה יוצרי יחידות), דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר CFU נחישות, להתאים את הדגימה כדי נבגים9 10 לכל mL ריכוז או דילול עם מים סטריליים.
2. דגימה הכנת שהופקדו תרסיס Bacillus subtilis נבגים
הערה: הצטברות חופפים של נבגים עשויים לגרום צל אפקטים במהלך הטיפול, בסופו של דבר וכתוצאה קינטיקה איון זייף. כדי למזער את הבעיה, הכן נבג בדגימות באמצעות טכניקה העדות תרסיס20. בקצרה, שולט הצינור 2-חומר ברמת דיוק גבוהה עם שעון העצר של חשמלי המווסת את התפוקה נוזלי בהופעה עם הזרם המוביל בלחץ גז (כאן N2). לפזר את הדגימה נוזלי מוזרק דרך שקע זרבובית באמצעות זרימת גז חנקן.
- מקום נשא לדוגמה בטופס של שקופיות מיקרוסקופיים סטיריליים (עבור הישרדות קינטיקה) או עגולה coverslips 25 מ מ (לצורך מעקב פלורסנט של DNA לתקן תהליכים/cLSM; סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי) בתוך בתרסיס המופעלים חשמלית ריסוס יחידה מזדהים עם הזרבובית. ריכוז נבג משומש צריך להתאים לחצית הריכוז הסופי הרצוי.
- העברת 1 מ"ל של התרבות נבג לים נוזלים זרבובית וליזום את תהליך התזת של 0.1 s, בלחץ של 1.3 בר. נבג מותז ההשעיה (1 x 107) טפסים סרט דק בשקופית מיקרוסקופיים מתייבש במהירות בתוך שניות כדי ליצור טפט של נבג מבוזרות בצורה אחידה. חנות נשאיות שטופלו הדגימה במיכל סטרילי בטמפרטורת החדר.
3. טיפול פלזמה לחץ נמוך
- להכין את מערכת פלזמה לטיפול של דגימות ביולוגיות, להפעיל את המערכת-5 הרשות הפלסטינית עם ארגון פלזמה-500 ואט במשך 5 דקות. על ידי זה, כל המשטחים במערכת הם מנקים את לחמם. זה מפחית דבק של מולקולות של אויר, כלומר חנקן, חמצן ומים, תוך אוורור המערכת. לאחר רעלני של המערכת, לפרוק את התא, למקם את הדוגמאות בזהירות במרכז הספינה הכור בעזרתו של ארונות זכוכית.
- השתמש משכפל ביולוגית לפחות שלושה. לסגור את התא ותתפנה מתחת 2 אבא אחר כך, מילוי הגז תהליך לתוך החדר. לווסת את הלחץ במערכת כדי 5 הפלסטינית.
- אחרי הפעם תהליך מוגדר, לבטל את אספקת חשמל וגז, בזהירות לפרוק את המערכת כדי למנוע לפוצץ את הדגימות ממחזיק מדגם. לאחר אוורור, להסיר את הדגימות ולמקם את הדגימות עבור הפרמטר הבא במערכת. עבור פקדים שאינם פלזמה-מטופלים לחשוף דגימות אבק בלבד (5 הרשות הפלסטינית) בנוכחות של הגז תהליך מקביל לזמן הארוך ביותר יישומית פלזמה.
4. שחזור והערכה של הישרדות נבג
- להכין פתרון של בלוק 10% דבק פלסטי (PVA), לכסות המוביל מדגם בזהירות עם-500 µL ולתת להם air-dry עבור 4 h רצועת את השכבה PVA מיובשים (מכיל כעת המדגם נבג) באמצעות מלקחיים סטרילי והעברתה 2 מ ל תגובת הרכבת התחתית. להוסיף 1 מ"ל של מים סטריליים הצינור, להמיס את שכבת PVA ויה vortexing. הליך זה מוביל > 95% התאוששות של נבגים ואינו משפיע על היכולת שלהם נביטה21.
- באופן סדרתי לדלל את הדגימה ב 1:10 במים סטריליים בצלחת 96-ובכן (קרי 270 µL סטרילי H2O + דילול מדגם/לשעבר 30 µL). צלחת החוצה µL 50 של כל דילול על Lysogeny מרק מזין אגר (ליברות), דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולספור את מספר מושבות מבוגר (CFU).
5. חיים התא מיקרוסקופ ומעקב תהליכי תיקון ה-DNA הנבטת נבגים
- לניסויים נביטה, להכין 1 מ"מ עובי 1.5% LB-אגר פנקס, הרתחה 700 µL בינונית, pipet אותו לתוך צלחת פטרי מיקרוסקופ סטרילי. לאחר 10 דקות, לגזור 8 מ"מ x 8 מ"מ x 1 מ מ LB-אגר pad עם איזמל סטרילי ולהעביר את אגר בזהירות על גבי monolayers נבג אשר מונחות על coverslips זכוכית דקה 25 מ מ.
הערה: שלב זה הוא קריטי עבור ויזואליזציה של נבגים בודדים ולאפשר בעקבות התגובה שלהם, לקראת ההפעלה של נביטה שנגזרות אגר מזין. לפיכך, LB-אגר משמשת לשתי מטרות, (1) כדי לתקן את הנבגים על פני השטח, אשר מונע relocalization לאורך פני השטח, ממוקד אופטי, ו- (2) כדי להפעיל את הנבג עבור נביטה. - לאחר המכסה את הדגימה עם אגר, להעביר coverslip זכוכית במהירות לתוך תא הדמיה מיקרוסקופ הדגימות עם קונאפוקלית סריקה בלייזר במיקרוסקופ אוטומטי עם אופטיקה הפוכה באמצעות 63 X / 1.3 מטוס apochromatic שמן טבילה אובייקטיבי.
-
בצע הדמיה של קרינה פלואורסצנטית (YFP) עם עירור אורך גל של nm ו פליטה 514 ניתן להבחין בין 520 ו 560 ננומטר.
- תמונות מלון הרשומה בהיר-שדה באחת מכפילי צילום (נתיב אור ששודרו) במצב סריקה.
- להקליט סדרת בצילום מואץ עם כוח לייזר של 2.6%, וקבעו את הצמצם קונאפוקלית ל 5 יחידות אוורירי, בתדר דגימה של מסגרת 1 לכל 30 s מ- 0 h עד 5 שעות, תלוי בניסוי. . זה בולטת במיוחד כי מינונים גבוהים של מונוכרומטי לייזר תאורה-514 nm לחלוטין לעכב נביטה (איור 1א', ב').
- שומרים את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס (לחות אויר) בשלב חימום במהלך התהליך הדמיה. עבור כל תנאי לצפות בקבצים יש להשתמש בתוכנת עריכה התומכת בפורמט משכפל ביולוגית לפחות שלושה. במקרה של צבירת נבג, נבג מרובה שכבות הפצה או זיהום על ידי חלקיקי אבק, חסימה של הטיפול פלזמה ("צל") עלולה להתרחש ולאפשר נביטה של נבגים מוצלל (איור 1C, D).
איור 1: בעיות פוטנציאליות ציין במהלך תא חי קונאפוקלית מיקרוסקופ פלורסצנטיות פלזמה מטופלים נבגים. (A, B) עיכוב של נבג נביטה על ידי מינונים גבוהים של מונוכרומטי (514 ננומטר) לייזר תאורה. (א) סקירה (3 x 3 מסגרות תפור) של B. subtilis (LAS72, רקה-YFP) נבגים 180 דקות לאחר החניכה של נביטה. המסגרת באמצע נחשף במרווחי s 30 למינונים גבוהים של אור לייזר (514 ננומטר, עוצמת הלייזר 70%), ואילו האזורים שמסביב (= מסגרות) היו לא מואר (התמונה הממוזגת של שדה בהיר וערוץ רקה-YFP פלורסצנטיות; הורה היו מבנים נגרמת על-ידי שימוש 35 מ מ הדמיה מנות עם רשת מוטבעים מיקרומטר 500). (B) מדגים 4 X תצוגה מוגדל של הגבול בין אזור מואר, שאינו מואר מראה כי נבגים, אשר נחשפו מינונים גבוהים של תאורה לייזר מונוכרומטי לא לנבוט ולגדול, ואילו נבגים ב אזורים שאינו מואר לשחזר באופן מלא חיידקים וגטטיבי לבטא בהיר רקה-YFP קרינה פלואורסצנטית (אות ירוק). (C, D) נבגים מכוסה על ידי זיהום חלקיקי או שכבות מרובות של נבג (חיצים) נראה מפני נבגים כבסיס איון על ידי טיפול פלזמה ולאפשר שלהם נביטה, תוצר ("צל אפקט"). נבגים (ג) היו שטופלו פלזמה 60 s ו שבעורך 180 דקות לאחר החניכה של נביטה או (ד) תמורת 120 s ולא עם תמונה לאחר מינימום 240 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
6. סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)
- השתמש מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כדי לספק ultrastructural מידע אודות המורפולוגיה משטח של נבגים פלזמה מטופלים בהשוואה פקדים ללא טיפול. מעיל monolayers נבג מיובשים על coverslips עם זהב-פלדיום (3 ננומטר) באמצעות לרעוד. להוציא-coater. השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים סריקה שדה פליטה הדמיה הדגימות, פעלו עם 5 מתח ההאצה kV כולל של גלאי בעדשה משני אלקטרונים כדי לחשוף את הטופוגרפיה חדות.
7. ניתוח נתונים
- לקבוע נבג הישרדות בין המנה N/N0, כאשר N הוא מספר הממוצע CFU של דגימות שטופלו ו- N0 הוא הממוצע CFU של פקדים ואקום ללא טיפול. מגרש נבג איון על ידי ארגון טיפול פלזמה כפונקציה של הזמן (בשניות). אקספרס כל הנתונים ממוצעים, סטיות תקן (n = 3).
- ניתוח תמונות מתקבל על ידי הדמיה תא חי שימוש בתוכנת הדמיה. לכמת את הפרופורציה של נבג ולספור. הנוכחי לאחר טיפול פלזמה, נבגים במסגרות נציג בתחילת הניסוי, כמו גם אחרי 4 שעות. קביעת משמעות מבחני הישרדות נבג, לשימוש חד-כיווני אנובה-בדיקות (ניתוח השונות) עם תוכנה סטטיסטית). P ערכים < 0.05 נחשבים כמו סטטיסטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההישרדות של מטופלים-פלזמה B. subtilis נבגים
טיפול פלזמה של נבגים B. subtilis להשתמש בתוכנית לימוד ירידה בהישרדות עם הגדלת משך הטיפול פלזמה (איור 2). נבגים של המתח לבטא את רקה-ין דבוקה YFP הראה הישרדות עקומות הדומה נבגים של המתח פראי סוג, המציין כי השינוי הגנטי יש השפעה משמעותית על חיוניות חיידקי. נבגים של המתח חשוכת-רקה להפגין רגישות גבוהה יותר לקראת טיפול פלזמה לעומת נבגים של המתח פראי סוג, להפגין הנוכחות של הגן רקה היא הפחתת פלזמה-induced אובדן חיוניות. במיוחד קצר טיפול פלזמה של 15 s (P <0.003) ו-30 s (P < 0.004) לגרום ירידה משמעותית החיוניות של זנים רקה לקויה לעומת פראי סוג וללחצים רקה-YFP. לאחר 90 s של טיפול פלזמה, חיוניותם של כל הזנים הוא מופחת על ידי כ שלושה סדרי גודל.
איור 2: הישרדות של B. subtilis נבגים של זנים שונים לאחר הטיפול עם ארגון בלחץ נמוך פלזמה. הישרדות (CFU אכזרי של פלזמה מטופלים נבגים/ממוצע CFU נבגים שטופלו ואקום; קווי שגיאה לייצג סטיית תקן) מותווים נגד משך טיפול פלזמה. PY79 (סוג הפרוע; מעגלים סגורים), LAS72 (רקה-YFP; עיגולים אפורים) ו LAS24 (Δרקה; פתח עיגולים). ניתוח סטטיסטי הראה אין הבדלים משמעותיים נבג שרידות בין PY79 (יבוצעו בהם שינויים רקה) ו LAS72 (רקה-YFP-fusion).
ניתוח ultrastructural של נבגים פלזמה שטופלו על ידי SEM
כדי לקבל מושג ההשפעה מורפולוגי של הפלזמה טיפול על הנבגים, סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) נעשה שימוש כדי לנתח המורפולוגיה משטח של נבגים פלזמה מטופלים בהשוואה נבגים שטופלו ואקום (בקרה). המשטח החיצוני של B. subtilis נבגים חושפים האופיינית מבנים דמויי-רכס האורך אשר נראים כל הזמן בנבגים כל טיפול ללא טיפול (איור 3). טיפול פלזמה עד 30 s גורם ללא שינויים משמעותיים של המורפולוגיה משטח נבג לעומת שליטה (איור 3A-C). הגדלת משך טיפול פלזמה (60-240 s) מוביל משטח נבג פרטנית יותר (איור 3D-F), סדקים קטנים, יכול להיות שנצפו סדקים בנבגים טיפול 120 או 240 s. יתר על כן, כדוריות קטנות עולות על משטחים נבג (120 s ו- s 240 טיפולים, איור 3E, F), אשר נגרמת על ידי חומר המשוחררים מן המעיל, קליפת המוח או מן הפנימי ליבה22. צבע אלה מכסה כל הנבג, ניתן למצוא על המבנים בצורת וריד, כמו גם על משטחי ביניים.
איור 3: SEM של נבגים B. subtilis (LAS72, רקה-YFP) ריססו על coverslips זכוכית דקה לאחר טיפול פלזמה בלחץ נמוך- נבגים נחשפים ואקום בלבד, לא כדי פלזמה (בקרה) מוצגים (א). (B-F) נבגים שהיו שטופלו פלזמה עם הגדלת משך (15, 30, 60, 120 ו-240 s). נבגים שהיו שטופלו פלזמה 60 s או יופיעו עוד פרטנית יותר על פני השטח שלהם מאשר נבגים שליטה או נבגי אשר פלזמה-טופלו במשך 15 עד 30 ס' סדקים סדקים (החצים הלבנים) גלויים על פני השטח של נבגים פלזמה-טיפול 120 או 240 ס לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
חיים התא מיקרוסקופ של פלזמה שטופלו B. subtilis נבגים
תא חי מיקרוסקופיה של החייאת נבגים של זנים B. subtilis לבטא החלבון שאותה ניתן להתאים זריחה תיקון רקה (רקה-YFP) זה מבוצע על מנת לנתח את קיבולת נביטה ואת הביטוי של רקה-YFP נבגים בודדים ב התגובה לטיפול פלזמה. כאן, אנו משתמשים זמן לפתור סריקה בלייזר מיקרוסקופיה קונפוקלית לעקוב נביטה, תוצר, התקדמות לתוך מצב וגטטיבי שטופלו פלזמה נבגים (איור 4) לגבי בעיות מוכרות שעשויות להיות למשל הוספת צל אפקטים או עיכוב של נביטה על ידי מינונים גבוהים של תאורה לייזר מונוכרומטי (איור 1). נבגים נחשפים ואקום (השליטה היחידה, איור 4A-C), להפגין כמה אותות פלואורסצנט במהלך הברית מוקדם של נבג התחייה (0 - 65 דקות, לא מוצג). עלייה בעוצמת פלורסצנטיות, ככל הנראה עקב הצטברות רקה-YFP, נצפית אצל ≥ 65 דקות כאשר תאים וגטטיבי נוצרים תאים הראשון להתחיל לחלק. כל התאים האלה הנמל אות פלורסצנטיות שנצבר בתנוחה אחת לפחות בתוך כל תא. כמעט כל הנבגים (98 ± 2%; 589 ± 14, n = 4) שטופלו ואקום כמו פקד לנבוט ולפתח מורפולוגיה תאים בצורת מוט באורך אחיד למדי של תאים בודדים (איור 4בג). בניגוד נבגים בפקדים ואקום, נבגים טיפול 15 s עם פלזמה כבר להראות קיבולת נביטה של פחות מ 75 ± 4% (197 נבגים ± 8, n = 3, איור 4D-F), המציין כי טיפול פלזמה גורם נזק בנבגים רדום, אשר מונע נביטה. בנוסף, המורפולוגיה של תאי. הנוכחי הוא שונה המורפולוגיה של תאי בפקדים. התאים גדלים גם לתוך מוטות ארוכים בהרחבה (יותר לעומת שליטה) או להישאר קטן ולהישאר במעיל נבג (איור 4G-אני). יתר על כן, הכי תאים מאורכים lyse עם הגדלת גודל תא (ראשי חץ לבן, איור 4F). קרינה פלואורסצנטית אותות רקה-YFP בתוך התאים להיות מעט מוגברת בהשוואה האותות בתאים שליטה (איור 4C, F), אך אין הבדלים משמעותיים יכול להיות שנצפו (לא ראה). נבגים שהיו פלזמה טיפול 30 s לנבוט עד 25 ± 6% (99 ± 4 נבגים, n = 3), תאי צמח ובייחוד חל עיכוב בצמיחה לעומת שליטה נבגים של נבגים לאחר 15 s של פלזמה-טיפול. תאי צמח הם די קטנים בצורת מוט אבל נבדלים (איור 4G-אני). עם זאת, תאים בכל הגדלים ייתכן lyse בתקופות דגירה ארוך כפי שניתן לראות עבור דגימות לאחר 15 s של פלזמה-טיפול. לאחר 60 s של פלזמה-טיפול פחות מ- 2 ± 2% (נבגים ± 8 8, n = 3) נבגים מסוגלים ליצור תאים וגטטיבי (איור 4J-L). נבגים אשר פלזמה-כאל 90, 120 או 240 s ניתן לנתח, אך הם מראים אין תוצר או כל שינוי ברמות קרינה פלואורסצנטית של רקה-YFP (לא מוצג).
איור 4: קונאפוקלית סריקה בלייזר לחיות התא מיקרוסקופ של B. subtilis נבגים של זן לבטא רקה-YFP לאחר טיפול פלזמה, חניכה של נביטה. נבגים עקבו במשך הזמן (תמונה אחת לכל 30 s) מוצגות תמונות עבור h בזמן נקודות 0, 2 ו- 4. (A-C) נבגים שטופלו ואקום רק, לא עם פלזמה (בקרה) לנבוט לגדול לתאים וגטטיבי (B), הזן שלב הגידול המעריכי (C). (D-L) נבגים טיפול משך שונה עם פלזמה ארגון בלחץ נמוך הראה הבדלים משמעותיים תוצר שלהם בהשוואה נבגים של הפקד (ראה טקסט לפרטים). טיפול s (D-F) 15 (ראשי חץ לבן מייצגים וגטטיבי תאים, אשר לאחרונה lysed), (G-אני) 30 טיפול s (ראשי חץ שחור דמיינו תאים וגטטיבי, אשר היו קטנים, תכניס המעיל נבג) וטיפול s (J-L) 60 לאחר 0 h, 2 h ו- 4 h נבג זמן ההחלמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עיקור וסירוס של משטחים באמצעות בטמפרטורה נמוכה, פלזמה בלחץ נמוך היא חלופה מבטיח עיקור די קונבנציונלי הליכים כגון טיפול עם מייננת קרינה, כימיקלים (למשל גזים כמו H2O2 או אתילן אוקסיד) או חום לח ויבש23. שיטות העיקור רגילים מספקים בעיקר של עיקור יעיל, אך הם ידועים כדי להשפיע על חומר התייחס ומייצגים סיכון פוטנציאלי למפעיל. פלזמה בלחץ נמוך מציע מהיר ולא הומוגנית ביולוגי איון באמצעות ההרכב של מספר רכיבים כגון UV פוטונים, אלקטרונים חופשיים, יונים ויצא אטומים או מולקולות (למשל ROS). לכן, ל"י/נ ניתן ליישם חומרים רגישים חום וקורוזיה, כגון פולימרים תרמופלסטיים עבור שתלים, מכשירים אלקטרוניים או 3D-מבנים מורכבים. המאמר הנוכחי אנחנו מדגימים את היישום של מערכת בדיקה כזו, ב אשר monolayers של מותז B. subtilis נבגים20 מטופלים ב כור פלזמה בלחץ נמוך מסוים אשר תוארה לאחרונה פרט7. בבדיקה מיקרוסקופית שדה בהיר של נבגים שטופלו פלזמה עשוי להיות מספיק עבור קבלת הערכה הכוללת של יעילות החיטוי. עם זאת, אנו מעוניינים המיקוד המנגנון הבסיסי של לחץ נמוך פלזמה והשפעתו על איון נבג ברמה המולקולרית. בשילוב עם מעקב לזרוח מיקרוסקופ הוא מאפשר לנו לשפוך אור על הפרטים של תגובה זו מולקולרי מסוים בנבגים שטופלו פלזמה, שעלולים לתת לנו תובנות לגבי מנגנון איון הבסיסית של לחץ נמוך פלזמה.
כאן, אנו מתמקדים הניתוח של יעילות פלזמה-טיפול ו אפקטים באמצעות מיקרוסקופ תא חי, אשר מאפשר בעקבות נבגים בודדים לאחר החניכה של נביטה. למרבה הפלא, גישה מסוימת זו מגלה כמה תוצאות חדשות אשר לא יכול להינתן על ידי מדידת חידוש של האוכלוסייה נבג כולו באמצעות קביעת מספר הטלפון הנייד או CFU. קודם כל, פלזמה-טיפול נבגים לא משפיעה רק על הקיבולת של תוצר באופן תלוי מינון, כצפוי מן המדד של הישרדות על-ידי קביעה של CFUs, אלא גם המורפולוגיה של תאי צמח, אשר לעתים קרובות לפתח אין אפשרות גדולה מוטות כדי septa טופס על פי חלוקת התא המתאים יחד עם תאים קטנים ותוקע בכל הנבג (15 s של פלזמה-טיפול) או תאים על אורך מופחתת (30 s של פלזמה-טיפול). תצפיות של תאים עם אורך מופחתת הראה לא שחזור תאים נורמליים אורך בנקודות זמן מאוחר יותר. יתר על כן, חיים תא הדמיה מגלה כי רוב התאים מורפולוגית שינו lyse בשלבים מאוחרים יותר של התבוננות. פירוש הדבר כי הנזק שנרכש על ידי הנבגים במהלך פלזמה-טיפול יעיל רק בשלבים מאוחרים יותר של חידוש נבג, ככל הנראה עקב נזק לדנ א כי המנגנון המשמש נביטה של תוצר היא איתנה יותר לכיוון פלזמה עיקור יותר המכונות לצורך גידול וגטטיבי. למרבה הפלא, ביטוי של החלבון רקה תיקון דנ א נראה נמוך וכמעט נעדר נבגים ומפתחת במהלך תוצר ושלב וגטטיבי כמצוין על-ידי עלייה רקה-YFP פלורסצנטיות17. עם זאת, אפילו מעט מוגבר רקה ביטוי בנבגים. הנוכחי שטופלו פלזמה, לעומת שליטה נבגים, לא עוזר להציל את חיוניות תא באופן כמותי, כי רוב התאים lyse או פרץ לאחר תוצר, במיוחד אחרי יותר מ-3 שעות של הדגירה. אפקט זה יכול להיות visualized באמצעות תא חי סרטים מתמונות לשגות זמן נבגים מונבטים. אנחנו לא יכולים להוציא את האפקט הזה הוא overemphasized על ידי מצב הטיפוח-תרגול מסוים שבו התאים נאלצים ב טפט באמצעות כיסוי דק של אגר.
עוד תוצאת הניתוח על ידי מיקרוסקופ תא חי הוא מציג חלקיקים (למשל חלקיקי אבק, נבגים אחרים) על פני טפט נבג יכולים לחסום. את הנבגים הבסיסית מפני ההשפעות המזיקות של הפלזמה. במקרים כאלה טיפול פלזמה ואף יותר נראה לא יעיל. מאז מציג כזה קשה להימנע לחלוטין, אסטרטגיות פלזמה-טיפול אלטרנטיבי צריך להיבדק, כגון שימוש סיבוב כוכבי הלכת במהלך טיפול פלזמה בשיתוף עם המורחבת משך הטיפול. הניתוח על ידי SEM מציין המעיל נבג הוא מחורר עם משך מוגברת של פלזמה-טיפול אשר עולה בקנה אחד עם התיאוריה של פלזמה בתיווך ההשפעות על עניין22,24. זמן חשיפה ממושכת (> 240 s) פלזמה אולי אפילו לנקב את חלקיקי מזהמים, ובכך עלול לגרום נזק ולהעביר להשבית את הנבגים הבסיסית.
פרוטוקול הציג עבור תא חי מיקרוסקופיה של נבג, תוצר יכול להיות מתאים מחקרים אחרים גם כן. מכסה את הנבגים עם שכבה דקה של אגר כופה את הנבגים במטוס אופטי ברורים ומגביל את התנועה לרוחב. שני אפקטים מבטיחים כי נבגי ותאים. הנוכחי להישאר בתוך המסגרת שנבחרה הדמיה. גישות דומות שתוארו לפני25 אבל מספקים שגמישות מאשר השיטה המתוארים כאן מה שמאפשר בחירה כמעט בכל נושא לדוגמה (למשל זכוכית, coverslip או צלחת פטרי). בידיים שלנו חיידקים וגטטיבי אחרים יכול להיות מנותח על ידי מיקרוסקופ תא בשידור חי באמצעות השיטה אגר-כיסוי). בכל מקרה, זהיר בקרת ניסויים צריכה להתבצע כדי להעריך את תופעות אפשריות לנזק צילום במהלך הדימות תא חי, כי ראינו כי מינונים גבוהים של אור מונוכרומטי לייזר לעכב לחלוטין נבג. מלבד קיצור הזמן תאורה, כלומר על ידי הגדלת מרווחי זמן של התבוננות, ניתן למנוע תופעה זו על ידי הפחתת עוצמת לייזר ו/או פתיחת הצמצם קונאפוקלית (נקב).
לסיכום, בין הטכניקות עבור יעילות של טיפול פלזמה במודל של מותז B. subtilis נבג monolayers, מיקרוסקופיה תא חי מספק תובנות ייחודיות הסלולר אירועים בתקופת התחייה נבג, ומציע את האפשרות כדי לנתח את הדינמיקה של חלבונים מתויג זריחה. יתר על כן, הכנת מדגם מסוים, כלומר כיסוי של נבגים עם שכבה דקה של אגר, יכול להיות פרדיגמטי עבור ההדמיה של מיקרואורגניזמים אחרים על ידי מיקרוסקופ תא חי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
שאין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים תודה אנדריאה שרדר לסיוע טכני מעולה שלה במהלך חלקים של עבודה זו, Nikea ג'יי אולריך על הסיוע במהלך הצילומים וידאו. כן נרצה להודות לייל א סימונס על התרומה הנדיבה שלו של זנים Bacillus subtilis : LAS72 ו- LAS24. עבודה זו נתמכה חלקים על ידי מענקים מ קרן מחקר גרמני (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon פאק 728) הפלסטינית (או 7/3-1), RM (2023 מו/2-1) ואת ה-DLR להעניק חיים ISS DLR-FuW-פרויקט, Programm RF-FuW, Teilprogramm 475 (F.M.F, M.R., חומרי גלם). F.M.F. נתמך על ידי מלגה לתואר שלישי של אסכולת מחקר מדעי החיים שטח (SpaceLife) הלמהולץ-הגרמני וחלל מרכז (DLR) בקלן, גרמניה, אשר מומן על ידי האגודה הלמהולץ (הלמהולץ-Gemeinschaft) על פני תקופה של שש שנים ( מענק מס VH-KO-300) וקיבל כספים נוספים מבית ה-DLR, לרבות המנהלים וחלל, המכון לרפואה התעשייה האווירית לישראל. התוצאות של מחקר זה ייכלל את עבודת הדוקטורט של פליקס מ פוקס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
References
- Nicholson, W. L., Schuerger, A. C., Race, M. S. Migrating microbes and planetary protection. Trends Microbiol. 17, 389-392 (2009).
- COSPAR. COSPAR Planetery Protection Policy. Space Research Today, COSPAR's Information Bulletin. 193, 1-14 (2015).
- De Geyter, N., Morent, R. Nonthermal plasma sterilization of living and nonliving surfaces. Annu Rev Biomed Eng. 14, 255-274 (2012).
- Shimizu, S., et al. Cold atmospheric plasma - A new technology for spacecraft component decontamination. Planet. Space Sci. 90, 60-71 (2014).
- Lerouge, S., Fozza, A. C., Wertheimer, M. R., Marchand, R., Yahia, L. H. Sterilization by Low-Pressure Plasma: The Role of Vacuum-Ultraviolet Radiation. Plasma Polym. 5, 31-46 (2000).
- Rossi, F., Kylián, O., Rauscher, H., Gilliland, D., Sirghi, L. Use of a low-pressure plasma discharge for the decontamination and sterilization of medical devices. Pure Appl. Chem. 80, 1939-1951 (2008).
- Halfmann, H., Hauser, J., Awakowicz, P., Koller, M., Esenwein, S. A. A double inductively coupled low-pressure plasma for sterilization of medical implant materials. Biomed Tech (Berl). 53, 199-203 (2008).
- Halfmann, H., Denis, B., Bibinov, N., Wunderlich, J., Awakowicz, P. Identification of the most efficient VUV/UV radiation for plasma based inactivation of Bacillus atrophaeus spores. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 5907 (2007).
- Vaishampayan, P., et al. Bacillus horneckiae sp. nov., isolated from a spacecraft-assembly clean room. Int J Syst Evol Microbiol. 60, 1031-1037 (2010).
- Mandic-Mulec, I., Stefanic, P., van Elsas, J. D.
- Alekhova, T. A., et al. Diversity of bacteria of the genus Bacillus on board of international space station. Dokl Biochem Biophys. 465, 347-350 (2015).
- Claus, D., Bekerley, R. C. W. Genus Bacillus Cohn 1872. Bergey's manual of systematic bacteriology. Sneath, P. A. 2, Williams and Wilkins. Baltimore, MD. 1105-1141 (1986).
- Setlow, P.
- Setlow, P. Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat and chemicals. J Appl Microbiol. 101, 514-525 (2006).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Characterization of Bacillus subtilis spore inactivation in low-pressure, low-temperature gas plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 108, 521-531 (2010).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Response of Deinococcus radiodurans to low-pressure low-temperature plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 109, 1521-1530 (2010).
- Setlow, B., Setlow, P. Role of DNA repair in Bacillus subtilis spore resistance. J Bacteriol. 178, 3486-3495 (1996).
- Schaeffer, P., Millet, J., Aubert, J. P.
- Simmons, L. A., et al. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Raguse, M., et al. Improvement of Biological Indicators by Uniformly Distributing Bacillus subtilis Spores in Monolayers To Evaluate Enhanced Spore Decontamination Technologies. Appl Environ Microbiol. 82, 2031-2038 (2016).
- Horneck, G., et al. Protection of bacterial spores in space, a contribution to the discussion on Panspermia. Orig Life Evol Biosph. 31, 527-547 (2001).
- Opretzka, J., Benedikt, J., Awakowicz, P., Wunderlich, J., Keudell, A. v The role of chemical sputtering during plasma sterilization of Bacillus atrophaeus. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 2826 (2007).
- Stapelmann, K., et al. Utilization of low-pressure plasma to inactivate bacterial spores on stainless steel screws. Int. J. Astrobiol. 13, 597-606 (2013).
- Raguse, M., et al. Understanding of the importance of the spore coat structure and pigmentation in the Bacillus subtilis spore resistance to low-pressure plasma sterilization. J. Phys. D: Appl. Phys. 49, 285401 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS one. 8, e58972 (2013).
