Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

بروتوكول لتتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات مفردة

Published: January 3, 2018 doi: 10.3791/56711
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Duke University

Summary

تفاصيل البروتوكول هذا ببناء وتشغيل المجهر تتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات واحدة قادرة على تعقب النانو الفلورسنت يسبر سرعة انتشارية عالية ومعدلات العد فوتون منخفضة.

Abstract

جسيم واحد ثلاثي الأبعاد في الوقت الحقيقي تتبع (RT-3D-SPT) لديه القدرة على إلقاء الضوء على عمليات سريعة، 3D في أنظمة الهاتف الخلوي. على الرغم من أن أساليب RT-3D-SPT مختلفة قدمت في السنوات الأخيرة، تتبع عالية السرعة 3D نزع فتيل الجسيمات في معدلات العد فوتون منخفضة لا يزال يمثل تحديا. وعلاوة على ذلك، الرايت-3D-SPT الأجهزة عادة ما تكون معقدة وصعبة التنفيذ، تحد من تطبيقها على نطاق واسع للمشاكل البيولوجية. ويعرض هذا البروتوكول نظام RT-3D-SPT المسمى 3D "دينامية فوتون التعريب تتبع" (3D-ديبلوت)، التي يمكن أن تتبع الجسيمات بسرعة انتشارية عالية (تصل إلى 20 ميكرون/ق2) أسعار العد فوتون منخفضة (وصولاً إلى 10 كيلوهرتز). يستخدم 3D-ديبلوت منحرف الكهرضوئية ثنائية الأبعاد (2D--التخلص من الذخائر المتفجرة) وعدسة الانضباطي تدرج صوتي (علامة) إلى محرك أقراص واحد وركزت الليزر المستطيل بشكل حيوي في 3D. 3D-ديبلوت جنبا إلى جنب مع خوارزمية تقدير موقف أمثل، يمكن أن تلتحم جزيئات مفردة مع تعقب عالية السرعة والدقة العالية ومسلم. نظراً للإثارة واحدة وتخطيط مسار كشف واحد، 3D-ديبلوت قوية وسهلة لإقامة. ويناقش هذا البروتوكول كيفية بناء 3D-ديبلوت خطوة بخطوة. أولاً، يتم وصف تخطيط البصرية. المقبل، هو النظام معايرة والأمثل من قبل النقطية المسح حبة فلورسنت 190 نيوتن متر مع نانوبوسيتيونير كهرضغطية. أخيرا، وللتدليل على تتبع قدرة 3D في الوقت الحقيقي، يتم تعقب الخرز الفلورسنت 110 في شمال البحر الأبيض المتوسط في المياه.

Introduction

ظهور تقنيات التصوير المتقدمة قد فتحت نافذة لمعرفة هيكل من أي وقت مضى أكثر تفصيلاً من الظواهر الخلوية، على طول الطريق وصولاً إلى المستوى الجزيئي. أساليب مثل التعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة)1،2،3، تنشيط صور التعريب مجهرية (النخيل)4،،من56،7 ومنظم الإضاءة مجهرية (SIM)8،،من910،11، وحفز الانبعاثات استنفاد مجهرية (STED)12،13، 14 قد تجاوزت الآن الحد حيود لتقديم التفاصيل لم يسبق لها مثيل في هيكل ووظيفة الخلايا الحية. ومع ذلك، كامل فهم كيف أن هذه النظم تتصرف يتطلب المعلومات الحيوية، فضلا عن المعلومات الهيكلية. القرار فائقة الأساليب المذكورة أعلاه تشمل مفاضلة بين القرار المكانية والأزمنة، يحد من الدقة الزمنية التي يمكن بحث العمليات الحيوية. أسلوب الذي يوفر عالية الدقة المكانية والزمانية القرار هو RT-3D-SPT15،،من1617،،من1819،20، 21،23،22،،من2426،25،27،،من2829. هنا، يمكننا التمييز بين SPT 3D التقليدية30 و RT-3D-SPT. التقليدية يتطلب 3D SPT ببساطة سلسلة زمنية من بيانات الصورة ثلاثية الأبعاد (والتي يمكن الحصول عليها أما باستخدام مجهر [كنفوكل] أو مجهر ابيفلوريسسينسي ونظرا للتكوين الصحيح). في 3D التقليدية-SPT، تتحدد إحداثيات الجسيمات بعد جمع البيانات بتحديد الجسيمات في كل مكدس الصورة وسلسلة المواقع الموجودة في وحدات التخزين المتعاقبة لإنشاء مسار. لهذه الأساليب، يتحدد القرار الزمانية في نهاية المطاف بمعدل التصوير الحجمي. لمجاهر [كنفوكل]، وهذا بسهولة بمقياس ثانية لعشرات ثواني. لأساليب ابيفلوريسسينسي، حيث يتم معالجته المسار البصري حيث أنه يمكن استخراج معلومات الموقع المحوري، يقتصر القرار الزماني وقت التعرض أو قراءات الكاميرا. تقتصر هذه الأساليب ابيفلوريسسينت في النطاق الذي يمكن جمع المعلومات المحوري، وعلى الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا في مرحلة الطائرة فورييه أقنعة التصميم والبصريات التكيفية وتوسع هذه النطاقات إلى 10 ميكرون أو أكثر31،32 , 33 , 34.

وفي المقابل، RT-3D-SPT لا تعتمد على الحصول عليها كومة صور الثلاثية الأبعاد والجسيمات بعد وقوعها. بدلاً من ذلك، يتم استخراج معلومات الموقع في الوقت الحقيقي عن طريق الكشف عن نقطة واحدة وردود الفعل يطبق على فعالية "قفل" الجسيمات في تنسيق حجم العدسة الهدف عن طريق استخدام مرحلة كهرضغطية العالية السرعة. يسمح هذا القياس المستمر للموقف الجسيمات محدودة فقط التي يمكن جمعها كم عدد الفوتونات. وعلاوة على ذلك، تتيح هذه الطريقة الاستجواب الطيفية للجسيمات وهي تنتقل عبر مسافات بعيدة. RT-3D-SPT سارية المفعول قوي يعمل أقرب إلى فخ خالية من القوة ضوئية لكائنات النانو، حيث الجسيمات باستمرار سبر ويقاس في الوقت الحقيقي دون الحاجة إلى صلاحيات كبيرة الليزر أو البصرية. نظراً لأن RT-3D-SPT يوفر وسيلة للاستجواب مستمر من كائنات سريعة انتشارية (تصل إلى 20 ميكرون2/ق)25،29 في الأبعاد الثلاثة في فوتون المنخفضة عد أسعار20،29، 35، ينبغي أن يوفر نافذة في العمليات البيولوجية سريعة أو عابرة مثل نقل البضائع داخل الخلايا ويجند مستقبلات ملزم وديناميات فيريونس واحد خارج الخلية. ومع ذلك، إلى هذه النقطة، تطبيق RT-3D-SPT اقتصر على حفنة الجماعات التي تعمل على النهوض بهذه التكنولوجيا.

جدار واحد من تعقيد التخطيط البصرية المطلوبة بأساليب RT-3D-SPT، التي تتنوع. لمعظم طرق التغذية المرتدة البصرية يتم توفيرها من قبل مرحلة كهرضغطية. كالجسيمات يجعل الحركات الصغيرة في X، Y، أو Z، قراءات من نقطة واحدة للكشف عن تحويلها إلى وظائف خطأ وتغذية في عالي السرعة إلى نانوبوسيتيونير كهرضغطية، الذي بدوره ينتقل العينة للتصدي للحركة للجسيمات، وفعالية قفل عليه في مكان بالنسبة للعدسة الهدف. لقياس الحركات الموضعية الصغيرة في X، Y، و Z، أما متعددة (4 أو 5 اعتماداً على التنفيذ) للكشف عن15،،من1821 أو متعددة الإثارة البقع (2-4، الأقل من التي يمكن تطبيقها إذا يتم استخدام قفل في مكبر للصوت لاستخراج X وموقف Y باستخدام التناوب ليزر بقعة) تطبق25،28 . التداخل بين هذه البقع الكشف والانبعاث متعددة تجعل النظم صعوبة في محاذاة والحفاظ على.

هنا، نحن نقدم أسلوب عالي السرعة المستهدفة غير الساحلية و 3D-SPT مع تصميم بصرية مبسط يسمى 3D-ديبلوت29. يستخدم 3D-ديبلوت 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة وعلامة عدسة36،،من3738 للتحرك بشكل حيوي بقعة ليزر مركزة من خلال حجم التنسيق الموضوعي بمعدل مرتفع (50 كيلوهرتز XY، 70 كيلو هرتز Z). الجمع بين موضع تركيز الليزر ووقت وصول فوتون تمكن موقف 3D للجسيمات سرعة الحصول عليها حتى في معدلات العد فوتون منخفضة. 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة محركات تركيز الليزر في فارس جولة نمط39 مع حجم مربع من 1 x 1 ميكرومتر في الطائرة X-Y وعدسة العلامة ينتقل تركيز الليزر في اتجاه محوري مع مجموعة من 2-4 ميكرون. يتم الحصول على موقف 3D الجسيمات مع موضع أمثل تقدير خوارزمية29،40 في 3D. وتجري السيطرة 3D تتحرك بشكل حيوي ليزر بقعة، فوتون عد من الانهيار الضوئي (APD) وحساب موضع الجسيمات في الوقت الحقيقي، والمرحلة كهرضغطية التغذية المرتدة، وتسجيل البيانات في صفيف حقل بوابة القابلة لبرمجة (FPGA).في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية بناء مجهر 3D-ديبلوت خطوة بخطوة، بما في ذلك محاذاة البصري، المعايرة مع جزيئات ثابتة، وأخيراً مجانية تتبع الجسيمات. كدليل، تم تعقبها الخرز الفلورسنت 110 في شمال البحر الأبيض المتوسط بشكل مستمر في الماء لمدة دقيقة في كل مرة.

الأسلوب الموصوفة هنا اختيار مثالي لأي تطبيق حيث أنه المطلوب لترصد باستمرار تحقيق فلورسنت تتحرك بسرعة في ضوء المستويات المنخفضة، بما في ذلك الفيروسات والجسيمات النانوية وحويصلات مثل اندوسوميس. وعلى النقيض من الأساليب السابقة، هناك فقط الإثارة واحد ومسار كشف واحد، جعل المحاذاة والصيانة مباشرة. وعلاوة على ذلك، يتيح مجال كبير في الكشف عن هذا المجهر لالتقاط بسهولة بسرعة نزع فتيل الجسيمات، بينما القدرة على تتبع المستويات إشارة منخفضة (وصولاً إلى 10 كيلوهرتز) يجعل هذا الأسلوب المثالي لتطبيقات الإضاءة المنخفضة29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد التخطيط والتنسيق

  1. التثبيت و collimation من الإثارة التعقب بالليزر
    1. إلصاق الليزر للجدول البصرية باستخدام جبل الصنع. الجبل لوحة ألومنيوم بسيطة مع تصاعد الثقوب للرأس الليزر والجدول البصرية. ينبغي إيلاء جبل معدنية للاستقرار وتبديد الحرارة بشدة الليزر. لهذا العمل، واستخدام ليزر حالة صلبة 488 نانومتر للإضاءة (الشكل 1)، على الرغم من أن يمكن تحديد الطول الموجي تتناسب مع فلوروفوري خاصة أو تجربة. عامل حاسم هو أن الطول الموجي الليزر تناسب نطاق العامل 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة، التي تتحدد أساسا بلوحة موجه بين انحراف اثنين (الشكل 1: W2). يمكن أن تثير 488 نانومتر الليزر فعالية الأخضر أو الأصفر فلوري البروتين (التجارة والنقل/يفب)، التي هي العلامات الفلورية الشائعة في تجارب الخلايا الحية.
    2. ضبط ارتفاع شعاع الليزر والاتجاه باستخدام زوج من المرايا كهرونافذية (الشكل 1: M). تأكد من شعاع الليزر موازية للجدول البصرية وضبط ذلك بارتفاع مناسب.
      ملاحظة: الارتفاع ينبغي اختيارها بالاعتماد على منصة المجهر. ينبغي الإبقاء على هذا الارتفاع لجميع المرايا اللاحقة المستخدمة في هذا البروتوكول، على الرغم من أنه لم يتم ذكر صراحة.
    3. كوليماتي الشعاع مع زوج من العدسات (الشكل 1: L1 و L2). ينبغي أن تكون أطوال العدسات اختيرت بعناية لتجنب بقعة ليزر يتم قص بواسطة فتحه 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة. ويتضح القطع بحدوث تغيير في شكل شعاع الليزر بعد مرورها 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة. نوعية collimation هنا مهم جداً لأنه سيتم تفصيل الانحرافات بالعدسات اللاحقة، وأي تباين سوف يتدهور أداء انحراف 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة. ومن الناحية المثالية، كوليماتي الشعاع بتركيز شعاع بنقطة على الأقل 20 متر.
  2. مكان ثقب (الشكل 1: الأس الهيدروجيني) من الحجم المناسب في تركيز العدسة collimation الأول (الشكل 1: L1).
    1. اختر ثقب حجم مناسب. ويمكن اختيار حجم الثقب استناداً إلى الحساب التالي:
      Equation 1
      حيث λ هو الطول الموجي لليزر، f هو البعد البؤري للعدسة الأولى، وهو د قطرها شعاع الإدخال.
    2. جبل الثقب في مرحلة ترجمة 3D حتى أنه يمكن وضع التحديد في تركيز العدسة collimation الأولى.
    3. ضبط موضع الثقب. ضع عداد طاقة ليزر بعد الثقب وضبط موضع الثقب في XYZ لتعظيم قراءات عداد الطاقة. إذا لوحظ عصابة حيود، منعه مع قزحية المعروضة في 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة.
  3. تثبيت المستقطب Glan-تومسون
    1. وضع المستقطب Glan-تومسون (الشكل 1: سباق الجائزة الكبرى) بعد العدسة collimation الثانية (الشكل 1: L2) لتنظيف استقطاب شعاع الليزر. قم بتدوير المستقطب للبحث عن الإرسال القصوى مع مقياس الطاقة.
  4. تركيب اودس
    1. استخدام اودس 2 (الشكل 1: EOD1 & EOD2) لتشتيت الليزر في الاتجاهين X و Y. قم بتكبير الإرسال الليزر بضبط ياو والملعب، وارتفاع كل التخلص من الذخائر المتفجرة.
    2. قم بمحاذاة اودس اثنين فيما يتعلق ببعضها البعض باستخدام علامة المحاذاة توفيرها من قبل الشركة المصنعة على جانب كل منحرف.
    3. تطبيق نمط اختبار إلى وحدة تحكم 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة لفحص إخراج التخلص من الذخائر المتفجرة. هذا يمكن أن يكون أما جولة الفارس (الشكل 2) عبر FPGA الموصوفة أدناه أو موجه جيبية بسيطة يوفرها مولد دالة. الحصول على أفضل أداء، الانحراف بكل منحرف بشكل مواز لاتجاه X أو Y نانوبوسيتيونير بيزو. هذا الاتجاه تمليه الاتجاه الزاوي لانحراف حول محور انتقال العدوى. لتدوير اتجاه انحراف دون تحريك في 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة، ضع منشور حمامة بعد 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة محاذاة محاور انحراف للمحاور نانوبوسيتيونير بيزو.
  5. تركيب لوحة نصف الموجه
    1. ضع لوحة نصف الموجه (الشكل 1: W1) بين المستقطب Glan-تومسون (الشكل 1: سباق الجائزة الكبرى) وشعاع 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة محاذاة الليزر واردة الاستقطاب مع محاور انحراف 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة. ضع عدسة طويلة المحورية (300 ملم) بعد 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة ومكان كاميرا سكموس في تركيز الليزر. وبعد ذلك، قم بتشغيل في 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة لتوليد جولة الفارس المبينة أدناه (الشكل 2). قم بتدوير اللوحة نصف الموجه حتى يحتفل توزيع ليزر مربعة بالتساوي على الكاميرا.
  6. تثبيت شعاع أنفاق عدسة زوج وزوج عدسة التتابع
    1. وضع زوج من العدسات (الشكل 1: L3 و L4) بعد 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة لتوسيع شعاع لملء الفتحة الخلفية للعدسة الهدف (الشكل 1: را) وزوج آخر من العدسات (الشكل 1: L5 و L6) إلى ترحيل المستوى البؤري لهدف المجهر. تأكد من ترك مساحة كافية بين هذه اثنين من الأزواج من العدسات كما سيتم تثبيت العدسة العلامة بينهما في خطوة لاحقة.
  7. تثبيت عامل تصفية مزدوج اللون، والخائن شعاع 10/90، تركز العدسة، APD، الهدف العدسة، وتصفية الانبعاثات الأسفار لإكمال المسار الكشف.
    1. تثبيت عامل التصفية مزدوج اللون (الشكل 1: DC) ليعكس الليزر نحو الهدف العدسة. قم بمحاذاة الليزر للذهاب مباشرة من خلال مركز العدسة الهدف باستخدام قزحيات اثنين في أعلى وأسفل من أنبوب عدسة طويلة.
    2. تثبيت تقسيم شعاع 10/90 (الشكل 1: بكالوريوس) التي ينعكس فيها 10% ضوء للتصوير كاميرا سكموس (الموصوفة أدناه) و 90% من يمر بالرابطة لتتبع.
    3. محاذاة المحيط الهادئ. وتركز الليزر على ساترة بالعدسة الهدف. استخدام الانعكاس من ساترة لمحاذاة العناصر جميع المتلقين للمعلومات بوضع ساترة في التركيز الموضوعي والتحقق من كثافة قراءات APD. بعد التقسيم شعاع، تثبيت APD تركز العدسة (الشكل 1: L7) متبوعاً الرابطة في مرحلة ترجمة 3D. ضع العدسة مثل انعكاس الليزر من الهدف يمر عبر مركز العدسة.
يمكن أن يكون الأمثل موقف APD بضبط موضع ثلاثي الأبعاد إلى أقصى حد الكثافة من انعكاس الليزر على ساترة. ويتمثل موقف APD في الموضع الأمثل عند تحرك من موقف الكاشف في أي اتجاه انخفاض الكثافة.
  • تثبيت عامل تصفية انبعاثات fluorescence الفلترات (الشكل 1: و) قبل التقسيم شعاع لإزالة الضوء المنعكس ومتناثرة.
  • تركيب العدسة العلامة
    1. ضع علامة العدسة بين أزواج اثنين من العدسات (بين الرقم 1: L4 و L5) كما ذكر قبل وهو مبين في الشكل 1. ضبط ياو، الملعب، والارتفاع، والموضع الأفقي مثل الشعاع يمر عمودياً من خلال عدسة مركز الوسم.

    • 2-نموذج إعداد.

    1. إعداد الجسيمات الثابتة
      1. 190 نانومتر الخرز الفلورية إلى تمييع ~8 5 × 10 حبات/مل في برنامج تلفزيوني. إضافة 400 ميليلتر الخرز الحل إلى ساترة وجبل على حامل عينة المرحلة كهرضغطية (حجم الخرز سيتوقف على صاحب العينة؛ قطر الدائرة حامل العينة المستخدمة هنا 18 ملم). يتسبب برنامج تلفزيوني الخرز المستخدمة هنا، الجسيمات بإيداع ساترة.
    2. إعداد الجسيمات تتحرك مجاناً
      1. تمييع 110 الخرز الفلورسنت نانومتر إلى ~8 5 × 10 حبات/مل مع المياه دي. إضافة 400 ميليلتر الخرز محلول على ساترة وجبل على صاحب العينة لمرحلة كهرضغطية.

    3-تحسين تتبع المعلمات

    1. مسح النقطية الثابتة الجسيمات
      1. وضع نموذج جسيمات ثابتة في المجهر.
      2. قم بتشغيل الليزر وتحكم ميكروبوسيتيونير وتحكم نانوبوسيتيونير بيزو، علامة عدسة وحدة تحكم وتحكم التخلص من الذخائر المتفجرة. علما أن الأمر ليس حاسما. قم بتشغيل نانوبوسيتيونير بيزو في حلقة مغلقة.
      3. خطوط المسح مسح العينة باستخدام مسح برمجيات برنامج مخصص (S3 الرقم، البرمجيات المتاحة عند الطلب من المؤلفين)، الذي يدفع في 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة في جولة فارس (الشكل 2)، يجمع التهم الموجهة إليه من APD، محركات الأقراص في بيزو XYZ نانوبوسيتيونير، ويقوم بعملية حسابية موقف (S2 الشكل). حجم الخطوة هو 40 نانومتر ونطاق المسح هو 2 ميكرومتر.
        1. وضع ساترة في التركيز الهدف، إزالة عامل التصفية الانبعاثات الأسفار واستخدام انعكاس الليزر من ساترة لزيادة كثافة إشارة كدالة لموقف زي ميكروبوسيتيونير. بعد وضع العينة في المستوى البؤري، ضع مرة أخرى تصفية الانبعاثات الأسفار.
        2. فتح برنامج المسح. تعيين نطاق المسح وحجم الخطوة بكتابة الرقم في 'ابدأ'، 'الانتهاء' و 'خطوة'. أولاً تعيين نطاق المسح الكبيرة وحجم خطوة لتحديد مكان جسيم (مثلاً، 10 × 10 ميكرون النطاق مع حجم الخطوة شمال البحر الأبيض المتوسط 200). بعد العثور الجسيمات، تقليص نطاق المسح وتقليل حجم الخطوة (مثلاً، 2 × 2 ميكرومتر النطاق مع حجم الخطوة nm 100). انقر فوق الزر 'مسح' لإجراء فحص نقطية ثلاثية الأبعاد لإيجاد تركيز الفلورسنت.
    2. إعدادات العدسة العلامة (انظر الشكل 3)
      1. انقر فوق برنامج السيطرة عدسة العلامة. انقر فوق 'اتصال'، 'السلطة في' تسلسلياً.
      2. لتغيير في مرحلة الإخراج من إشارات الزناد، من الضروري تغيير وضع الزناد الإخراج. أولاً قم بتغيير الوضع من 'RGB' إلى 'مولتيبلاني' وثم تغييره مرة أخرى. الآن يمكن أن تكون المرحلة تغيير (الشكل 3b).
      3. تعيين مرحلة الإخراج لتكون 270 ° 0 ° و 90 °. بينما يمكن استخدام أي من المراحل الثلاث التي تغطي مساحة المرحلة، تم العثور على هؤلاء الثلاثة للعمل كذلك تجريبية (الشكل 3 ج).
      4. حدد الإعداد التردد هرتز 68,500.
      5. للبحث عن الترددات الأمثل من الضروري غالباً تغيير نطاق البحث التردد. انقر فوق 'خيارات متقدمة'، 'الإعداد'. تغيير ' ماكس. Freq(Hz) ' العمود 0 من 70,000 هرتز هرتز 71,500. ويمكن تعديل هذا لنطاق الترددات أيا كان من المناسب. انقر فوق 'حفظ المعايرة'، 'خروج المعايرة' (3d الشكل).
      6. لإجراء المعايرة الجديدة فعالة، التبديل الرنين إلى تردد آخر (على سبيل المثال، 189,150 هرتز) وتحولت بعد ذلك إلى الإعداد التردد هرتز 68,500 (رقم 3e).
      7. تغيير السعة تدريجيا إلى 35%. انقر فوق 'لوك الرنين'. بعد التواتر مؤمن، انقر فوق '"إلغاء تأمين الرنين"' (رقم 3e). عدسة العلامة جاهز للاستخدام الآن.
      8. معايرة، وتغيير المعلمات التي يتم استخدامها في التقدير جعل الموضع المقدر مساو للموقف الحقيقي، كما هو مبين في الشكل 4e، واو إدخال نطاق المسح x، y، و z وثم انقر فوق 'مسح' زر لمسح العينة في XYZ للانتقال الجسيمات من خلال بقعة الليزر تتحرك. موقف الجسيمات كما أنه يتم مسحها ضوئياً عن طريق تركيز الليزر يجب أن يتفق مع موقف الجسيمات التقديرية تحددها الحلقة تقدير الموقف (S1 الشكل). العلاقة بين الموضع المقدر والموقف الحقيقي (الشكل 4 د) يمكن أن تستخلص من الصور الموضع المقدر (4f الشكل). إذا لم تتفق ومواقف، قم بضبط القيم لليزر الموضع (جك) المستخدمة في تقدير الموقف التكرار الحلقي (S1 الشكل).
      9. قم بمحاذاة العلامة العدسة
        1. عند إيقاف تشغيل وحدة تحكم عدسة الوسم، النقطية تفحص الصور الجسيمات (الموصوفة أدناه) المتخذة قبل تثبيت العدسة العلامة وبعد تثبيت علامة العدسة يجب أن تبدو متطابقة. بعد ذلك، تنفيذ مكدس الجسيمات الفلورية Z المسح بتحريك الهدف مع نانوبوسيتيونير z لضبط الموضع وزاوية العدسة العلامة (الشكل 4). ضبط موضع العدسة العلامة حتى يكون هناك لا الانجراف في الصور الجسيمات في الطائرة XY على طول اتجاه Z، الذي يتحقق عندما يكون هناك لا تغيير في موقف س وص للجسيمات كدالة للموقف Z (الشكل 4 د). نظام تتبع جاهز للاستخدام بعد المحاذاة للعدسة العلامة.
    3. تركيب كاميرا سكموس لرصد الجسيمات
      1. قم بتثبيت كاميرا سكموس لتصور الجسيمات في حين أنهم يجري تعقب. تثبيت في سكموس فقط بعد أن تم تثبيتها جميع مكونات نظام التتبع والأمثل.
    تحميل نموذج جسيمات فلورية ثابتة على المجهر وقم بتشغيل برنامج التعقب لقفل الجسيمات واحد في وحدة التنسيق الموضوعي. ثم قم بتثبيت العدسة البعد البؤري 100 مم (الشكل 1: L8) وسكموس. ضبط موضع سكموس حيث أن صورة الجسيمات يتركز على الفور أصغر وأذكى.

    4. في الوقت الحقيقي تتبع 3D بحرية نشر جسيمات نانوية

    1. وضعت 110 نيوتن متر حرة تتحرك الجسيمات العينة في المجهر.
    2. قم بتشغيل الليزر والصغرى-ميضعه وحدة تحكم وتحكم نانوبوسيتيونير بيزو، علامة عدسة وحدة تحكم وتحكم التخلص من الذخائر المتفجرة. قم بتشغيل نانوبوسيتيونير بيزو في حلقة مفتوحة. تعيين البرامج عدسة العلامة وفقا للخطوة 3، 2.
    3. فتح وتشغيل برامج التتبع (متاح عند الطلب من المؤلفين). تعيين الموضع تقدير المعلمات إلى قيمها الأمثل، الذي تم العثور عليه في الباب 3.
    4. وضع ساترة في التركيز الهدف، إزالة عامل التصفية الانبعاثات الأسفار واستخدام انعكاس الليزر من ساترة لزيادة كثافة إشارة كدالة لموقف زي ميكروبوسيتيونير. بعد العثور ساترة، زيادة تركيز موقف ميكرومتر 15 تركيز الليزر بعيداً ساترة وإلى الحل. مكان العودة تصفية الانبعاثات الأسفار.
    5. تعيين ثوابت تحكم لا يتجزأ. يمكن تعيين بثوابت عناصر التحكم لا يتجزأ بدءاً من قيمة منخفضة وزيادة ببطء حتى يمكن رؤية التذبذبات في قراءات الموقف الجسيمات. عندما يلاحظ ذبذبات، تعيين بثوابت عناصر التحكم لا يتجزأ إلى 80% القيمة التي تسبب الذبذبات. القيم النموذجية ستكون حوالي 0.012 لتخطيط س ص 'مكاسب لا يتجزأ' و 0.004 لض 'مكسب لا يتجزأ'.
    6. تعيين عتبات تتبع في 'المسار عتبة' و 'المسار الحد الأدنى' وبدء التجربة التعقب بواسطة النقر فوق 'بحث' و 'المسار التلقائي'. يتم تعيين الحد الأدنى لإنهاء تتبع أعلى قليلاً من مستوى الخلفية وعتبة أحداث التتبع أعلى بحوالي مرتين من الخلفية. هنا، هو الحد الأدنى لتحريك تتبع 3 كيلو هرتز وهو الحد الأدنى لإنهاء المسار 1.5 كيلو هرتز.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    الجسيمات الثابتة المسح الضوئي (الشكل 4) ونشرها بحرية 110 نانومتر الفلورسنت الجسيمات تتبع (الشكل 5) أجريت في أعقاب البروتوكول أعلاه. وأجرى المسح الجسيمات بتحريك الفوتونات نانوبوسيتيونير وبن كهرضغطية بينما في نفس الوقت حساب الجسيمات يقدر الموقف عند كل نقطة في المسح الضوئي. مسح الصورة يظهر مربع من كثافة حتى (الشكل 4a) والمواقف المقدرة التي تظهر علاقة خطية مع الموقف الحقيقي للجسيمات أكثر من 1 × 1 × 2 ميكرومتر مجموعة في x، y، و z الاتجاه (الشكل 4 باء–و).

    إظهار تتبع في الوقت الحقيقي، تتبعها 3D-ديبلوت (الشكل 5 أ، ب) 110 الجسيمات الفلورية شمال البحر الأبيض المتوسط في المياه. ويبين التحليل التشرد (MSD) متوسط مربع سلوك خطي نموذجية مميزة من البراونية (الشكل 5 ج). أظهر تحليل MSD لمسارات 30 قطره هيدرودينامية يعني 110 شمال البحر الأبيض المتوسط، في اتفاق جيد مع مواصفات الشركات المصنعة للحجم جسيمات نانوية الفلورسنت يجري تعقب (الشكل 5 د). وباﻹضافة إلى ذلك، 1 فيلم يبين قراءات نانوبوسيتيونير كهرضغطية في الوقت الحقيقي ومزامنة الصور سكموس لمسار طويل 2 دقيقة من الجسيمات الفلورية نانومتر 110 نشرها بحرية.

    بالإضافة إلى كونه قادراً على تتبع مع سرعة عالية، يمكن أن تكون مترجمة جسيمات تتحرك بطيئة بدقة عالية. الشكل 6a - د يظهر تطبيق نظام 3D-ديبلوت للجسيمات الثابتة استخدام نفس المعلمات الملاحظات المستخدمة للسرعة العالية تتبع، والتي تبين بدقة من 17.6 و 26.4 53.4 نانومتر في X، Y، و Z، بمعدل العد فوتون من 10 على التوالي5. 6e الشكل - ح يبين الدقة تحت مراقبة ردود الفعل انخفض بنسبة 10، فعالية مبادلة السرعة للدقة ونستعرض بدقة 6.5 و 8.3 و 10.5 نيوتن متر في X، Y و Z، على التوالي.

    Figure 1
    رقم 1. التخطيطي لتتبع نظام 3D- 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة (EOD1 & EOD2) وعدسة الوسم (العلامة) يصرف الليزر على طول التوجيهات XY و Z، على التوالي. APD (APD) يستخدم لتجميع الفوتونات الفلورية، التي يتم إرسالها إلى FPGA (FPGA). FPGA يستخدم خوارزمية حساب الموقف، عد فوتون، التحكم 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة، فضلا عن مراقبة وقراءات من نانوبوسيتيونير كهرضغطية (نسكسي و NZz). المكونات الأخرى المسماة في الشكل: مرايا (م)؛ عدسات (L #)؛ الثقب (PH)؛ المستقطب Glan-تومسون (GP)؛ لوحة نصف الموجه (W1)؛ فلتر مزدوج اللون (DC)؛ عدسة الهدف (را، نا X 100 = 1.49)؛ الأسفار الانبعاثات تصفية (F)؛ شعاع الخائن (درجة البكالوريوس)؛ س وص ميكروبوسيتيونير المرحلة (مسكسي)؛ Z مرحلة ميكروبوسيتيونير (MSz). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 2
    رقم 2. وتنسق للجولة فارس في 3D--ديبلوت- ينبغي مواءمة والمحور 1 2 على طول المحور X أو Y بالمحاذاة الصحيحة من 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 3
    الشكل 3. إعدادات البرامج عدسة الوسم. راجع المقطع 4.2 علامة إعدادات العدسة للحصول على مزيد من المعلومات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 4
    الشكل 4. تقدير المسح الضوئي وموقف الجسيمات. () مسح الصورة من 190 نانومتر الفلورسنت الخرز مع 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة القيادة الليزر في 1 × 1 ميكرومتر ساحة نقش جولة فارس. يتم الرمز إلى كثافة الأسفار حسب اللون. الوحدة: كيلو هرتز. (ب) تقدير سك، موقف للجسيمات بالنسبة للمركز 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة المسح الضوئي في ميكرومتر. اللون في ب وج ود يدل على الموضع المقدر. الوحدة:-ميكرومتر (ج) تقدير صك في ميكرومتر. (د) تقدير ضك، الجسيمات موقف بالنسبة لمركز محوري للعدسة العلامة المسح الضوئي في ميكرومتر. موقف (ﻫ) المقدرة الجسيمات موقف صك كدالة للمرحلة المتوسط عبر شبكة كاملة من (ج). علما أن موقف الجسيمات المقدرة المكتسبة من خوارزمية تقدير الموقف (صك) تتفق مع الموقف الحقيقي. موقف (f) المقدرة الجسيمات موقف zk كدالة للمرحلة المتوسط عبر شبكة كاملة من (د). الموضع المقدر يبين وجود علاقة خطية مع الموقف الحقيقي للجسيمات مدى 1 × 1 × 2 ميكرومتر في اتجاه X و Y و Z. علما أن موقف الجسيمات المقدرة المكتسبة من خوارزمية تقدير الموقف (zk) تتفق مع الموقف الحقيقي. الموضع المقدر يبين وجود علاقة خطية مع الموقف الحقيقي للجسيمات أكثر من 1 × 1 × 2 ميكرومتر مجموعة في X، Y، و Z الاتجاه. مقياس اللون الأبيض أشرطة في (–ج) تمثل 500 نانومتر وشريط أسود مقياس (د) يمثل 2 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 5
    الشكل 5.تتبع 110 الجسيمات الفلورية شمال البحر الأبيض المتوسط في المياه مع 3D-ديبلوت. () مسار 3D نشرها بحرية 110 نانومتر الفلورسنت نانوحبيبات في المياه. (ب) شدة الفلورسنت كدالة للزمن للمسار في (). (ج) MSD للمسار في (). الخط الأزرق هو MSD يقاس بينما الخط الأحمر المنقط أفضل خط من الانحدار الخطي. (د) MSD تحليل مسارات 30، عرض متوسط قطرها هيدرودينامية 110 شمال البحر الأبيض المتوسط، في اتفاق جيد مع الحجم جسيمات نانوية الفلورسنت التي يتم تعقبها. حسبت قطر الجسيمات باستخدام علاقة ستوكس-اينشتاين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 6
    الشكل 6. الدقة من الجسيمات الثابتة تتبع- يتم تعقب الجسيمات الثابتة () A بواسطة 3D-ديبلوت بمعدلات مختلفة العد. الدقة هو nm (ب) 17.6 في العاشر، نانومتر (ج) 26.4 في Y ونانومتر (د) 53.4 في ض بمعدل انبعاثات من 100 كيلو هرتز. ويمكن تخفيض ثابت (ه) عند التدقيق أبطأ العمليات، مراقبة التغذية المرتدة (كأنا) بمقدار 10 زيادة الدقة. تحت مراقبة انخفاض ردود الفعل هذه، هو الدقة nm (و) 6.5 في العاشر، nm (ز) 8.3 في Y و nm (ح) 10.5 في ض بمعدل انبعاثات من 100 كيلو هرتز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    الشكل S1. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

    الشكل S2. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

    الشكل S3. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

    معلومات تكميلية. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    على الرغم من أن العديد من أصناف الجسيمات واحدة 3D تتبع أساليب ظهرت في السنوات الأخيرة، تتبع في الوقت الحقيقي قوية لنشر عالية السرعة 3D أسعار العد فوتون منخفضة مع إعداد بسيطة لا تزال تشكل تحديا، مما يحد من تطبيقه على الأهمية البيولوجية مشاكل. وصف الأسلوب 3D-ديبلوت في هذه عناوين بروتوكول هذه التحديات طرق عدة. أولاً، يتم تبسيط مسارات الإثارة وكشف إلى حد كبير بالمقارنة مع تطبيقات أخرى جعل المحاذاة بسيطة وقوية. وثانيا، الليزر تتحرك بقعة وموضع تقدير خوارزمية تقديم تقديرات موقف دقيق لدائرة التغذية الاسترجاعية، مما يجعل ردود الفعل أكثر استقرارا. ثالثا، يتيح الكشف عن فعالية كبيرة النطاق (1 × 1 × 4 ميكرومتر) من بقعة الليزر تتحرك بشكل حيوي لتتبع جسيمات تتحرك بسرعة. لمعرفة لماذا هذا المجال كشف كبير الحرجة، من المهم النظر في وقت استجابة جوهرية نانوبوسيتيونير كهرضغطية. مراحل عالية السرعة كهرضغطية الأصداء يقارب 1 كيلو هرتز، قصر زمن الاستجابة ليكون بناء على أمر من السيدة 1 في 1 مللي ثانية، 100 نانومتر نانوحبيبات مع معامل نشر 4/ق2ميكرومتر، وسيتم نشرها في المتوسط 90 نيوتن متر من مركز الحيود-لي الكشف عن ميتيد وحدة التخزين. هذا هو تشريد متوسط فقط وسوف يحمل الحركة عشوائية حقاً خطوات أكبر بكثير من ذلك، مما يؤدي إلى الجسيمات ترك حجم التنسيق وإنهاء المسار الحالي. الحالة أسوأ لجسيمات أصغر، حيث الخطوات انتشارية حرارية متزايدة تؤدي إلى فقدان التعقب. مجال الكشف عن فعالية كبيرة تسمح لنظام التتبع للتغلب على تأخر المرحلة كهرضغطية الجوهرية والتعافي من القفزات انتشارية كبيرة في موقف الجسيمات، زيادة متانة الشاملة لآلية تتبع. وأخيراً، منطقة المسح كبيرة يسمح للنظام بسهولة التقاط جزيئات جديدة، مما يتيح لمسارات متتالية الحصول على سرعة وتجميع مجموعات البيانات الكبيرة.

    المستخدم يجب أن نضع في اعتبارنا أن هناك بعض الخطوات الحاسمة. أولاً، أن المحاذاة في 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة وعدسة العلامة الحاسمة. على حد سواء يجب أن تكون محاذاة جيدا للحصول على الدقة المثلى. ثانيا، يجب أن تكون المعلمات التي يتم استخدامها في تقدير الموقف في الجسيمات الثابتة مسح خطوة مدروسة جيدا (انظر الشكل 4). يجب أن تطابق موقف الجسيمات تقدر موقف الجسيمات المقابلة لمركز نطاق المسح الليزر. أخيرا، ينبغي ضبطها الثوابت لا يتجزأ ردود الفعل (كأنا) بعناية، بدءاً بقيمة صغيرة ثم التعلية حتى يلاحظ ذبذبات، ثم تراجع إلى حوالي 80 في المائة من تلك القيمة.

    وهناك بعض المحاذير حول 3D-ديبلوت أن نأخذ في الاعتبار استناداً إلى التطبيق المطلوب. بينما تم تصميم تقدير الموقف الأمثل للاستخدام مع البراونية، وأيضا مناسب تماما نحو الاتجاه الحركة. يمكن تطبيق الخوارزمية مباشرة إلى أي نوع من الحركة نظراً لأنها فقط الغموض الموقف الذي يفترض أن يكون الضبابي، ليس موضع الجسيمات الحقيقية. في الحالات حيث من المتوقع استمرار الحركة الخطية، مدة إضافية يمكن أن تضاف إلى فترة التنبؤ في خوارزمية تقدير الموقف (انظر 3 المعادلة في المعلومات التكميلية).

    اختيار المعلمات 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة والعلامة ينبغي النظر بعناية عند إعداد 3D-ديبلوت. أهمية خاصة هو بن الوقت المستخدم لجولة فارس تفحص بواسطة 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة. في سيناريو مثالي, سوف مزامنة الجولة فارس إلى فترة للعدسة العلامة لضمان كفاءة أخذ العينات. بيد أنها حاسمة بالنسبة للنظر في وقت الاستجابة 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة الخطوة التغيرات في الجهد. للوحدة المستخدمة هنا، هناك وقت استجابة المايكروثانيه 2-3 بعد تطبيق التيار الكهربائي قبل الوصول إلى المكان المطلوب. وهذا الوقت بن المايكروثانيه 20، حوالي 10-15% الوقت جمع. تقليل الوقت ذلك مطابقاً لفترة عدسة العلامة ~ المايكروثانيه 14 يزيد الجزء من الوقت بن، وهو وقت التأخر 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة. وهذا يؤدي إلى قيم غير صحيحة موقف الليزر وموقف غير صحيح التقديرات.

    وثمة عامل آخر المجرب أن نأخذ في الاعتبار هو الأزمنة. بينما يتم جمع البيانات المعروضة هنا بمعدل بيانات 100 كيلو هرتز، يتم تعريف الأزمنة في نهاية المطاف في نهاية المطاف التي تستخدم البيانات لقياس الموقف. إذا استخدمت قراءات نانوبوسيتيونير كموقف الجسيمات (الشكل 6)، سيتوقف الأزمنة على قيمة ثابت لا يتجزأ من عنصر التحكم. على سبيل المثال، مرحلة الاستجابة لعنصر التحكم لا يتجزأ هو موضح في الشكل 6 أ–د، بناء على أمر من 1 مللي ثانية، بينما بالنسبة الشكل 6e–ح، أمر السيدة 10 إذا كان المطلوب أسرع من الأزمنة، ثم سيتم ربط نتيجة فوتون فوتون خوارزمية تقدير الموقف مع معدل العد فوتون. على سبيل المثال، بمعدل انبعاثات 10 كيلوهرتز غلة المايكروثانيه 100 الأزمنة ومعدل انبعاثات 100 كيلوهرتز غلة المايكروثانيه 10 الأزمنة. وبالإضافة إلى ذلك، منذ يتبع الدقة Equation 2 41من العلاقة، تقترن الدقة المكانية والزمانية. نتيجة لذلك يحدد سطوع التحقيق كلا من الدقة المكانية والزمانية.

    في هذا البروتوكول وصفناها الإعداد والتخطيط والمحاذاة من سرعة عالية في الوقت الحقيقي 3D واحد الجسيمات تتبع الأسلوب الذي يستخدم 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة وعدسة العلامة للانتقال بشكل حيوي بقعة ليزر مركزة لتحقيق تقدير الموقف الجسيمات السريعة. ثم وصفت لنا طرق تحسين إعداد والمعلمة عينة. 3D-ديبلوت يوفر وسيلة قوية وبسيطة نسبيا لقفل على التحرك السريع وانبعاث الجسيمات انتشارية الرخيصة. تخطيط بصرية بسيطة تتيح لها بسهولة إضافة إلى الجانب المنفذ لأي موقف مجهر موجود بحيث أنها قد تكون جنبا إلى جنب مع وحدات التصوير. مع أحكام هذا البروتوكول، ونأمل أن RT-3D-SPT يمكن أن تكون أكثر على نطاق واسع تنفذه المحققون أكثر معالجة سريعة والعمليات البيولوجية الأبعاد الثلاثة.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

    Acknowledgments

    وأيد هذا العمل بالمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة "المعاهد الوطنية للصحة" تحت رقم جائزة R35GM124868 وجامعة ديوك.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    2D Electro-optic Deflector  ConOptics M310A 2 required
    Power supply for EOD ConOptics 412 Converts FPGA ouput to high voltage for EOD
    TAG  Lens TAG Optics TAG 2.0 Used to deflect laser along axial direction
    XY piezoelectric nanopositioner MadCity Labs Nano-PDQ275HS Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in 
    Z piezoelectric nanoposiitoner MadCity Labs Nano-OP65HS Used to move the objective lens to follow the diffusing particle
    Micropositioner MadCity Labs MicroDrive Used to coarsely position sample and evaluate
    Objective Lens Zeiss PlanApo High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss
    sCMOS camera PCO pco.edge 4.2 Used to monitor the particle's position
    APD Excelitas SPCM-ARQH-15 Lower dark counts beneficial
    Field programmable gate array National Instruments NI-7852r
    Software National Instruments LabVIEW
    Tracking excitation laser JDSU FCD488-30
    Lens ThorLabs AC254-150-A-ML L1
    Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L2
    Pinhole ThorLabs P75S PH
    Glan-Thompson Polarizer ThorLabs GTH5-A GT
    Half-wave plate ThorLabs WPH05M-488 WP
    Lens ThorLabs AC254-75-A-ML L3
    Lens ThorLabs AC254-250-A-ML L4
    Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L5
    Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L6
    Dichroic Mirror Chroma ZT405/488/561/640rpc DC
    Fluorescence Emission Filter Chroma D535/40m F
    10/90 beamsplitter Chroma 21012 BS
    PBS Sigma D8537
    190 nm fluorescent nanoparticles Bangs laboratories FC02F/9942
    110 nm fluorescent nanoparticles Bangs laboratories FC02F/10617
    Coverslip Fisher Scientific 12-545A
    Powermeter Thorlabs PM100D
    CMOS Thorlabs DCC1545M
    Iris Thorlabs SM1D12D
    Microscope Mad City Labs RM21

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
    2. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
    3. Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
    4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
    5. Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
    6. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
    7. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat. Methods. 5 (5), 417 (2008).
    8. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044 (2011).
    9. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6 (5), 339 (2009).
    10. Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
    11. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
    12. Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED). Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).
    13. Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).
    14. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
    15. Welsher, K., Yang, H. Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles. Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).
    16. Welsher, K., Yang, H. Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy. Faraday Discuss. 184 (0), 359-379 (2015).
    17. Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking. J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).
    18. Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles. Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).
    19. Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts. Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901 (2006).
    20. Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions. ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).
    21. Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells. Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).
    22. Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. Three-dimensional tracking of individual quantum dots. Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).
    23. McHale, K., Mabuchi, H. Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope. Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).
    24. McHale, K., Mabuchi, H. Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm. J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).
    25. McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking. Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).
    26. Juette, M. F., Bewersdorf, J. Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution. Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).
    27. Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking. ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).
    28. Perillo, E. P., Liu, Y. -L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -K., Hung, M. -C., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, (2015).
    29. Hou, S., Lang, X., Welsher, K. Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot. Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).
    30. Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).
    31. Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions. Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).
    32. Lee, H. -lD., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision. Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701 (2012).
    33. Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).
    34. Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges. Optica. 4 (3), 367-373 (2017).
    35. Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606 (2017).
    36. Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing. Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).
    37. Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics. BIOMEDO. 17 (5), (2012).
    38. Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens. Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).
    39. Wang, Q., Moerner, W. E. Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap. Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).
    40. Fields, A. P., Cohen, A. E. Optimal tracking of a Brownian particle. Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).
    41. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).

    Tags

    الهندسة الحيوية، 131 قضية، واحد الجسيمات تتبع، المجهر الضوئي، الأسفار، نظم التصوير، والفخاخ الضوئية، البصريات، تتبع 3D، الجسيمات في الوقت الحقيقي تتبع
    بروتوكول لتتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات مفردة
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Hou, S., Welsher, K. A Protocol for… More

    Hou, S., Welsher, K. A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking. J. Vis. Exp. (131), e56711, doi:10.3791/56711 (2018).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter