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Bioengineering

रीयल-टाइम 3d एकल कण ट्रैकिंग के लिए एक प्रोटोकॉल

Published: January 3, 2018 doi: 10.3791/56711
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Duke University

Summary

इस प्रोटोकॉल के निर्माण और एक वास्तविक समय 3 डी एकल कण ट्रैकिंग माइक्रोस्कोप उच्च प्रसार गति और कम फोटॉन गिनती दरों पर नेनो फ्लोरोसेंट जांच पर नज़र रखने में सक्षम का विवरण ।

Abstract

रीयल-टाइम तीन-आयामी एकल कण ट्रैकिंग (RT-3d-SPT) में तेज, सेलुलर सिस्टम में 3d प्रक्रियाओं पर प्रकाश डाला जाने की क्षमता है. हालांकि विभिन्न आरटी-3d-SPT तरीकों को हाल के वर्षों में आगे रखा गया है, कम फोटॉन गणना दरों पर उच्च गति वाले 3d फैलाना कणों पर नज़र रखना एक चुनौती बनी हुई है । इसके अलावा, आरटी-3d-SPT setups आम तौर पर जटिल है और लागू करने के लिए मुश्किल है, जैविक समस्याओं के लिए अपने व्यापक आवेदन सीमित । इस प्रोटोकॉल 3 डी गतिशील फोटॉन स्थानीयकरण ट्रैकिंग (3 डी-DyPLoT), जो उच्च प्रसार गति (अप करने के लिए 20 µm2/कम फोटॉन गिनती दर पर (10 kHz करने के लिए नीचे) के साथ कणों को ट्रैक कर सकते है नामक एक RT-3d-SPT प्रणाली प्रस्तुत करता है । 3 डी-DyPLoT एक 2d इलेक्ट्रो ऑप्टिक झुकानेवाला (2d-ईओडी) और एक स्वरित्र ध्वनिक ढाल (टैग) लेंस एक एकल केंद्रित लेजर स्थान गतिशील रूप से 3 डी में ड्राइव को रोजगार । एक अनुकूलित स्थिति अनुमान एल्गोरिथ्म के साथ संयुक्त, 3 डी-DyPLoT उच्च ट्रैकिंग गति और उच्च स्थानीयकरण परिशुद्धता के साथ एकल कणों पर ताला कर सकते हैं । एकल उत्तेजना और एकल पहचान पथ लेआउट के कारण, 3d-DyPLoT मजबूत और स्थापित करने के लिए आसान है । यह प्रोटोकॉल चर्चा करता है कि 3d-DyPLoT चरण द्वारा चरण कैसे बनाएं । सबसे पहले, ऑप्टिकल लेआउट वर्णन किया गया है । अगले, प्रणाली और तुले है रैस्टर द्वारा अनुकूलित piezoelectric nanopositioner के साथ एक १९० एनएम फ्लोरोसेंट मनका स्कैनिंग । अंत में, वास्तविक समय 3 डी ट्रैकिंग क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, ११० एनएम फ्लोरोसेंट मोती पानी में नज़र रखी हैं ।

Introduction

उंनत इमेजिंग तकनीक के उद्भव के लिए एक खिड़की खोल दिया है कभी सेलुलर घटनाएं, सभी तरह के आणविक स्तर पर नीचे की संरचना अधिक विस्तृत देखें । stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) के रूप में तरीके1,2,3, फोटो-सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम)4,5,6,7 , संरचित दीप्ति माइक्रोस्कोपी (सिम)8,9,10,11, और प्रेरित उत्सर्जन घट माइक्रोस्कोपी (STED)12,13, 14 दूर विवर्तन सीमा से परे चले गए है संरचना और जीने की कोशिकाओं के समारोह में अभूतपूर्व विस्तार से उद्धार । हालांकि, कैसे इन प्रणालियों व्यवहार की पूरी समझ में गतिशील जानकारी की आवश्यकता है और साथ ही संरचनात्मक जानकारी । ऊपर सूचीबद्ध सुपर संकल्प तरीकों स्थानिक संकल्प और लौकिक संकल्प के बीच एक व्यापार बंद शामिल है, जिसके साथ गतिशील प्रक्रियाओं जांच की जा सकती है लौकिक शुद्धता सीमित । एक विधि जो दोनों उच्च स्थानिक परिशुद्धता और लौकिक संकल्प प्रदान करता है RT-3d-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. यहां, हम पारंपरिक 3d-SPT30 और RT-3d-SPT के बीच एक अंतर आकर्षित करते हैं । पारंपरिक 3d-SPT बस तीन आयामी छवि डेटा (जो या तो एक फोकल माइक्रोस्कोप या एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है की एक समय श्रृंखला की आवश्यकता है सही विंयास दिया) । पारंपरिक 3d-SPT में, कण के निर्देशांक प्रत्येक छवि स्टैक में कण का पता लगाने और एक पथ बनाने के लिए क्रमिक वॉल्यूंस में स्थानों को श्रेणीबद्ध करके डेटा संग्रह के बाद निर्धारित किए जाते हैं । इन विधियों के लिए, अंतिम लौकिक रिज़ॉल्यूशन volumetric इमेजिंग दर द्वारा निर्धारित होता है । फोकल माइक्रोस्कोप के लिए, यह सेकंड के दसियों सेकंड के पैमाने पर आसानी से होता है । epifluorescence तरीकों के लिए, जिसमें ऑप्टिकल पथ इतनी हेर है कि अक्षीय स्थान जानकारी निकाला जा सकता है, लौकिक संकल्प कैमरा जोखिम या readout समय तक सीमित है । इन epifluorescent तरीकों सीमा से अधिक है जो अक्षीय जानकारी एकत्र किया जा सकता है में सीमित हैं, हालांकि हाल ही में प्रगति का रूपान्तर विमान चरण मास्क डिजाइन और अनुकूली प्रकाशिकी इन पर्वतमाला का विस्तार है 10 µm या अधिक31,३२ , ३३ , ३४.

इसके विपरीत, RT-3d-SPT एक 3d छवि स्टैक प्राप्त करने और इस तथ्य के बाद कणों को ढूँढने पर निर्भर नहीं करता है. इसके बजाय, वास्तविक समय स्थान की जानकारी एकल बिंदु डिटेक्टरों के माध्यम से निकाला जाता है और प्रतिक्रिया प्रभावी ढंग से "बंद" एक highspeed piezoelectric मंच के उपयोग के माध्यम से उद्देश्य लेंस के फोकल मात्रा में कण को लागू किया जाता है । यह केवल कितने फोटॉनों एकत्र किया जा सकता द्वारा सीमित कण की स्थिति के सतत माप की अनुमति देता है । इसके अलावा, इस विधि के कण के वर्णक्रम पूछताछ सक्षम बनाता है के रूप में यह लंबी पर्वतमाला पर चलता है । RT-3 डी-प्रभाव में SPT नेनो वस्तुओं के लिए एक बल मुक्त ऑप्टिकल जाल के सदृश काम करता है, जिसमें कण लगातार जांच की है और बड़े लेजर शक्तियों या ऑप्टिकल बलों के लिए आवश्यकता के बिना वास्तविक समय में मापा जाता है । यह देखते हुए कि RT-3d-SPT तेजी से प्रसार करने वाली वस्तुओं की सतत पूछताछ के लिए एक साधन प्रदान करता है (अप करने के लिए 20 µm2/25,29 पर तीन आयामों में कम फोटॉन गणना दर20,29, ३५, यह intracellular कार्गो परिवहन, ligand रिसेप्टर बाइंडिंग, और एकल virions की extracellular गतिशीलता के रूप में तेजी से या परिवर्तनीय जैविक प्रक्रियाओं में एक खिड़की प्रदान करना चाहिए । हालांकि, इस बिंदु के लिए, RT-3d-SPT के आवेदन इस प्रौद्योगिकी अग्रिम करने के लिए काम कर रहे समूहों की मुट्ठी भर तक ही सीमित किया गया है.

एक बाधा ऑप्टिकल आरटी-3d-SPT तरीकों, जो विविध है द्वारा आवश्यक लेआउट की जटिलता है । अधिकांश विधियों के लिए, ऑप्टिकल प्रतिक्रिया एक piezoelectric चरण द्वारा प्रदान की गई है । कण के रूप में एक्स, वाई, या जेड में छोटे आंदोलनों बनाता है, एकल बिंदु डिटेक्टरों से readouts त्रुटि कार्यों में परिवर्तित कर रहे है और उच्च गति पर खिलाया एक piezoelectric nanopositioner है, जो बारी में नमूना है कण गति प्रतिक्रिया, प्रभावी ढंग से ले जाता है यह उद्देश्य लेंस के सापेक्ष जगह में ताला लगा । एक्स, वाई, और जेड में छोटे स्थिति आंदोलनों को मापने के लिए, या तो एकाधिक डिटेक्टरों (4 या 5 कार्यांवयन के आधार पर)15,18,21 या एकाधिक उत्तेजना स्पॉट (2-4, जिनमें से कम लागू किया जा सकता है अगर एक ताला एम्पलीफायर में एक्स और वाई स्थिति एक घूर्णन लेजर स्थान का उपयोग कर निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है)25,28 लागू होते हैं. इन एकाधिक डिटेक्शन और उत्सर्जन धब्बों के ओवरलैप सिस्टम को संरेखित और बनाए रखना कठिन बनाते हैं ।

इस के साथ साथ, हम एक उच्च गति लक्ष्य-3 डी-DyPLoT29कहा जाता है एक सरलीकृत ऑप्टिकल डिजाइन के साथ 3d-SPT विधि बंद प्रस्तुत करते हैं । 3 डी-DyPLoT एक 2d-ईओडी और एक टैग लेंस का उपयोग करता है३६,३७,३८ गतिशील एक उच्च दर (५० khz XY, ७० khz जेड) पर उद्देश्य फोकल मात्रा के माध्यम से एक केंद्रित लेजर स्थान ले जाने के लिए । लेजर फोकस स्थिति और फोटॉन आगमन के समय के संयोजन है कण 3 डी की स्थिति को तेजी से भी कम फोटॉन गिनती दरों पर प्राप्त करने में सक्षम बनाता है । 2d-ईओडी एक नाइट टूर पैटर्न में लेजर फोकस ड्राइव३९ x-Y विमान और टैग लेंस में 1 x 1 µm के एक वर्ग आकार के साथ 2-4 µm की एक सीमा के साथ अक्षीय दिशा में लेजर ध्यान चलता रहता है । 3 डी कण स्थिति 3 डी में एक अनुकूलित स्थिति अनुमान एल्गोरिथ्म29,४० के साथ प्राप्त की है । 3 डी का नियंत्रण गतिशील चलती लेजर स्पॉट, फोटॉन हिमस्खलन photodiode से गिनती (APD), वास्तविक समय कण स्थिति गणना, piezoelectric मंच प्रतिक्रिया, और डेटा रिकॉर्डिंग एक क्षेत्र प्रोग्राम गेट सरणी (FPGA) पर प्रदर्शन कर रहे हैं ।इस प्रोटोकॉल में, हम का वर्णन कैसे एक 3d-DyPLoT माइक्रोस्कोप का निर्माण करने के लिए कदम दर कदम, सहित ऑप्टिकल संरेखण, तय कणों के साथ अंशांकन, और अंत में मुक्त कण ट्रैकिंग. एक प्रदर्शन के रूप में, ११० एनएम फ्लोरोसेंट मोती एक समय में मिनट के लिए पानी में लगातार ट्रैक किए गए ।

यहां वर्णित विधि किसी भी आवेदन के लिए एक आदर्श विकल्प है जहां यह लगातार कम प्रकाश स्तर पर एक तेजी से बढ़ फ्लोरोसेंट जांच की निगरानी करना वांछित है, वायरस, नैनोकणों सहित, और बुलबुले जैसे endosomes । पिछले तरीकों के विपरीत, वहां केवल एक एकल उत्तेजना और एकल पहचान मार्ग, बनाने संरेखण और रखरखाव सीधा है । इसके अलावा, बड़े क्षेत्र का पता लगाने के इस माइक्रोस्कोप आसानी से जल्दी से फैलाना कणों लेने के लिए सक्षम बनाता है, जबकि कम संकेत स्तर पर ट्रैक करने की क्षमता (10 kHz करने के लिए नीचे) कम प्रकाश अनुप्रयोगों के लिए इस विधि आदर्श बनाता है29.

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Protocol

1. सेटअप लेआउट और संरेखण

  1. ट्रैकिंग उत्तेजना लेज़र की स्थापना और collimation
    1. एक घर का उपयोग कर ऑप्टिकल मेज पर लेजर प्रत्यय माउंट बनाया । माउंट लेजर सिर और ऑप्टिकल टेबल के लिए बढ़ते छेद के साथ एक सरल एल्यूमीनियम प्लेट है । लेजर दृढ़ता से एक धातु के लिए संलग्न किया जाना चाहिए स्थिरता और गर्मी अपव्यय के लिए माउंट । इस काम के लिए, एक ४८८ एनएम ठोस राज्य लेजर रोशनी के लिए (चित्रा 1) का उपयोग करें, हालांकि तरंग दैर्ध्य एक विशेष fluorophore या प्रयोग के अनुरूप चुना जा सकता है । एक महत्वपूर्ण कारक यह है कि लेजर तरंग दैर्ध्य 2d-ईओडी कार्य रेंज है, जो मुख्य रूप से दो deflectors (चित्रा 1: W2) के बीच तरंग प्लेट द्वारा निर्धारित होता है फिट । ४८८ एनएम लेजर प्रभावी ढंग से हरे या पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP/YFP), जो रहते सेल प्रयोगों में आम फ्लोरोसेंट टैग कर रहे है उत्तेजित कर सकते हैं ।
    2. लेजर बीम ऊंचाई और दिशा ढांकता दर्पण की एक जोड़ी का उपयोग कर समायोजित करें (चित्र 1: M) । सुनिश्चित करें कि लेजर बीम ऑप्टिकल तालिका के समानांतर है और यह एक उपयुक्त ऊंचाई पर समायोजित करें ।
      नोट: ऊंचाई माइक्रोस्कोप मंच के आधार पर चुना जाना चाहिए । इस ऊंचाई के बाद सभी इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया दर्पण के लिए बनाए रखा जाना चाहिए, हालांकि यह स्पष्ट रूप से नहीं कहा जाएगा ।
    3. Collimate लेंस की एक जोड़ी के साथ बीम (चित्रा 1: L1 और L2) । लेंस के फोकल लंबाई ध्यान से लेजर जगह 2d-ईओडी के एपर्चर द्वारा काटा जा रहा है से बचने के लिए चुना जाना चाहिए । कतरन 2 डी-ईओडी के माध्यम से गुजर के बाद लेजर बीम आकार में परिवर्तन से स्पष्ट है । यहां collimation की गुणवत्ता बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि वाकया बाद लेंस से परिलक्षित होगा और किसी भी फर्क 2d-ईओडी विक्षेपन के प्रदर्शन खराब हो जाएगा । आदर्श रूप से बीम को ध्यान में रखकर बीम को एक पॉइंट से कम से 20 मीटर दूर collimate ।
  2. पहले collimation लेंस (चित्रा 1: L1) के ध्यान में उपयुक्त आकार के एक pinhole (चित्रा 1: पीएच) प्लेस ।
    1. एक उचित आकार pinhole चुनें । pinhole आकार निंन परिकलन के आधार पर चुना जा सकता है:
      Equation 1
      जहां λ लेजर की तरंग दैर्ध्य है, एफ पहले लेंस के फोकल लंबाई है, और डी इनपुट बीम व्यास है ।
    2. एक 3 डी अनुवाद मंच पर pinhole माउंट इतना है कि यह ठीक पहले collimation लेंस के ध्यान में रखा जा सकता है ।
    3. pinhole की स्थिति समायोजित करें । pinhole के बाद एक लेजर पावर मीटर प्लेस करें और XYZ में pinhole पोजीशन को एडजस्ट करके पावर मीटर readout को बड़ा करें । यदि एक विवर्तन अंगूठी मनाया जाता है, यह 2d-ईओडी से पहले रखा आइरिस के साथ ब्लॉक ।
  3. Glan की स्थापना-Thompson ध्रुवर
    1. Glan-थॉम्पसन ध्रुवर (चित्रा 1: जीपी) दूसरा collimation लेंस के बाद (चित्रा 1: L2) लेजर बीम के ध्रुवीकरण को साफ करने के लिए रखो । बिजली मीटर के साथ अधिकतम संचरण खोजने के लिए ध्रुवर घुमाएँ.
  4. EODs की स्थापना
    1. X और Y दिशाओं में लेज़र को विक्षेपित करने के लिए 2 EODs (figure 1: EOD1 & #38; EOD2) का उपयोग करें । हटना, पिच, और प्रत्येक ईओडी की ऊंचाई का समायोजन करके लेजर संचरण को अधिकतम ।
    2. प्रत्येक झुकानेवाला के किनारे पर निर्माता द्वारा प्रदान संरेखण मार्कर का उपयोग करते हुए एक दूसरे के संबंध में दो EODs संरेखित करें ।
    3. ईओडी के उत्पादन का निरीक्षण करने के लिए 2d-ईओडी के नियंत्रक के लिए एक परीक्षण पैटर्न लागू करें । यह या तो है नाइट टूर (चित्रा 2) के माध्यम से FPGA नीचे या एक सरल साइन एक समारोह जनरेटर द्वारा प्रदान की लहर वर्णित हो सकता है । सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन के लिए, प्रत्येक झुकानेवाला द्वारा विक्षेपन पीजो nanopositioner के एक्स या वाई दिशा के समानांतर होना चाहिए । इस दिशा में संचरण अक्ष के बारे में deflectors की कोणीय दिशा द्वारा तय किया जाता है । 2d-ईओडी ले जाने के बिना विक्षेपन दिशा घुमाने के लिए, 2d के बाद एक कबूतर चश्मे प्लेस-ईओडी पीजो nanopositioner अक्षों के लिए विक्षेप अक्ष संरेखित करें ।
  5. हाफ वेव प्लेट की स्थापना
    1. Glan-Thompson ध्रुवर (चित्रा 1: जीपी) और 2d-ईओडी 2d के विक्षेप अक्ष के साथ आने वाली लेजर बीम ध्रुवीकरण संरेखित करने के लिए एक आधा लहर प्लेट (चित्रा 1: W1) प्लेस-ईओडी । एक लंबे फोकल लेंस प्लेस (३०० mm) 2d-ईओडी के बाद और लेजर फोकस पर एक sCMOS कैमरा जगह है । अगले, 2d-ईओडी पर बारी के लिए नाइट के दौरे उत्पंन (चित्रा 2) नीचे वर्णित है । एक समान रूप से वर्ग लेजर वितरण कैमरे पर मनाया जाता है जब तक हाफ वेव प्लेट घुमाएँ ।
  6. एक बीम खपा लेंस जोड़ी और रिले लेंस जोड़ी की स्थापना
    1. लेंस की एक जोड़ी प्लेस (चित्रा 1: L3 और L4) के बाद 2d-ईओडी के लिए बीम का विस्तार करने के लिए उद्देश्य लेंस के पीछे एपर्चर (चित्रा 1: राजभाषा) और लेंस की एक और जोड़ी (चित्रा 1: L5 और L6) को भरने के लिए माइक्रोस्कोप उद्देश्य के लिए फोकल विमान रिले । के लिए लेंस के इन दो जोड़े के बीच पर्याप्त कमरे में छोड़ने के रूप में टैग लेंस उंहें बाद में एक कदम में स्थापित किया जाएगा सुनिश्चित करें ।
  7. dichroic फ़िल्टर, 10/90 बीम अलगानेवाला स्थापित करें, लेंस ध्यान केंद्रित, APD, उद्देश्य लेंस, और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन फिल्टर का पता लगाने मार्ग को पूरा करने के लिए ।
    1. dichroic फ़िल्टर स्थापित करें (चित्रा 1: DC) उद्देश्य लेंस की ओर लेजर को प्रतिबिंबित करने के लिए । लेजर सीधे उद्देश्य लेंस के केंद्र के माध्यम से शीर्ष पर और एक लंबे लेंस ट्यूब के नीचे दो आईरिस का उपयोग करके जाने के लिए संरेखित करें ।
    2. एक 10/90 बीम अलगानेवाला स्थापित करें (चित्रा 1: बी एस) जिसके द्वारा 10% प्रकाश इमेजिंग के लिए एक sCMOS कैमरा द्वारा परिलक्षित होता है (नीचे वर्णित) और ९०% के माध्यम से गुजरता है पर नज़र रखने के लिए APD के लिए ।
    3. APD संरेखित करें । उद्देश्य लेंस द्वारा एक coverslip पर लेजर ध्यान केंद्रित । coverslip से प्रतिबिंब का उपयोग करने के लिए उद्देश्य ध्यान में एक coverslip डाल और APD readout की तीव्रता की जांच द्वारा सभी बहाव तत्वों संरेखित करें । बीम अलगानेवाला के बाद, APD ध्यान केंद्रित लेंस स्थापित (चित्रा 1: L7) एक 3 डी अनुवाद मंच पर APD द्वारा पीछा किया । स्थिति लेंस ऐसी है कि उद्देश्य से लेजर प्रतिबिंब लेंस के केंद्र के माध्यम से चला जाता है ।
APD स्थिति coverslip पर लेजर प्रतिबिंब से तीव्रता को अधिकतम करने के लिए 3 डी स्थिति का समायोजन करके अनुकूलित किया जा सकता है । APD स्थिति इष्टतम स्थिति में है जब किसी भी दिशा में डिटेक्टर स्थिति की एक चाल तीव्रता कम हो जाती है ।
  • एक longpass प्रतिदीप्ति उत्सर्जन फ़िल्टर (चित्रा 1: F) स्थापित करने से पहले बीम अलगानेवाला प्रतिबिंबित और बिखरे हुए प्रकाश को दूर करने के लिए ।
  • टैग लेंस की स्थापना
    1. लेंस के दो जोड़े के बीच टैग लेंस प्लेस ( चित्रा 1: L4 और L5के बीच) के रूप में पहले उल्लेख किया है और चित्रा 1में दिखाया गया है । हटना, पिच, ऊंचाई, और पार्श्व स्थिति ऐसी है कि बीम टैग लेंस के केंद्र के माध्यम से सीधा गुजरता समायोजित करें ।

    • 2. नमूना तैयारी ।

    1. फिक्स्ड पार्टिकल तैयारी
      1. १९० एनएम फ्लोरोसेंट मोतियों को पतला ~ 5 × 108 मोती/ एक coverslip पर ४०० µ एल मोती समाधान जोड़ें और piezoelectric चरण के नमूना धारक पर माउंट (मोतियों की मात्रा नमूना धारक पर निर्भर करेगा; नमूना धारक कक्ष का व्यास यहां इस्तेमाल किया 18 मिमी है) । यहां इस्तेमाल होने वाले मोतियों के लिए, पंजाबियों को coverslip पर जमा होने वाले कणों का कारण बनता है ।
    2. नि: शुल्क चलती कण तैयारी
      1. ११० एनएम फ्लोरोसेंट मोती पतला करने के लिए ~ 5 × 108 मोती/ एक coverslip पर ४०० µ एल मोती समाधान जोड़ें और piezoelectric चरण के नमूना धारक पर माउंट ।

    3. अनुकूलन ट्रैकिंग मापदंडों

    1. रैस्टर स्कैन फिक्स्ड कणों
      1. माइक्रोस्कोप पर एक निश्चित कण नमूना रखो ।
      2. लेज़र, micropositioner नियंत्रक, पीजो nanopositioner नियंत्रक, टैग लेंस नियंत्रक, और ईओडी नियंत्रक चालू करें । ध्यान दें कि आदेश महत्वपूर्ण नहीं है । पीजो nanopositioner बंद लूप में चलाएं ।
      3. रैस्टर एक कस्टम स्कैनिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग कर XYZ में नमूना स्कैन (चित्रा S3, लेखकों से अनुरोध पर उपलब्ध सॉफ्टवेयर) है, जो एक नाइट टूर में 2d-ईओडी ड्राइव (चित्रा 2), APD से गिनती एकत्र करता है, पीजो ड्राइव nanopositioner, और स्थिति परिकलन (चित्र S2) निष्पादित करता है । चरण का आकार ४० एनएम है और स्कैनिंग रेंज 2 µm है ।
        1. उद्देश्य के ध्यान में coverslip जगह है, प्रतिदीप्ति उत्सर्जन फिल्टर को हटाने और coverslip से लेजर के प्रतिबिंब का उपयोग करने के लिए micropositioner के जेड स्थिति के एक समारोह के रूप में संकेत तीव्रता को अधिकतम । फोकल विमान में नमूना रखने के बाद, प्रतिदीप्ति उत्सर्जन फिल्टर वापस जगह है ।
        2. स्कैनिंग प्रोग्राम खोलें । स्कैनिंग रेंज और चरण आकार ' प्रारंभ ', ' समाप्त ', और ' चरण ' में संख्या लिखकर सेट करें । पहले एक कण का पता लगाने के लिए एक बड़ी स्कैनिंग रेंज और कदम आकार सेट (उदा., २०० एनएम कदम आकार के साथ 10 x 10 µm रेंज) । कण खोजने के बाद, स्कैनिंग रेंज हटना और कदम आकार कम (उदा., १०० एनएम कदम आकार के साथ 2 x 2 µm रेंज) । फ्लोरोसेंट फोकस को खोजने के लिए एक 3d रैस्टर स्कैन करने के लिए ' स्कैन ' बटन पर क्लिक करें ।
    2. टैग लेंस सेटिंग्स ( चित्रा 3भी देखें)
      1. टैग लेंस नियंत्रण सॉफ्टवेयर पर क्लिक करें । ' कनेक्ट ', ' पावर ऑन ' क्रमिक रूप से क्लिक करें ।
      2. ट्रिगर संकेतों के आउटपुट चरण को बदलने के लिए, यह आउटपुट ट्रिगर मोड को बदलने के लिए आवश्यक है । पहले ' आरजीबी ' से ' Multiplane ' मोड बदलें और फिर इसे वापस बदल जाते हैं । अब चरण बदला जा सकता है (चित्र बी) ।
      3. आउटपुट चरण 0 °, ९० °, और २७० ° होने के लिए सेट करें । जबकि चरण अंतरिक्ष को कवर करने वाले किसी भी तीन चरणों का उपयोग किया जा सकता है, इन तीनों को अच्छी तरह से empirically (चित्रा 3सी) काम करने के लिए पाया जाता है ।
      4. ६८,५०० हर्ट्ज आवृत्ति सेटिंग का चयन करें.
      5. इष्टतम आवृत्ति यह अक्सर आवृत्ति खोज रेंज बदलने के लिए आवश्यक है खोजने के लिए । ' उन्नत ', ' सेटिंग ' पर क्लिक करें । ' मैक्स बदलें । Freq (hz) का कॉलम 0 ७०,००० हर्ट्ज से ७१,५०० हर्ट्ज के लिए । यह जो भी आवृत्ति रेंज के लिए उपयुक्त है समायोजित किया जा सकता है । ' अंशांकन सहेजें ' पर क्लिक करें, ' बाहर निकलें अंशांकन ' (चित्रा 3d).
      6. नए अंशांकन प्रभावी बनाने के लिए, एक और आवृत्ति के लिए अनुनाद स्विच (उदाहरण के लिए, १८९,१५० हर्ट्ज) और फिर वापस ६८,५०० हर्ट्ज आवृत्ति सेटिंग (चित्रा 3e) करने के लिए स्विच.
      7. ३५% करने के लिए आयाम धीरे बदलें । ' लॉक अनुनाद ' पर क्लिक करें । आवृत्ति बंद होने के बाद, क्लिक करें ' अनलॉक अनुनाद ' (चित्रा 3e) । टैग लेंस अब उपयोग करने के लिए तैयार है ।
      8. जांचना, अनुमानित स्थिति को वास्तविक स्थिति के बराबर बनाने के लिए estimation में उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर्स को परिवर्तित करें, जैसा कि आरेख 4eमें दिखाया गया है, f. Input x, y, और z की स्कैनिंग श्रेणी और उसके बाद XYZ में नमूना स्कैन करने के लिए ' स्कैन ' बटन पर क्लिक करके ले जाने के लिए चलती लेजर स्पॉट के माध्यम से कण । कण की स्थिति के रूप में यह लेजर फोकस के माध्यम से स्कैन की स्थिति अनुमान लूप (चित्रा एससी) द्वारा निर्धारित अनुमानित कण स्थिति के साथ सहमत होना चाहिए. अनुमानित स्थिति और वास्तविक स्थिति (चित्रा 4d) के बीच संबंध अनुमानित स्थिति छवियों (चित्रा 4f) से निकाला जा सकता है । यदि स्थितियां सहमत नहीं हैं, लेजर स्थिति (सी) के मूल्यों को समायोजित स्थान अनुमान पाश (चित्रा एससी) में इस्तेमाल किया ।
      9. टैग लेंस संरेखित करें
        1. जब टैग लेंस नियंत्रक बंद है, रैस्टर स्कैन कण छवियों (नीचे वर्णित) टैग लेंस स्थापित करने से पहले ले लिया और टैग लेंस स्थापित करने के बाद समान दिखना चाहिए । इसके बाद, फ्लोरोसेंट कण जेड nanopositioner के साथ उद्देश्य चलती द्वारा स्कैनिंग प्रदर्शन की स्थिति और टैग लेंस के कोण धुन (चित्रा 4) । टैग लेंस की स्थिति ट्यून जब तक वहां z दिशा, जो हासिल की है, जब कण के xy स्थिति में कोई परिवर्तन नहीं है के साथ xy विमान में कोई बहाव है जेड स्थिति (चित्रा 4d) के एक समारोह के रूप में) । ट्रैकिंग सिस्टम टैग लेंस के संरेखण के बाद उपयोग करने के लिए तैयार है ।
    3. कण की निगरानी के लिए sCMOS कैमरा की स्थापना
      1. जब वे ट्रैक किया जा रहा है कणों कल्पना करने के लिए एक sCMOS कैमरा स्थापित करें । sCMOS स्थापित करने के बाद ही ट्रैकिंग प्रणाली के सभी घटकों को स्थापित किया गया है और अनुकूलित ।
    माइक्रोस्कोप पर एक निश्चित फ्लोरोसेंट कण नमूना लोड और ट्रैकिंग कार्यक्रम को चलाने के उद्देश्य फोकल मात्रा में एक कण बंद । फिर, १०० mm फोकल लंबाई लेंस (चित्रा 1: L8) और sCMOS स्थापित करें । sCMOS स्थिति को समायोजित करें ताकि कण की छवि छोटी और चमकीले स्थान पर केंद्रित हो ।

    आज़ादी से फैलाना नैनोकणों की वास्तविक समय 3 डी ट्रैकिंग

    1. माइक्रोस्कोप पर ११० एनएम मुक्त चलती कण नमूना रखो ।
    2. लेजर, माइक्रो-पोजिशनर कंट्रोलर, पीजो nanopositioner कंट्रोलर, टैग लेंस कंट्रोलर, और ईओडी कंट्रोलर चालू करें । पीजो nanopositioner खोलें लूप में चलाएं । टैग लेंस सॉफ्टवेयर सेट के अनुसार ३.२ कदम है ।
    3. खोलें और ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर (लेखकों से अनुरोध पर उपलब्ध) चलाएँ । स्थिति estimation पैरामीटर्स को उनके ऑप्टिमाइज़ किए गए मानों पर सेट करें, जो अनुभाग 3 में पाए गए थे.
    4. उद्देश्य के ध्यान में coverslip जगह है, प्रतिदीप्ति उत्सर्जन फिल्टर को हटाने और coverslip से लेजर के प्रतिबिंब का उपयोग करने के लिए micropositioner के जेड स्थिति के एक समारोह के रूप में संकेत तीव्रता को अधिकतम । coverslip खोजने के बाद, ध्यान केंद्रित स्थिति 15 µm लेजर coverslip से दूर ध्यान और समाधान में वृद्धि हुई है । प्रतिदीप्ति उत्सर्जन फ़िल्टर वापस प्लेस ।
    5. अभिंन नियंत्रण स्थिरांक सेट करें । अभिंन नियंत्रण स्थिरांक एक कम मूल्य पर शुरू किया जा सकता है और धीरे से बढ़ रही है जब तक दोलनों कण की स्थिति readouts में देखा जा सकता है । एक बार दोलनों मनाया जाता है, एक अभिंन नियंत्रण स्थिरांक सेट दोलनों के कारण मूल्य के ८०% करने के लिए । विशिष्ट मान XY के लिए ०.०१२ के आसपास होगा ' अभिंन लाभ ' और Z के लिए ०.००४ ' अभिंन लाभ ' ।
    6. ट्रैकिंग थ्रेशोल्ड को ' ट्रैक थ्रेशोल्ड ' और ' ट्रैक न्यूनतम ' में सेट करें और ' खोज ' और ' ऑटो ट्रैक ' पर क्लिक करके ट्रैकिंग प्रयोग प्रारंभ करें. ट्रैकिंग समाप्त करने के लिए थ्रेशोल्ड पृष्ठभूमि स्तर से थोड़ा अधिक सेट है और ट्रैकिंग ट्रिगर करने के लिए थ्रेशोल्ड पृष्ठभूमि से दो गुना अधिक है । यहां, ट्रैकिंग ट्रिगर के लिए दहलीज 3 khz है और पथ को समाप्त करने के लिए दहलीज १.५ khz है.

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    Representative Results

    फिक्स्ड कण स्कैनिंग (चित्रा 4) और आज़ादी ११० एनएम फ्लोरोसेंट कण ट्रैकिंग (चित्रा 5) के ऊपर प्रोटोकॉल के बाद प्रदर्शन किया गया । कण स्कैनिंग piezoelectric nanopositioner और बिन फोटॉनों चलती द्वारा प्रदर्शन किया गया था, जबकि एक साथ स्कैन में प्रत्येक बिंदु पर कण की अनुमानित स्थिति की गणना । स्कैनिंग छवि भी तीव्रता (चित्रा 4a) के एक वर्ग से पता चलता है और अनुमानित पदों x, y, और जेड दिशा में एक 1 × 1 × 2 µm रेंज पर है कण वास्तविक स्थिति के साथ एक रैखिक संबंध दिखाने के (चित्रा 4b-च) ।

    रीयल-टाइम ट्रैकिंग का प्रदर्शन करने के लिए, ११० एनएम फ्लोरोसेंट कणों को 3d-DyPLoT (चित्र 5 ए, बी) द्वारा पानी में ट्रैक किया गया । मतलब स्क्वायर विस्थापन (एमएसडी) विश्लेषण Brownian गति (चित्रा 5c) के एक ठेठ रैखिक व्यवहार विशेषता से पता चलता है । 30 पथ के एमएसडी विश्लेषण ११० एनएम के एक मतलब hydrodynamic व्यास दिखाया, फ्लोरोसेंट नैनोकणों के आकार के लिए निर्माताओं विनिर्देशन के साथ अच्छा समझौते में (चित्रा 5d) ट्रैक किया जा रहा है. इसके अलावा, 1 फिल्म वास्तविक समय piezoelectric nanopositioner readouts और एक स्वतंत्र रूप से फैलाना ११० एनएम फ्लोरोसेंट कण के एक 2 मिनट लंबे पथ के लिए सिंक्रनाइज़ sCMOS छवियों से पता चलता है ।

    उच्च गति के साथ ट्रैक करने के लिए सक्षम होने के अलावा, धीमी गति से चलती कणों उच्च परिशुद्धता के साथ स्थानीयकृत किया जा सकता है. चित्रा 6a - d 3d-DyPLoT सिस्टम के अनुप्रयोग को दिखाता है जो उच्च गति ट्रैकिंग के लिए उपयोग किए गए समान प्रतिक्रिया पैरामीटर्स का उपयोग करते हुए, १७.६, २६.४, और ५३.४ एनएम X, Y, और Z में क्रमश: 105के फोटॉन गणना दर के साथ, की शुद्धता दिखा रहा है । चित्रा 6e - h प्रतिक्रिया नियंत्रण के तहत परिशुद्धता 10 के एक पहलू से कम दिखाता है, परिशुद्धता के लिए प्रभावी ढंग से गमागमन गति और ६.५, ८.३ के एक सटीक प्रदर्शन, और १०.५ एनएम एक्स, वाई और जेड, क्रमशः में ।

    Figure 1
    चित्र 1. 3 डी ट्रैकिंग प्रणाली के योजनाबद्ध । 2d-ईओडी (EOD1 & #38; EOD2) और टैग लेंस (टैग) को क्रमशः XY और Z दिशाओं के साथ लेजर से विक्षेपित करें । APD (APD) में प्रतिदीप्ति फोटॉनों इकट्ठा किया जाता है, जिसे FPGA (FPGA) के लिए भेजा जाता है । FPGA की स्थिति गणना एल्गोरिथ्म, फोटॉन गिनती, 2d के नियंत्रण-ईओडी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नियंत्रण और piezoelectric nanopositioner (NSxy और NZz) के readout के लिए प्रयोग किया जाता है । चित्र में लेबल किए गए अंय घटक: दर्पण (M); लेंस (L #); pinhole (PH); Glan-थॉमसन ध्रुवर (जीपी); हाफ वेव प्लेट (W1); dichroic फ़िल्टर (DC); उद्देश्य लेंस (राजभाषा, 100X NA = १.४९); प्रतिदीप्ति उत्सर्जन फ़िल्टर (च); बीम अलगानेवाला (बी एस); XY micropositioner चरण (MSxy); Z micropositioner चरण (MSz) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 2
    चित्र 2. 3 डी में कार्यान्वित नाइट के दौरे के लिए निर्देशांक-DyPLoT. अक्ष 1 और अक्ष 2 2d-ईओडी के उचित संरेखण द्वारा X या Y अक्ष के साथ संरेखित होना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 3
    चित्र 3. टैग लेंस सॉफ्टवेयर सेटिंग्स । अधिक जानकारी के लिए अनुभाग ४.२ टैग लेंस सेटिंग्स देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 4
    चित्र 4. कण स्कैनिंग और स्थिति अनुमान । (एक) 2 डी-ईओडी एक 1 × 1 µm स्क्वायर नाइट के टूर पैटर्न में लेजर ड्राइविंग के साथ १९० एनएम फ्लोरोसेंट मोतियों की स्कैनिंग छवि । प्रतिदीप्ति तीव्रता रंग से चिह्नित है । इकाई: kHz. (ख) xkका अनुमान है, कण की स्थिति 2d के केंद्र के सापेक्ष-ईओडी micrometers में स्कैन । b, c, और d में रंग, अनुमानित स्थिति को नोट कर रहा है । इकाई: µm. (ग) micrometers में yk का अनुमान । (घ) zkका अनुमान, कण की स्थिति micrometers में टैग लेंस स्कैन के अक्षीय केंद्र के सापेक्ष. (ई) अनुमानित कण स्थिति के रूप में वाईकश्मीर (सी) से पूरे ग्रिड पर औसत स्थिति के एक समारोह के रूप में । ध्यान दें कि स्थिति आकलन एल्गोरिथ्म (yk) से प्राप्त अनुमानित कण स्थिति वास्तविक स्थिति से सहमत है । (च) (d) से पूरे ग्रिड पर औसत स्तर की स्थिति के एक समारोह के रूप में अनुमानित कण स्थिति जेडकश्मीर । अनुमानित स्थिति 1 × 1 × 2 µm सीमा से अधिक कण की वास्तविक स्थिति के साथ एक रैखिक संबंध दिखाता है X, Y, और जेड दिशा में । ध्यान दें कि स्थिति estimation एल्गोरिथ्म (zk) से प्राप्त अनुमानित कण स्थिति वास्तविक स्थिति से सहमत है । अनुमानित स्थिति है कण वास्तविक स्थिति के साथ एक 1 × 1 × 2 µm श्रेणी में X, Y, और जेड दिशा में एक रैखिक संबंध दिखाता है । (ए-सी) में सफेद पैमाने पर सलाखों के ५०० एनएम प्रतिनिधित्व करते है और (डी) में काले पैमाने बार 2 µm का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

    Figure 5
    चित्रा 5.3 डी-DyPLOT के साथ पानी में ११० एनएम फ्लोरोसेंट कणों पर नज़र रखने । (ए) पानी में एक स्वतंत्र रूप से फैलाना ११० एनएम फ्लोरोसेंट nanoparticle के 3 डी पथ । (ख) में पथ के लिए समय के एक समारोह के रूप में फ्लोरोसेंट तीव्रता (एक) । (ग) एमएसडी (क) में पथ का । ब्लू लाइन मापा एमएसडी है, जबकि बिंदीदार लाल रेखा रैखिक प्रतिगमन से सबसे अच्छा फिट लाइन है । (घ) 30 पथ का एमएसडी विश्लेषण, ११० एनएम का एक मतलब hydrodynamic व्यास दिखा, फ्लोरोसेंट नैनोकणों के आकार के साथ अच्छे समझौते में ट्रैक किया जा रहा है । कणों का व्यास स्टोक्स-आइंस्टीन रिलेशन का उपयोग करते हुए गणना की गई. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 6
    चित्रा 6. निश्चित कण ट्रैकिंग की परिशुद्धता । (a) किसी निश्चित कण को 3d-DyPLoT द्वारा भिंन गणना दरों पर ट्रैक किया जाता है । परिशुद्धता (b) X में १७.६ एनएम, (c) Y में २६.४ एनएम, और (d) ५३.४ एनएम का उत्सर्जन दर Z में १०० kHz है । (ई) धीमी प्रक्रियाओं की जांच करते समय, प्रतिक्रिया नियंत्रण स्थिरांक (KI) परिशुद्धता बढ़ाने के लिए 10 का एक कारक द्वारा कम किया जा सकता है । इस कम प्रतिक्रिया नियंत्रण के अंतर्गत, परिशुद्धता (f) X में ६.५ एनएम, (g) ८.३ में Y, और (h) १०.५ एनएम Z में १०० kHz के उत्सर्जन दर पर है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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    Discussion

    हालांकि 3 डी एकल कण ट्रैकिंग तरीकों की कई किस्मों हाल के वर्षों में उभरा है, मजबूत वास्तविक समय उच्च गति 3 डी प्रसार के एक साधारण सेटअप के साथ कम फोटॉन गिनती दरों पर ट्रैकिंग अभी भी एक चुनौती है, जो महत्वपूर्ण जैविक के लिए अपने आवेदन सीमा समस्याओं. इस प्रोटोकॉल में वर्णित 3d-DyPLoT विधि कई तरीकों से इन चुनौतियों को हल करता है । सबसे पहले, उत्तेजना और पता लगाने के रास्ते बहुत सरल और मजबूत संरेखण बनाने के अन्य implementations की तुलना में सरलीकृत कर रहे हैं. दूसरे, चलती लेजर स्पॉट और स्थिति आकलन एल्गोरिथ्म प्रतिक्रिया पाश के लिए सटीक स्थिति का अनुमान है, और अधिक स्थिर राय बनाने प्रदान करते हैं । तीसरे, प्रभावी रूप से बड़े डिटेक्शन रेंज (1 x 1 x 4 µm) गतिशील रूप से चलती लेजर स्पॉट के तेजी से चलती कणों की ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है । यह देखने के लिए क्यों इस बड़े जांच क्षेत्र महत्वपूर्ण है, यह piezoelectric nanopositioner के आंतरिक प्रतिक्रिया समय पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है । उच्च गति piezoelectric चरणों 1 kHz के आदेश पर अनुनादों है, प्रतिक्रिया समय सीमित 1 ms. में 1 एमएस के आदेश पर होना करने के लिए, 4 µm के एक प्रसार गुणांक के साथ एक १०० एनएम nanoparticle2s, विवर्तन के केंद्र से औसत ९० एनएम पर फैलाना होगा-ली घुन लगाना पहचान मात्रा । यह केवल औसत विस्थापन और वास्तव में यादृच्छिक गति इस से भी बड़ा कदम प्रदर्शन करेंगे, केंद्र की मात्रा जा रहा है और वर्तमान पथ समाप्त कण को अग्रणी । स्थिति भी छोटे कणों, जहां तेजी से बड़े थर्मल प्रसार कदम ट्रैकिंग के नुकसान के लिए नेतृत्व के लिए बदतर है । प्रभावी ढंग से बड़े पता लगाने के क्षेत्र में ट्रैकिंग प्रणाली के लिए अनुमति देता है आंतरिक piezoelectric चरण अंतराल पर काबू पाने और कण की स्थिति में बड़े प्रसार से कूदता से उबरने, ट्रैकिंग तंत्र की समग्र मजबूती में वृद्धि । अंत में, बड़े स्कैन क्षेत्र प्रणाली आसानी से नए कणों लेने के लिए अनुमति देता है, लगातार पथ के लिए अनुमति देने के लिए तेजी से प्राप्त किया और बड़े डेटा संकलित सेट ।

    यूजर को इस बात का ध्यान रखना चाहिए कि इसमें कुछ अहम कदम उठाए जाएं । सबसे पहले, दोनों 2d-ईओडी और टैग लेंस के संरेखण महत्वपूर्ण हैं । दोनों अच्छी तरह से इष्टतम परिशुद्धता प्राप्त करने के लिए गठबंधन किया जाना चाहिए । दूसरा, पैरामीटर निश्चित कण स्कैनिंग चरण में स्थिति अनुमान में उपयोग किया जाता है अच्छी तरह से तुले होना चाहिए ( चित्रा 4देखें) । अनुमानित कण स्थिति कण स्थिति लेज़र स्कैन श्रेणी के केंद्र के लिए संगत से मेल खाना चाहिए । अंत में, प्रतिक्रिया अभिंन स्थिरांक (कश्मीरमैं) ध्यान से देखते हैं, एक छोटे से मूल्य के साथ शुरू किया जाना चाहिए और फिर जब तक दोलनों मनाया जाता है, तो उस मूल्य के बारे में ८०% करने के लिए बंद का समर्थन ।

    वहां 3 डी के बारे में कुछ निरंतर DyPLoT को ध्यान में रखना वांछित आवेदन के आधार पर कर रहे हैं । जबकि अनुकूलित स्थिति अनुमान Brownian गति के साथ प्रयोग के लिए बनाया गया है, यह भी अच्छी तरह से दिशात्मक गति की ओर अनुकूल है । एल्गोरिथ्म सीधे गति के किसी भी प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है क्योंकि यह केवल स्थिति अनिश्चितता है कि गाऊसी माना जाता है, नहीं असली कण की स्थिति है । जहाँ निर्बाध रेखीय गति अपेक्षित है मामलों के लिए, एक अतिरिक्त शब्द स्थिति estimation एल्गोरिथ्म में पूर्वानुमान शब्द में जोड़ा जा सकता ( समीकरण 3 में पूरक जानकारीदेखें) ।

    2d-ईओडी और टैग के लिए मापदंडों का चयन सावधानी से जब 3d DyPLoT की स्थापना पर विचार किया जाना चाहिए । विशेष महत्व के बिन समय है नाइट 2d-ईओडी द्वारा स्कैन दौरे के लिए इस्तेमाल किया है । एक आदर्श परिदृश्य में, नाइट टूर टैग लेंस की अवधि के लिए सिंक्रनाइज़ किया जाएगा कुशल नमूना सुनिश्चित करने के लिए । हालांकि, यह 2d की प्रतिक्रिया समय पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है-ईओडी वोल्टेज में परिवर्तन के लिए कदम । इकाई के लिए यहां इस्तेमाल किया, वहां है एक 2-3 µs प्रतिक्रिया समय के बाद वोल्टेज वांछित स्थान पर पहुंचने से पहले लागू है । 20 µs बिन समय पर, यह संग्रह समय के बारे में 10-15% है । समय को कम करने इतना है कि यह ~ 14 µs के टैग लेंस अवधि मैच बिन समय के अंश बढ़ जाती है, जो 2d के अंतराल समय-ईओडी है । यह लेज़र स्थिति और गलत स्थिति अनुमान के गलत मानों की ओर जाता है ।

    प्रयोगकर्ता के लिए एक अंय कारक मन में रखने के लिए लौकिक संकल्प है । यहां दिखाया गया डेटा एक १०० kHz डेटा दर पर एकत्र कर रहे हैं, अंतिम लौकिक संकल्प अंततः जो डेटा की स्थिति माप के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं परिभाषित किया गया है. यदि nanopositioner के readout कण स्थिति (चित्रा 6) के रूप में प्रयोग किया जाता है, लौकिक संकल्प अभिंन नियंत्रण स्थिरांक के मूल्य पर निर्भर करेगा । उदाहरण के लिए, चित्रा 6a-डीमें दिखाए गए अभिन्न नियंत्रण के लिए, मंच प्रतिक्रिया 1 ms के आदेश पर है, जबकि चित्रा 6e-एच के लिए, यह 10 ms के आदेश पर है. यदि तेजी से लौकिक संकल्प वांछित है, तो स्थिति अनुमान एल्गोरिथ्म के फोटॉन-by-फोटॉन परिणाम फोटॉन गणना दर के साथ सहसंबंधी होगा । उदाहरण के लिए, एक 10 khz उत्सर्जन दर पैदावार १०० µs लौकिक संकल्प और एक १०० kHz उत्सर्जन दर एक 10 µs लौकिक संकल्प पैदावार । इसके अलावा, के बाद से परिशुद्धता एक रिश्ता Equation 2 ४१इस प्रकार है, स्थानिक और लौकिक परिशुद्धता युग्मित कर रहे हैं । नतीजतन, जांच की चमक दोनों स्थानिक और लौकिक परिशुद्धता निर्धारित करता है ।

    इस प्रोटोकॉल में हम सेटअप, लेआउट, और एक उच्च गति वास्तविक समय 3 डी एकल कण विधि जो एक 2d-ईओडी और टैग लेंस का इस्तेमाल गतिशील रूप से एक केंद्रित लेजर स्पॉट तेजी से कण स्थिति अनुमान को प्राप्त करने के लिए कदम का उपयोग ट्रैकिंग का वर्णन किया । हम तो नमूना तैयारी और पैरामीटर अनुकूलन तरीकों का वर्णन किया । 3d-DyPLoT तेजी से चलती है और नीच उत्सर्जन प्रसार कणों के लिए ताला पर करने के लिए एक मजबूत और अपेक्षाकृत सरल तरीका प्रदान करता है । सरल ऑप्टिकल लेआउट यह इमेजिंग मॉड्यूल के साथ संयुक्त किया जा सकता है इतना है कि किसी भी मौजूदा माइक्रोस्कोप स्टैंड के पक्ष बंदरगाह पर आसानी से जोड़ा जा करने के लिए अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल के साथ, हमें उंमीद है कि RT-3d-SPT अधिक जांचकर्ताओं द्वारा कार्यांवित किया जा सकता है और अधिक तेजी से पता, तीन आयामी जैविक प्रक्रियाओं ।

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    Disclosures

    लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

    Acknowledgments

    यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के जनरल मेडिकल साइंसेज के पुरस्कार संख्या R35GM124868 के तहत और ड्यूक विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    2D Electro-optic Deflector  ConOptics M310A 2 required
    Power supply for EOD ConOptics 412 Converts FPGA ouput to high voltage for EOD
    TAG  Lens TAG Optics TAG 2.0 Used to deflect laser along axial direction
    XY piezoelectric nanopositioner MadCity Labs Nano-PDQ275HS Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in 
    Z piezoelectric nanoposiitoner MadCity Labs Nano-OP65HS Used to move the objective lens to follow the diffusing particle
    Micropositioner MadCity Labs MicroDrive Used to coarsely position sample and evaluate
    Objective Lens Zeiss PlanApo High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss
    sCMOS camera PCO pco.edge 4.2 Used to monitor the particle's position
    APD Excelitas SPCM-ARQH-15 Lower dark counts beneficial
    Field programmable gate array National Instruments NI-7852r
    Software National Instruments LabVIEW
    Tracking excitation laser JDSU FCD488-30
    Lens ThorLabs AC254-150-A-ML L1
    Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L2
    Pinhole ThorLabs P75S PH
    Glan-Thompson Polarizer ThorLabs GTH5-A GT
    Half-wave plate ThorLabs WPH05M-488 WP
    Lens ThorLabs AC254-75-A-ML L3
    Lens ThorLabs AC254-250-A-ML L4
    Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L5
    Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L6
    Dichroic Mirror Chroma ZT405/488/561/640rpc DC
    Fluorescence Emission Filter Chroma D535/40m F
    10/90 beamsplitter Chroma 21012 BS
    PBS Sigma D8537
    190 nm fluorescent nanoparticles Bangs laboratories FC02F/9942
    110 nm fluorescent nanoparticles Bangs laboratories FC02F/10617
    Coverslip Fisher Scientific 12-545A
    Powermeter Thorlabs PM100D
    CMOS Thorlabs DCC1545M
    Iris Thorlabs SM1D12D
    Microscope Mad City Labs RM21

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Hou, S., Welsher, K. A Protocol for… More

    Hou, S., Welsher, K. A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking. J. Vis. Exp. (131), e56711, doi:10.3791/56711 (2018).

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