Summary
Questo dettagli del protocollo la costruzione e il funzionamento di un microscopio di rilevamento in tempo reale 3D singola particella capace di rilevamento su scala nanometrica fluorescente sonde ad alta velocità diffusiva e tassi di conteggio basso del fotone.
Abstract
Particelle singole tridimensionale in tempo reale (RT-3D-SPT) di rilevamento ha il potenziale per far luce sui processi veloci, 3D in sistemi cellulari. Anche se vari metodi di RT-3D-SPT sono state presentate negli ultimi anni, alta velocità inseguimento 3D diffondente particelle al prezzo di conteggio basso fotone rimane una sfida. Inoltre, configurazioni di RT-3D-SPT sono generalmente complessi e difficili da implementare, limitando la loro diffusa applicazione a problemi biologici. Questo protocollo presenta un sistema di RT-3D-SPT denominato 3D dinamico del fotone localizzazione Tracking (3D-DyPLoT), che permette di monitorare le particelle con diffusiva ad alta velocità (fino a 20 µm2/s) al prezzo di conteggio basso fotone (fino a 10 kHz). 3D-DyPLoT si avvale di un deflettore di elettro-ottica 2D (2D-EOD) e una lente sintonizzabile sfumatura acustica (TAG) all'unità un singolo focalizzato punto dinamicamente in 3D laser. In combinazione con un algoritmo di stima della posizione ottimizzata, 3D-DyPLoT può agganciare di singole particelle con inseguimento ad alta velocità e precisione di localizzazione alta. Grazie alla singola eccitazione e la struttura dei percorsi sola rilevazione, 3D-DyPLoT è robusto e facile da configurare. Questo protocollo viene descritto come costruire 3D-DyPLoT passo per passo. In primo luogo, è descritto il layout ottico. Successivamente, il sistema è calibrato e ottimizzato da raster di scansione una perlina fluorescente di 190 nm con la nanopositioner piezoelettrico. Infine, per dimostrare la capacità di tracciatura in tempo reale 3D, perline fluorescenti di 110 nm sono tracciati in acqua.
Introduction
L'emergere di tecniche avanzate di imaging ha aperto una finestra per vedere la struttura sempre più dettagliata dei fenomeni cellulari, tutta la strada fino al livello molecolare. Metodi quali stocastici ricostruzione ottica microscopia (tempesta)1,2,3, foto-attivata localizzazione microscopia (PALM)4,5,6,7 , strutturato illuminazione microscopia (SIM)8,9,10,11e stimolato emissione svuotamento microscopia (STED)12,13, 14 vanno ben oltre il limite di diffrazione per consegnare un dettaglio senza precedenti nella struttura e nella funzione delle cellule vive. Tuttavia, la comprensione completa di come questi sistemi si comportano richiede informazioni dinamiche, nonché informazioni strutturali. I metodi di Super-risoluzione sopra elencati implicano un compromesso tra la risoluzione spaziale e temporale ad alta risoluzione, limitando la precisione temporale con cui possono essere sondati processi dinamici. Un metodo che fornisce sia alta precisione spaziale e temporale ad alta risoluzione è RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Qui, abbiamo una distinzione tra tradizionale 3D-SPT30 e RT-3D-TSS. tradizionale 3D-SPT richiede semplicemente una serie temporale di dati di immagine tridimensionale (che possono essere acquistati o utilizzando un microscopio confocale o un microscopio a epifluorescenza Data la configurazione giusta). In tradizionale 3D-SPT, le coordinate della particella sono determinate dopo la raccolta dei dati di individuazione della particella in ogni serie di immagini e concatenando le posizioni in volumi successivi a creare una traiettoria. Per questi metodi, l'ultima risoluzione temporale è determinata dal tasso di imaging volumetrico. Per microscopi confocali, questo è facilmente sulla scala dei secondi per decine di secondi. Per i metodi epifluorescenza, in cui il percorso ottico viene manipolato in modo che le informazioni di posizione assiale possono essere estratte, la risoluzione temporale è limitata con il tempo di esposizione o della lettura di fotocamera. Questi metodi di epifluorescente sono limitati nella gamma sopra cui assiale informazioni possono essere raccolte, anche se recenti progressi nella fase di Fourier aereo maschere design e ottica adattiva è allungabile questi intervalli di 10 µm o più31,32 , 33 , 34.
Al contrario, RT-3D-SPT non si basa su l'acquisizione di una serie di immagini 3D e trovare particelle dopo il fatto. Invece, informazioni sulla posizione in tempo reale viene estratta tramite rivelatori di singolo punto e feedback viene applicato in modo efficace "bloccare" la particella nel volume focale della lente dell'obiettivo attraverso l'uso di una fase piezoelettrico highspeed. Questo consente la misura continua della posizione della particella limitata solo da quanti fotoni possono essere raccolti. Inoltre, questo metodo consente spettrale interrogatorio della particella che si muove su lunghi tragitti. RT-3D-SPT in effetti funziona simile a una forza-libero ottica trappola per oggetti su scala nanometrica, in cui la particella è continuamente sondata e misurata in tempo reale senza la necessità di alimentazioni grandi laser o ottico le forze. Dato che RT-3D-SPT fornisce un mezzo per l'interrogatorio continuo di oggetti veloce diffusivo (fino a 20 µm2/s)25,29 in tre dimensioni a basso fotone conteggio tariffe20,29, 35, dovrebbe fornire una finestra in processi biologici veloci o transitori come trasporto cargo intracellulare, legame ligando-recettore e la dinamica extracellulare dei virions singolo. Tuttavia, a questo punto, l'applicazione di RT-3D-SPT è stato limitato per la manciata di gruppi di lavoro per far progredire questa tecnologia.
Una barriera è la complessità del layout ottico richieste dai metodi RT-3D-SPT, che sono di vario tipo. Per la maggior parte dei metodi, il feedback ottico è fornito da una fase piezoelettrica. Come il particella fa piccoli movimenti in X, Y, o Z, letture da singolo punto rilevatori vengono convertite in funzioni di errore e alimentato a ad alta velocità per un nanopositioner piezoelettrico, che a sua volta muove il campione per contrastare efficacemente il movimento della particella, bloccandola rispetto alla lente dell'obiettivo. Per misurare piccoli movimenti posizionali in X, Y e Z, o più rivelatori (4 o 5 a seconda dell'implementazione)15,18,21 o punti multipli dell'eccitazione (2-4, il più basso dei quali può essere applicato se una amplificatore di lock-in è utilizzato per estrarre X e posizione Y utilizzando un rotante laser spot)25,28 vengono applicate. La sovrapposizione di questi punti di rilevamento ed emissione multipli rendono difficile allineare e mantenere i sistemi.
Qui, presentiamo un metodo ad alta velocità 3D destinazione-bloccato-SPT con un design ottico semplificato denominato 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT utilizza un 2D-EOD e un TAG lente36,37,38 per spostare dinamicamente un punto laser focalizzato attraverso il volume focale obiettivo ad un ritmo elevato (50 kHz XY, 70 kHz Z). La posizione di messa a fuoco del laser e l'orario di arrivo del fotone la combinazione consente la posizione della particella 3D di ottenere rapidamente anche a tassi di conteggio basso del fotone. 2D-EOD spinge il fuoco del laser di un cavaliere tour modello39 con un quadrato di 1 x 1 µm nel piano X-Y e la lente di TAG si sposta il fuoco del laser in direzione assiale con una gamma di 2-4 µm. La posizione di particelle 3D si ottiene con una posizione ottimizzata stima algoritmo29,40 in 3D. Il controllo del 3D in modo dinamico movimento laser spot, fotone contando dal fotodiodo a valanga (APD), calcolo della posizione in tempo reale delle particelle, fase piezoelettrico feedback e registrazione dei dati vengono eseguite su un allineamento di cancello programmabile del campo (FPGA).In questo protocollo, descriviamo come costruire un microscopio 3D-DyPLoT passo dopo passo, compreso l'allineamento ottico, calibrazione con particelle fisse e finalmente libero il rilevamento di particelle. Come dimostrazione, perline fluorescenti di 110 nm sono stati monitorati continuamente in acqua per minuti alla volta.
Il metodo qui descritto è la scelta ideale per qualsiasi applicazione dove si desidera monitorare continuamente una sonda fluorescente veloci a bassi livelli di luce, tra cui virus, nanoparticelle e vescicole come gli endosomi. Contrariamente ai metodi precedenti, c'è solo una singola eccitazione e via sola rilevazione, rendendo semplice l'allineamento e la manutenzione. Inoltre, l'area di rilevamento grande consente questo microscopio raccogliere facilmente diffondere rapidamente le particelle, mentre la possibilità di monitorare a livello di segnale basso (fino a 10 kHz) rende questo metodo ideale per applicazioni di basso-luce29.
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Protocol
1. impostare il Layout e l'allineamento
- Installazione e collimazione dell'eccitazione rilevamento laser
- Apporre il laser alla tabella ottico usando un montaggio autocostruite. Il Monte è un piatto semplice in alluminio con fori per la testa del laser e la tabella ottica di montaggio. Il laser deve essere ben fissato a un supporto di metallo per stabilità e dissipazione del calore. Per questo lavoro, è necessario utilizzare un laser a stato solido 488 nm per l'illuminazione (Figura 1), anche se la lunghezza d'onda può essere selezionata per soddisfare un fluoroforo particolare o sperimentare. Un fattore critico è che la lunghezza d'onda laser corrispondono all'intervallo di lavoro 2D-EOD, che è determinata principalmente dalla piastra di onda tra i due deflettori (Figura 1: W2). Il laser di 488 nm efficacemente può eccitare il verde o gialla fluorescente proteine (GFP/YFP), che sono comuni tag fluorescente in esperimenti di cellule vive.
- Regolare l'altezza del fascio laser e la direzione utilizzando una coppia di specchi dielettrici (Figura 1: M). Assicurarsi che il raggio laser è parallelo alla tabella ottica e regolare a un'altezza adeguata.
Nota: L'altezza dovrebbe essere scelto sulla base della piattaforma di microscopio. Questa altezza deve essere mantenuta per tutte le successivi specchi utilizzati nel presente protocollo, anche se non sarà esplicitamente indicato. - Collimare il fascio con un paio di lenti (Figura 1: L1 e L2). Le lunghezze focali delle lenti dovrebbe essere scelta con attenzione per evitare il punto laser ritagliato dal diaframma di 2D-EOD. Ritaglio è evidente da un cambiamento della forma del fascio laser dopo aver attraversato il 2D-EOD. La qualità di collimazione qui è molto importante perché aberrazioni saranno amplificate mediante successivi lenti e qualsiasi divergenza si deteriora le prestazioni della deflessione 2D-EOD. Idealmente, collimare il fascio mettendo a fuoco il fascio a un punto di almeno 20 m di distanza.
- Posizionare un foro stenopeico (Figura 1: PH) di dimensioni adeguate al fuoco del primo obiettivo di collimazione (Figura 1: L1).
- Scegliere un foro stenopeico di dimensione appropriate. La dimensione del foro stenopeico può essere scelto in base al seguente calcolo:
Dove λ è la lunghezza d'onda del laser, f è la lunghezza focale della lente prima, e D è il diametro del fascio di input. - Montare il foro stenopeico su un palco di traslazione 3D in modo che può essere collocato proprio al centro della prima lente di collimazione.
- Regolare la posizione del foro stenopeico. Inserire un misuratore di potenza laser dopo il foro stenopeico e regolare la posizione del foro stenopeico in XYZ per massimizzare la lettura del misuratore di potenza. Se si osserva un anello di diffrazione, bloccarlo con un iride inserito prima il 2D-EOD.
- Scegliere un foro stenopeico di dimensione appropriate. La dimensione del foro stenopeico può essere scelto in base al seguente calcolo:
- Installazione di polarizzatore Glan-Thompson
- Mettere il polarizzatore Glan-Thompson (Figura 1: GP) dopo la seconda lente di collimazione (Figura 1: L2) per pulire la polarizzazione del fascio laser. Ruotare il polarizzatore per trovare la massima trasmissione con il misuratore di potenza.
- Installazione di EODs
- Utilizzare 2 EODs (Figura 1: EOD1 & EOD2) per deviare il laser nelle direzioni X e Y. Massimizzare la trasmissione laser regolando l'imbardata, beccheggio e altezza di ogni EOD.
- Allineare le due EODs rispetto a altro utilizzando il marcatore di allineamento fornito dal produttore sul lato di ogni deflettore.
- Applicare un modello di test al controller di 2D-EOD per esaminare l'output del EOD. Questo può essere tour il cavaliere del (Figura 2) tramite FPGA descritto di seguito o una semplice sinusoide fornita da un generatore di funzioni. Per prestazioni ottimali, la deflessione da ogni deflettore deve essere parallela alla direzione X o Y della nanopositioner piezo. Questa direzione è dettata dalla direzione angolare i deflettori attorno all'asse di trasmissione. Per ruotare la direzione di deflessione senza spostare il 2D-EOD, posizionare un prisma colomba dopo il 2D-EOD per allineare gli assi di flessione per gli assi di nanopositioner piezo.
- Installazione della piastra di mezza onda
- Posizionare un piatto semionda (Figura 1: W1) tra il polarizzatore Glan-Thompson (Figura 1: GP) ed il 2D-EOD per allineare il laser in arrivo polarizzazione del fascio con gli assi di deflessione del 2D-EOD. Posto una lunga focale (300mm) dopo il 2D-EOD e posto una fotocamera sCMOS presso il fuoco del laser. Successivamente, accendere l'EOD 2D per generare tour il cavaliere del descritto di seguito (Figura 2). Ruotare la piastra di mezza onda fino a quando si osserva una distribuzione di laser del quadrato in modo uniforme sulla fotocamera.
- Installazione di un fascio spendendo lente coppia e coppia di lente di relè
- Posto un paio di lenti (Figura 1: L3 e L4) dopo il 2D-EOD per espandere il raggio per riempire l'apertura posteriore dell'obiettivo (Figura 1: OL) e un altro paio di lenti (Figura 1: L5 e L6) per inoltro il piano focale dell'obiettivo del microscopio. Assicuratevi di lasciare abbastanza spazio tra queste due coppie di lenti come la lente di TAG verrà installata tra di loro in un passaggio successivo.
- Installare il filtro dicroico, divisore di fascio 10/90, messa a fuoco lente, APD, obiettivo e filtro di emissione di fluorescenza per completare il percorso di rilevamento.
- Installare il filtro dicroico (Figura 1: DC) per riflettere il laser verso la lente dell'obiettivo. Allineare il laser per andare dritto attraverso il centro della lente dell'obiettivo utilizzando due iridi sulla parte superiore e inferiore di un tubo di obiettivo a lungo.
- Installare un divisore di fascio 10/90 (Figura 1: BS) da cui il 10% della luce è riflessa per l'imaging da un sCMOS fotocamera (descritta sotto) e il 90% di passa attraverso per l'APD per l'inseguimento.
- Allineare l'APD. Mettere a fuoco il laser su un vetrino coprioggetti la lente dell'obiettivo. Utilizzare la riflessione dal coprioggetto per allineare gli elementi tutti a valle mettendo un vetrino coprioggetto al fuoco oggettivo e controllando l'intensità della lettura APD. Dopo il divisore di fascio, installare l'APD lente di messa a fuoco (Figura 1: L7) seguita da APD su un palco di traslazione 3D. Posizionare la lente in modo tale che la riflessione laser dall'obiettivo passa attraverso il centro della lente.
- Posizionare la lente a TAG tra le due coppie di lenti (tra Figura 1: L4 e L5) come accennato prima ed è mostrata nella Figura 1. Regolare l'imbardata, beccheggio, altezza e posizione laterale in modo che il fascio passa perpendicolarmente attraverso la lente del centro di TAG.
2. preparazione del campione.
- Preparazione delle particelle fisse
- Diluire 190 perline fluorescenti nm a ~ 5 × 108 perline/mL in PBS. Aggiungere 400 µ l di soluzione di perline su di un vetrino coprioggetto e montare il supporto del campione della fase piezoelettrica (il volume di perline dipenderà molto il portacampioni; il diametro della camera di supporto del campione utilizzato qui è di 18 mm). Per le perline usate qui, PBS fa sì che le particelle a depositare il coprivetrino.
- Preparazione delle particelle movimento libero
- Diluire 110 perline fluorescenti nm a ~ 5 × 108 perline/mL con acqua deionizzata. Aggiungere 400 µ l di soluzione di perline su un vetrino coprioggetto e montare sul supporto del campione della fase piezoelettrica.
3. ottimizzare i parametri di verifica dei
- Scansione raster fissata particelle
- Mettere un campione di particelle fisse sul microscopio.
- Accendere il laser, micropositioner controller, controller di nanopositioner di piezo, controllo lenti TAG e controller di EOD. Si noti che l'ordine non è critico. Eseguire il nanopositioner piezo in circuito chiuso.
- Raster esplorare il campione in XYZ utilizzando un programma personalizzato di software scansione (Figura S3, il software disponibile su richiesta da parte degli autori), che spinge il 2D-EOD in tour di un cavaliere (Figura 2), raccoglie i conteggi da APD, spinge il piezo nanopositioner ed esegue il calcolo della posizione (Figura S2). La dimensione del passo è di 40 nm e l'intervallo di scansione è di 2 µm.
- Per posizionare il vetrino coprioggetto al fuoco dell'obiettivo, rimuovere il filtro di emissione di fluorescenza e utilizzare la riflessione del laser dal coprioggetto per massimizzare l'intensità del segnale in funzione della posizione Z della micropositioner. Dopo aver posizionato il campione al piano focale, riposizionare il filtro di emissione di fluorescenza.
- Aprire il programma di scansione. Impostare l'intervallo di scansione e dimensione del passaggio digitando il numero in 'start', 'fine' e 'passo'. Prima di impostare un grande intervallo di scansione e le dimensioni di passo per individuare una particella (ad esempio, 10 x 10 µm gamma con dimensioni di passaggio 200 nm). Dopo aver trovato la particella, ridurre l'intervallo di scansione e diminuire la dimensione di passaggio (ad esempio, 2 x 2 µm gamma con dimensioni di passo 100 nm). Fare clic sul pulsante 'scansione' per eseguire una scansione 3D raster per trovare la messa a fuoco fluorescente.
- Impostazioni di lente di TAG (Vedi anche Figura 3)
- Scegliere il software di controllo di TAG lente. In sequenza, fare clic su 'connect', 'accendere'.
- Per modificare la fase di uscita dei segnali trigger, è necessario modificare la modalità di trigger di uscita. Prima di cambiare la modalità da 'RGB' a 'Multiplane' e poi cambiare di nuovo. Ora la fase può essere cambiato (Figura 3b).
- Impostare la fase di uscita da 0 °, 90 ° e 270 °. Mentre possono essere utilizzate qualsiasi tre fasi che coprono lo spazio delle fasi, questi tre sono trovati a lavorare bene empiricamente (Figura 3C).
- Selezionare l'impostazione di frequenza Hz 68.500.
- Per trovare la frequenza ottima è spesso necessario cambiare la frequenza di ricerca. Fare clic su 'avanzate', 'impostazioni'. Cambiamento del ' Max. Freq (hertz) ' della colonna 0 da 70.000 Hz a 71.500 Hz. Questo può essere regolato a qualsiasi gamma di frequenza è appropriato. Fare clic su 'Salva calibrazione', 'uscita calibrazione' (figura 3d).
- Per rendere effettiva la nuova taratura, passare la risonanza su un'altra frequenza (ad esempio, 189.150 Hz) e quindi passa l'impostazione di frequenza Hz 68.500 (Figura 3e).
- Modificare l'ampiezza gradualmente al 35%. Fare clic su 'Blocca risonanza'. Dopo la frequenza è bloccata, fare clic su 'Sbloccare risonanza' (Figura 3e). La lente di TAG è pronta per l'uso in questo momento.
- Per calibrare, modificare i parametri che vengono utilizzati nella stima per rendere la posizione stimata uguale alla posizione reale, come mostrato nella Figura 4e, f. Input la scansione intervallo di x, y e z e quindi fare clic su 'scansione' pulsante per esplorare il campione in XYZ per spostare il delle particelle attraverso il movimento spot laser. La posizione della particella come questa viene analizzata attraverso il fuoco del laser deve concordare con la posizione stimata della particella determinata dal ciclo di stima di posizione (Figura S1). Il rapporto tra la posizione stimata e la reale posizione (Figura 4D) possa essere estratti dalle immagini posizione stimata (Figura 4f). Se non si accettano le posizioni, regolare i valori di posizione del laser (ck) utilizzato nel ciclo di stima di posizione (Figura S1).
- Allineare la lente TAG
- Quando il controllo di lenti di TAG è disattivata, il raster scannerizzate delle particelle (descritta sotto) prelevati prima di installare la lente di TAG e dopo l'installazione prodotto TAG lente dovrebbe essere identico. Successivamente, eseguire dello stack fluorescente particella Z scansione spostando l'obiettivo con il nanopositioner di z per ottimizzare la posizione e l'angolazione dell'obiettivo di TAG (Figura 4). Regolare la posizione della lente TAG finché non ci sarà nessuna deriva nelle immagini delle particelle nel piano XY lungo la direzione Z, che è raggiunta quando non c'è alcun cambiamento nella posizione XY della particella in funzione della posizione Z (Figura 4D). Il sistema di tracciamento è pronto all'uso dopo l'allineamento dell'obiettivo TAG.
- Installazione della macchina fotografica di sCMOS per il monitoraggio delle particelle
- Installare una telecamera sCMOS per visualizzare le particelle mentre che vengono monitorati. Installare il sCMOS solo dopo che tutti i componenti del sistema di rilevamento sono stati installati e ottimizzati.
4. Real-Time Tracking 3D liberamente diffondere le nanoparticelle
- Mettere il 110 nm libero movimento campione di particelle sul microscopio.
- Accendere il laser, micro-posizionatore controller, controller di nanopositioner di piezo, controllo lenti TAG e controller di EOD. Eseguire il nanopositioner piezo in anello aperto. Impostare il software di lente di TAG secondo punto 3.2.
- Aprire ed eseguire il software di monitoraggio (disponibile su richiesta da parte degli autori). Impostare la posizione di parametri di stima i valori ottimizzati, che trovate nella sezione 3.
- Per posizionare il vetrino coprioggetto al fuoco dell'obiettivo, rimuovere il filtro di emissione di fluorescenza e utilizzare la riflessione del laser dal coprioggetto per massimizzare l'intensità del segnale in funzione della posizione Z della micropositioner. Dopo aver trovato il vetrino coprioggetto, aumentare la messa a fuoco posizione 15 µm per mettere a fuoco il laser lontano il vetrino coprioggetto e nella soluzione. Riposizionare il filtro di emissione di fluorescenza.
- Impostare le costanti di controllo integrale. Le costanti di controllo integrale possono essere impostate a partire da un valore basso e aumentando lentamente fino a quando le oscillazioni possono essere visto in letture di posizione della particella. Una volta si osservano oscillazioni, è possibile impostare le costanti di controllo integrale all'80% del valore causando le oscillazioni. Valori tipici sarà di circa 0,012 per il 'guadagno integrale' XY e 0,004 per Z 'guadagno integrale'.
- Impostare le soglie di rilevamento in «Soglia di pista» e «Track minimo» e iniziare l'esperimento di rilevamento facendo clic su 'Cerca' e 'Auto Track'. La soglia per il rilevamento di terminazione è impostata leggermente superiore al livello di sfondo e la soglia per l'innesco di rilevamento è circa due volte superiore rispetto allo sfondo. Qui, la soglia per l'innesco di rilevamento è 3kHz e la soglia per terminare la traiettoria è 1,5 kHz.
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Representative Results
Particella fissa scansione (Figura 4) e liberamente diffondente 110 nm fluorescente particella di rilevamento (Figura 5) sono stati effettuati seguendo il protocollo di cui sopra. La particella di scansione è stata eseguita spostando i fotoni piezoelettrici nanopositioner e bin mentre simultaneamente calcolo della particella stimato posizione ad ogni punto nella scansione. L'immagine di scansione mostra un quadrato di intensità anche (Figura 4a) e le posizioni stimate mostrano una relazione lineare con la posizione della particella reale sopra una gamma di µm di × 2 × 1 1 in x, y e z direzione (Figura 4b–f).
Per dimostrare l'inseguimento in tempo reale, particelle fluorescenti di 110 nm sono state registrate in acqua tramite 3D-DyPLoT (Figura 5a, b). L'analisi degli spostamenti (MSD) quadratico viene illustrato un tipico comportamento lineare caratteristico del moto browniano (Figura 5C). MSD l'analisi delle 30 traiettorie ha mostrato un diametro medio di idrodinamico di 110 nm, in buon accordo con le specifiche del produttore per le dimensioni delle nanoparticelle fluorescenti monitorate (Figura 5d). Inoltre, Movie 1 Mostra le letture in tempo reale nanopositioner piezoelettrico e sincronizzati sCMOS immagini per una 2 min e lunga traiettoria di una particella fluorescente di nm 110 liberamente diffondente.
Oltre ad essere in grado di monitorare con l'alta velocità, particelle in movimento lente possono essere localizzate con alta precisione. Figura 6a - d Mostra l'applicazione del sistema 3D-DyPLoT alle particelle fisse usando gli stessi parametri di feedback usato per l'alta velocità inseguimento, mostrando una precisione di 17,6, 26,4 e 53,4 nm in X, Y e Z, rispettivamente con tasso di conteggio del fotone di 105. Figura 6e - h Mostra la precisione sotto controllo di feedback ridotto di un fattore 10, efficacemente scambiando velocità per precisione ed esibendo una precisione pari a 6.5, 8,3 e 10.5 nm in X, Y e Z, rispettivamente.
Figura 1. Schematica del sistema di tracking 3D. 2D-EOD (EOD1 & EOD2) e la lente di TAG (TAG) deviare il laser lungo le direzioni x-y e Z, rispettivamente. L'APD (APD) viene utilizzato per raccogliere i fotoni di fluorescenza, che vengono inviati al FPGA (FPGA). FPGA è utilizzato per algoritmo di calcolo della posizione, fotone conteggio, controllo di 2D-EOD così come controllo e lettura del nanopositioner piezoelettrico (NSxy e NZz). Altri componenti etichettati nella figura: specchi (M); lenti (L #); pinhole (PH); Polarizzatore Glan-Thompson (GP); semionda piastra (W1); filtro dicroico (DC); lente obiettiva (OL, 100 X NA = 1.49); filtro di emissione di fluorescenza (F); divisore di fascio (BS); Fase di x-y micropositioner (MSxy); Fase di micropositioner Z (MSz). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Coordinate per tour il cavaliere del implementato in 3D-DyPLoT. Asse 1 e 2 devono essere allineate lungo l'asse X o Y di un allineamento corretto del 2D-EOD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Impostazioni del software lente TAG. Vedere la sezione 4.2 TAG lente per ulteriori informazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Stima di scansione e posizione della particella. (a) immagine di scansione di 190 fluorescente nm perline con 2D-EOD guida il laser in un 1 µm × 1 quadrato Modello tour del cavaliere. L'intensità di fluorescenza è denotato dal colore. Unità: kHz. (b) stima di xk, la posizione della particella rispetto al centro di 2D-EOD scansione in micrometri. Il colore in b, ce d denota la posizione stimata. Unità: µm. (c) stima di yk in micrometri. (d) la stima di zk, la posizione della particella rispetto al centro assiale della lente TAG scansione in micrometri. (e), stima delle particelle posizione yk in funzione della fase sulla posizione media l'intera griglia da (c). Si noti che la posizione della particella stimato acquistata dall'algoritmo di stima della posizione (yk) concorda con la posizione reale. posizione (f), stima delle particelle posizione zk in funzione della fase media l'intera griglia da (d). La posizione stimata Mostra una relazione lineare con la reale posizione della particella in 1 × 1 × 2 µm range nella direzione X, Y e Z. Si noti che la posizione della particella stimato acquistata dall'algoritmo di stima della posizione (zk) concorda con la posizione reale. La posizione stimata Mostra una relazione lineare con la reale posizione della particella in un 1 × 1 × 2 µm range nella X, Y e Z direzione. Scala bianca bar a (un–c) rappresentano 500 nm e la barra della scala nera (d) rappresenta 2 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 5.Monitoraggio delle particelle fluorescenti di 110 nm in acqua con 3D-DyPLOT. (un) 3D traiettoria di una nanoparticella fluorescente per 110 nm liberamente diffondente in acqua. (b) intensità di fluorescenza in funzione del tempo per la traiettoria in (un). (c) MSD della traiettoria in (un). La linea blu è il MSD misurato, mentre la linea rossa tratteggiata è la retta di regressione da regressione lineare. (d), MSD analisi delle 30 traiettorie, mostrando un diametro medio di idrodinamico di 110 nm, in buon accordo con le dimensioni delle nanoparticelle fluorescenti monitorate. Il diametro delle particelle è stato calcolato utilizzando la relazione di Stokes-Einstein. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 6. Precisione della particella fissa tracking. (un) A fissa particella viene rilevata da 3D-DyPLoT al prezzo di conteggio differente. La precisione è in X (b) 17,6 nm, (c) 26,4 nm in Y e (d) 53,4 nm in Z a un tasso di emissione di 100 kHz. (e) quando sondaggio processi più lenti, il controllo di feedback costante (Kmi) può essere ridotto di un fattore 10 per aumentare la precisione. Con questo controllo di feedback ridotta, la precisione è in X (f) 6.5 nm, (g), 8,3 nm in Y e (h) 10,5 nm in Z a un tasso di emissione di 100 kHz. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura S1. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Figura S2. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Figura S3. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Informazioni supplementari. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Anche se molte varietà di 3D singola particella metodi di monitoraggio sono emerse negli ultimi anni, robusto tracking in tempo reale di diffusione 3D ad alta velocità al prezzo di conteggio basso del fotone con un semplice programma di installazione è ancora una sfida, che limita la sua applicazione al biologico importante problemi. Il metodo 3D-DyPLoT descritto in questo protocollo indirizzi queste sfide in vari modi. In primo luogo, le vie di eccitazione e di rilevamento vengono semplificate notevolmente rispetto ad altre implementazioni l'allineamento semplice e robusto. In secondo luogo, il movimento spot laser e algoritmo di stima della posizione forniscono stime di posizione precisa per il circuito di retroazione, rendendo più stabile il feedback. In terzo luogo, la gamma di rilevamento efficacemente grandi (1 x 1 x 4 µm) dello spot laser in modo dinamico movimento permette per il rilevamento di particelle in movimento veloce. Per capire perché questa zona di rilevamento grande è critica, è importante considerare il tempo di risposta intrinseco della nanopositioner piezoelettrico. Fasi piezoelettrico ad alta velocità hanno risonanze dell'ordine di 1 kHz, limitando il tempo di risposta per essere dell'ordine di 1 ms. In 1 ms, una nanoparticella di 100 nm con un coefficiente di diffusione di 4 µm2/s, si diffonderà in media 90 nm dal centro della diffrazione-li volume di rilevamento limitata. Questo è solo la media cilindrata e moto veramente casuale esporrà passaggi molto più grande di questo, che conduce alla particella lasciando il volume focale e termina la traiettoria attuale. La situazione è ancora peggiore per le particelle più piccole, dove sempre più grandi termiche diffusive gradini conducono alla perdita di rilevamento. L'area di rilevamento efficacemente grandi permette al sistema di tracciamento superare intrinseca piezoelettrico fase lag e recuperare da grandi salti diffusivi nella posizione della particella, aumentando la robustezza complessiva del meccanismo di rilevamento. Infine, l'area di scansione grande consente al sistema di facilmente raccogliere nuove particelle, permettendo traiettorie consecutive per essere acquisito rapidamente e grandi insiemi di dati compilati.
L'utente deve tenere a mente che ci sono alcuni passaggi critici. In primo luogo, l'allineamento di sia il 2D-EOD e la lente di TAG sono fondamentali. Entrambi devono essere ben allineati per ottenere la precisione ottima. In secondo luogo, i parametri che vengono utilizzati nella stima posizione della particella fisso passo di scansione devono essere ben calibrati (vedere Figura 4). La posizione stimata della particella deve corrispondere la posizione della particella corrispondente al centro del campo di scansione laser. Infine, le costanti integrali di feedback (Kio) devono essere ottimizzate con attenzione, iniziando con un piccolo valore e poi dilagare fino a quando non si osservano oscillazioni, poi tornando indietro per circa l'80% di tale valore.
Ci sono alcune avvertenze su 3D-DyPLoT da tenere a mente a seconda dell'applicazione desiderata. Mentre la stima di posizione ottimizzata è progettata per uso con moto browniano, è anche ben adatto verso movimento direzionale. L'algoritmo può essere applicato direttamente a qualsiasi tipo di movimento, dato che è solo l'incertezza di posizione che si presume per essere gaussiana, non la posizione reale della particella. Per i casi in cui è previsto il persistente movimento lineare, un termine supplementare può essere aggiunto al termine di previsione nell'algoritmo di stima di posizione (Vedi equazione 3 nelle Informazioni supplementari).
La selezione dei parametri per il 2D-EOD e TAG deve essere considerata attentamente quando si imposta il 3D-DyPLoT. Di particolare importanza è la volta di bin usato per tour del cavaliere analizzati da 2D-EOD. In uno scenario ideale, tour il cavaliere del sarebbe essere sincronizzato al periodo della lente TAG affinché efficiente di campione. Tuttavia, è fondamentale considerare il tempo di risposta di 2D-EOD a variazioni di tensione di passo. Per l'unità utilizzata qui, c'è un tempo di risposta di 2-3 µs dopo la tensione è applicata prima che venga raggiunto il punto desiderato. Alle 20 µs bin tempo, questo è circa il 10-15% del tempo insieme. Riducendo il tempo in modo che corrisponda il periodo di obiettivo di TAG di ~ 14 µs aumenta la frazione del tempo bin, che è il tempo di ritardo di 2D-EOD. Questo porta a valori non corretti della posizione laser e posizione scorretta stime.
Un altro fattore per lo sperimentatore da tenere a mente è la risoluzione temporale. Mentre i dati qui presentati sono raccolti a una velocità dati di 100 kHz, l'ultima risoluzione temporale è definita in ultima analisi, mediante il quale i dati sono utilizzati per la misura della posizione. Se la lettura del nanopositioner viene utilizzata come posizione della particella (Figura 6), la risoluzione temporale dipenderà il valore della costante controllo integrale. Ad esempio, per il controllo integrale mostrato in Figura 6a–d, la risposta di fase è dell'ordine di 1 ms, mentre per Figura 6e–h, è dell'ordine di 10 ms se si desidera più veloce risoluzione temporale, poi la fotone-di-fotone risultato dell'algoritmo di stima di posizione mette in correlazione con il tasso di conteggio del fotone. Ad esempio, un tasso di emissione di 10 kHz rese 100 µs risoluzione temporale e di un tasso di emissione di 100 kHz una risoluzione temporale di 10 µs. Inoltre, poiché la precisione segue un 
rapporto41, la precisione spaziale e temporale sono accoppiati. Di conseguenza, la luminosità della sonda determina sia la precisione spaziale e temporale.
In questo protocollo abbiamo descritto l'installazione, il layout e l'allineamento di una particella singola 3D in tempo reale ad alta velocità inseguimento del metodo che utilizza un 2D-EOD e lente di TAG per spostare dinamicamente un punto laser focalizzato per ottenere la stima di posizione rapida delle particelle. Abbiamo poi descritto metodi di ottimizzazione di parametro e di preparazione del campione. 3D-DyPLoT fornisce un metodo relativamente semplice e robusto a lock-on allo spostamento veloce e umile che emettono particelle diffusive. Il layout ottico semplice permette di aggiungere facilmente sul lato-porto di qualsiasi microscopio stand esistente in modo che potrebbe essere combinato con moduli di formazione immagine. Con questo protocollo, ci auguriamo che RT-3D-SPT può essere che più ampiamente implementato da più ricercatori di affrontare velocemente, tre dimensionali processi biologici.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto numero premio R35GM124868 e dalla Duke University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2D Electro-optic Deflector | ConOptics | M310A | 2 required |
| Power supply for EOD | ConOptics | 412 | Converts FPGA ouput to high voltage for EOD |
| TAG Lens | TAG Optics | TAG 2.0 | Used to deflect laser along axial direction |
| XY piezoelectric nanopositioner | MadCity Labs | Nano-PDQ275HS | Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in |
| Z piezoelectric nanoposiitoner | MadCity Labs | Nano-OP65HS | Used to move the objective lens to follow the diffusing particle |
| Micropositioner | MadCity Labs | MicroDrive | Used to coarsely position sample and evaluate |
| Objective Lens | Zeiss | PlanApo | High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss |
| sCMOS camera | PCO | pco.edge 4.2 | Used to monitor the particle's position |
| APD | Excelitas | SPCM-ARQH-15 | Lower dark counts beneficial |
| Field programmable gate array | National Instruments | NI-7852r | |
| Software | National Instruments | LabVIEW | |
| Tracking excitation laser | JDSU | FCD488-30 | |
| Lens | ThorLabs | AC254-150-A-ML | L1 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L2 |
| Pinhole | ThorLabs | P75S | PH |
| Glan-Thompson Polarizer | ThorLabs | GTH5-A | GT |
| Half-wave plate | ThorLabs | WPH05M-488 | WP |
| Lens | ThorLabs | AC254-75-A-ML | L3 |
| Lens | ThorLabs | AC254-250-A-ML | L4 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L5 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L6 |
| Dichroic Mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | DC |
| Fluorescence Emission Filter | Chroma | D535/40m | F |
| 10/90 beamsplitter | Chroma | 21012 | BS |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| 190 nm fluorescent nanoparticles | Bangs laboratories | FC02F/9942 | |
| 110 nm fluorescent nanoparticles | Bangs laboratories | FC02F/10617 | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-545A | |
| Powermeter | Thorlabs | PM100D | |
| CMOS | Thorlabs | DCC1545M | |
| Iris | Thorlabs | SM1D12D | |
| Microscope | Mad City Labs | RM21 |
References
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat. Methods. 5 (5), 417 (2008).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044 (2011).
- Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6 (5), 339 (2009).
- Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED). Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).
- Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Welsher, K., Yang, H. Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles. Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).
- Welsher, K., Yang, H. Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy. Faraday Discuss. 184 (0), 359-379 (2015).
- Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking. J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).
- Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles. Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).
- Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts. Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901 (2006).
- Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions. ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).
- Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells. Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).
- Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. Three-dimensional tracking of individual quantum dots. Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).
- McHale, K., Mabuchi, H. Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope. Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).
- McHale, K., Mabuchi, H. Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm. J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).
- McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking. Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).
- Juette, M. F., Bewersdorf, J. Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution. Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).
- Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking. ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).
- Perillo, E. P., Liu, Y. -L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -K., Hung, M. -C., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, (2015).
- Hou, S., Lang, X., Welsher, K. Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot. Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).
- Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).
- Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions. Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).
- Lee, H. -lD., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision. Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701 (2012).
- Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).
- Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges. Optica. 4 (3), 367-373 (2017).
- Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606 (2017).
- Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing. Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).
- Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics. BIOMEDO. 17 (5), (2012).
- Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens. Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).
- Wang, Q., Moerner, W. E. Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap. Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).
- Fields, A. P., Cohen, A. E. Optimal tracking of a Brownian particle. Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
