Summary
Detta protokolldetaljer byggande och drift av ett realtid 3D enda partikel spårning Mikroskop kan spårning nanoskala fluorescerande sonder på höga diffus hastigheter och låga fotonen räkna priser.
Abstract
Realtid tredimensionella enda partikel spårning (RT-3D-SPT) har potential att belysa snabb, 3D processer i cellulära system. Även om olika RT-3D-SPT metoder har föreslagits under de senaste åren, fortfarande spårning hög hastighet 3D sprida partiklar vid låg fotonen räkna priser en utmaning. Dessutom är RT-3D-SPT uppställningar i allmänhet komplexa och svåra att genomföra, att begränsa deras utbredd tillämpning på biologiska problem. Detta protokoll presenterar ett RT-3D-SPT-system som heter 3D dynamiska Photon lokalisering spårning (3D-DyPLoT), som kan spåra partiklar med hög diffus hastighet (upp till 20 µm2/s) vid låg fotonen räkna priser (ned till 10 kHz). 3D-DyPLoT sysselsätter en 2D Elektro-optisk deflektor (2D-EOD) och en avstämbara akustiska gradient (TAG) lins att köra en enda fokuserad laser plats dynamiskt i 3D. I kombination med en optimerad position uppskattning algoritm, kan 3D-DyPLoT låsa på enstaka partiklar med hög avläsningshastighet och hög lokalisering precision. På grund av den enda excitation och enda upptäckt sökväg layout är 3D-DyPLoT robust och lätt att ställa in. Detta protokoll diskuterar hur man bygger 3D-DyPLoT steg för steg. Först beskrivs den optiska layouten. Nästa, systemet är kalibrerad och optimerad av raster skanning en 190 nm fluorescerande pärla med den piezoelektriska nanopositioner. Slutligen, för att visa realtids-3D spårning förmåga, 110 nm fluorescerande pärlor spåras i vatten.
Introduction
Uppkomsten av avancerade bildgivande tekniker har öppnat ett fönster för att se allt mer detaljerad struktur av cellulära fenomen, ända ner till molekylnivå. Metoder såsom stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi (STORM)1,2,3, Foto-aktiverat lokalisering mikroskopi (PALM)4,5,6,7 , strukturerade belysningen mikroskopi (SIM)8,9,10,11och stimulerat utsläpp utarmning mikroskopi (STED)12,13, 14 har gått långt utöver den diffraktionsgränsen att leverera oöverträffad detaljrikedom i struktur och funktion av levande celler. Fullständig förståelse av hur dessa system beter sig kräver dock dynamisk information samt strukturell information. De super-upplösning metoderna ovan innebära en kompromiss mellan rumslig upplösning och temporal upplösning, att begränsa den tidsmässiga precision som dynamiska processer kan bli utforskad. En metod som ger både hög rumsliga och temporal upplösning är RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Här, vi göra en åtskillnad mellan traditionella 3D-SPT30 och RT-3D-sömlösa rör traditionell 3D-SPT kräver helt enkelt en tidsserie av tredimensionell bilddata (som kan förvärvas antingen med en confocal Mikroskop eller ett epifluorescensmikroskop ges rätt konfigurationen). I traditionella 3D-SPT bestäms koordinaterna för partikeln efter insamling av data genom att lokalisera partikeln i varje bildstapel och sammanfoga platserna i successiva volymer att skapa en bana. För dessa metoder bestäms den ultimata temporal upplösningen av den volymetriska imaging hastigheten. För confocal Mikroskop är detta enkelt på skalan av sekunder till tiotals sekunder. För epifluorescence metoder, vari den optiska vägen är manipulerad så att axiell platsinformation kan utvinnas, begränsas den temporal upplösningen kamera exponering eller avläsning tiden. Dessa epifluorescerande metoder är begränsade i intervallet över vilka axiella information kan samlas in, även om nyare framsteg i Fourier planet fas masker design och adaptiv optik är att utvidga dessa spänner till 10 µm eller mer31,32 , 33 , 34.
RT-3D-SPT förlitar sig däremot inte på att förvärva en 3D bildstapel och hitta partiklar i efterhand. Istället realtid platsinformation utvinns via enda punktdetektorer och feedback tillämpas effektivt ”låsa” partikeln i focal volymen av objektivets mål med hjälp av en highspeed piezoelektriska scenen. Detta tillåter kontinuerlig mätning av den partikelns position begränsas endast av hur många fotoner kan samlas. Dessutom kan denna metod spektrala förhör av partikel när den rör sig över långa spänner. RT-3D-SPT i kraft verk liknar en tvinga-fria optiska svällning för nanoskala objekt, vari partikeln kontinuerligt utforskad och mätas i realtid utan behov av stora laser befogenheter eller optiska styrkor. Med tanke på att RT-3D-SPT ger möjlighet att fortlöpande förhör av snabbt diffus objekt (upp till 20 µm2/s)25,29 i tre dimensioner låg fotonen räkna priser20,29, 35, bör det ge ett fönster in i snabb eller övergående biologiska processer såsom intracellulära frakttransporter, ligand-receptorbindning och enda virioner extracellulära dynamik. Dock till denna punkt, har tillämpningen av RT-3D-SPT begränsats till handfull grupper som arbetar för att främja denna teknik.
Ett hinder är komplexiteten i den optiska layout som krävs av RT-3D-SPT metoder, som är varierande. För de flesta metoder ges den optiska feedbacken av en piezoelektrisk scenen. Som gör små partikelförehavanden i X, Y, eller Z, avläsning från enda punktdetektorer konverteras till fel funktioner och utfodras på höghastighetståg till en piezoelektriska nanopositioner, som i sin tur flyttar provet att motverka den partikelns rörelse, effektivt låsa den på plats i förhållande till objektivet. Att mäta små positionella rörelser i X, Y och Z, antingen flera detektorer (4 eller 5 beroende på genomförandet)15,18,21 eller flera excitation ställen (2-4, lägre som kan tillämpas om en låsa in förstärkaren används för att extrahera X och Y-position med hjälp av en roterande laser spot)25,28 tillämpas. Överlappningen av dessa flera upptäckt och utsläpp fläckar göra systemen svårt att justera och underhålla.
Häri, presenterar vi en höghastighets mål-låst 3D-SPT metod med en förenklad optisk design som kallas 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT använder en 2D-EOD och en TAG linsen36,37,38 dynamiskt flytta en fokuserad laser plats genom objektiva fokal volymen i hög hastighet (50 kHz XY, 70 kHz Z). Att kombinera laser fokus position och photon ankomsttid kan partikelns 3D-position att erhållas snabbt även vid låga fotonen räkna priser. Den 2D-EOD driver laser fokus i en riddares tur mönster39 med en kvadrat med storleken 1 x 1 µm i X-Y-planet och TAG linsen flyttas laser fokus i axiell riktning med en rad 2-4 µm. 3D partikel position erhålls med en optimerad position uppskattning algoritm29,40 i 3D. Kontroll av 3D dynamiskt rörliga laser plats, fotonen räkna från avalanche fotodiod (APD), realtid partikel ställning beräkningen, piezoelektriska scen feedback och dataregistrering utförs på en field programmable gate array (FPGA).I detta protokoll, vi beskriver hur man bygger en 3D-DyPLoT Mikroskop steg för steg, inklusive optisk justering, kalibrering med fasta partiklar, och slutligen gratis partikel spårning. Som en demonstration spårades 110 nm fluorescerande pärlor kontinuerligt i vatten för minuter i taget.
Den metod som beskrivs häri är ett idealiskt val för alla program där det är önskvärt att kontinuerligt övervaka en snabbrörliga fluorescerande sond vid låga ljusnivåer, inklusive virus, nanopartiklar och blåsor som endosomes. Till skillnad från tidigare metoder finns det bara en enda excitation och enda upptäckt väg, att göra justering och underhåll enkelt. Dessutom kan stort detekteringsområdet detta Mikroskop för att enkelt plocka upp snabbt sprida partiklar, medan förmågan att spåra på låga signalnivåer (ned till 10 kHz) gör denna metod idealisk för svagt ljus program29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konfigurera Layout och anpassning
- Installation och collimationen av spårning magnetiseringen laser
- Anbringa lasern till tabellen optiska använder en hembyggda mount. Fästet är en enkel aluminiumplåt med monteringshål för laserhuvudet och tabellen optiska. Lasern ska sättas fast ett metallfäste för stabilitet och värmeavledning. För detta arbete, använda en 488 nm halvledar-laser för belysning (figur 1), även om våglängden kan väljas för att passa en viss fluorophore eller experimentera. En avgörande faktor är att laser våglängd passar 2D-EOD arbetsområde, som bestäms främst av våg plattan mellan två avvisare (figur 1: W2). 488 nm laser kan effektivt exciterar det gröna eller gula fluorescerande protein (GFP/YFP), som är gemensamma fluorescerande Taggar i levande cell experiment.
- Justera laser beam höjd och riktning med hjälp av ett par dielektriska speglar (figur 1: M). Kontrollera att laserstrålen är parallell till tabellen optiska och justera den till lämplig höjd.
Obs: Höjd bör väljas utifrån den Mikroskop plattformen. Denna höjd bör bibehållas för alla efterföljande speglarna som används i detta protokoll, även om det inte anges uttryckligen. - Collimate balken med ett par linser (figur 1: L1 och L2). Brännvidderna av linser bör väljas noggrant undvika laser plats är klippt av bländare på den 2D-EOD. Klippning är uppenbart av en förändring i laser beam formen efter passerar genom den 2D-EOD. Kvaliteten på collimation här är mycket viktigt eftersom avvikelser kommer att förstärkas av efterföljande linser och eventuella avvikelser kommer att försämras prestanda för 2D-EOD omläggning. Helst collimate strålen genom att fokusera strålen till en punkt minst 20 m bort.
- Placera ett hål (figur 1: PH) av lämplig storlek i fokus för första collimation linsen (figur 1: L1).
- Välj en lämplig storlek hål. Pinhole storlek kan väljas utifrån följande beräkning:
Där λ är våglängden av laser, f är den första linsen brännvidd, och D är ingående beam diameter. - Montera pinhole på en 3D-förflyttningsverktyget scenen så att den kan placeras just i fokus för första collimation linsen.
- Justera positionen av pinhole. Placera en laser kraftmätare efter pinhole och justera pinhole positionen i XYZ att maximera mätaren styrkan. Om en diffraktion ring observeras, blockera det med en iris som placeras framför den 2D-EOD.
- Välj en lämplig storlek hål. Pinhole storlek kan väljas utifrån följande beräkning:
- Installation av Glan-Thompson polarisator
- Sätta Glan-Thompson polarisationsfiltret (figur 1: GP) efter andra collimation linsen (figur 1: L2) att rengöra polariseringen av laserstrålen. Rotera polarisator för att hitta maximal överföring med wattmetern.
- Installation av EODs
- Använda 2 EODs (figur 1: EOD1 & EOD2) att avleda lasern i X och Y riktning. Maximera laser överföringen genom att justera den yaw, tonhöjd och höjden på varje EOD.
- Rikta in de två EODs förhållande till varandra med justering märkpenna som tillhandahålls av tillverkaren på sidan av varje deflektor.
- Applicera ett testmönster till regulatorn av den 2D-EOD att inspektera resultatet av EOD. Detta kan antingen vara Riddarens turné (figur 2) via den FPGA som beskrivs nedan eller en enkel sinusvåg som tillhandahålls av en funktionsgenerator. För bästa prestanda, ska omläggning av varje deflektor vara parallell till antingen X eller Y riktning av den piezo nanopositioner. Denna riktning styrs av avvisare om överföring axeln kantiga riktning. Om du vill rotera nedböjning riktningen utan att flytta den 2D-EOD, placera en duva Prisma efter den 2D-EOD att anpassa nedböjning axlarna till piezo nanopositioner axlarna.
- Installation av halv-wave plattan
- Placera en halv-wave tallrik (figur 1: W1) mellan Glan-Thompson polarisationsfiltret (figur 1: GP) och den 2D-EOD att anpassa inkommande laser beam polarisering med utböjning axlarna av den 2D-EOD. Placera en lång brännvidd objektivet (300 mm) efter den 2D-EOD och placera en sCMOS kamera på laser focus. Nästa, aktivera den 2D-EOD att generera Riddarens turné beskrivs nedan (figur 2). Rotera den halv-wave plattan tills en jämnt fyrkantig laser fördelning observeras på kameran.
- Installation av en balk spilla objektiv par och relä objektiv par
- Placera ett par linser (figur 1: L3 och L4) efter de 2D-EOD att expandera balken för att fylla tillbaka bländaren på objektivet (figur 1: OL) och ett annat par linser (figur 1: L5 och L6) till Relay fokalplanet för målet med Mikroskop. Glöm inte att lämna tillräckligt med utrymme mellan dessa två par av linser som TAG linsen kommer att installeras mellan dem i ett senare steg.
- Installera den dikroiskt filter, 10/90 stråldelare, fokusera linsen, APD, objektiv och fluorescens utsläpp filter för att slutföra upptäckten smittvägen.
- Installera dikroiskt filter (figur 1: DC) att reflektera lasern mot objektivet. Rikta in lasern att gå rakt genom centrum av objektivets mål med två Iris på toppen och botten av en lång lins tub.
- Installera en 10/90 stråldelare (figur 1: BS) av vilka 10% av ljuset reflekteras för avbildning av en sCMOS kamera (beskrivs nedan) och 90% av passerar genom att APD för spårning.
- Justera APD. Fokusera lasern på ett täckglas av objektivet. Använda reflektion från täckglaset för att justera alla efterföljande element genom att sätta ett täckglas på objektiva fokus och kontrollera intensiteten i APD utläsningen. Efter stråldelare, installera den APD fokusera linsen (figur 1: L7) följt av APD på en 3D-förflyttningsverktyget scen. Placera linsen så att laser reflektion från målet går genom centrum av linsen.
- Placera etiketten linsen mellan de två par linser (mellan figur 1: L4 och L5) som nämnts innan och visas i figur 1. Justera yaw, pitch, höjd och sidoläge så att strålen passerar vinkelrätt genom centrum av TAG linsen.
2. provberedning.
- Fast partikel förberedelse
- Späd 190 nm fluorescerande pärlor till ~ 5 × 108 pärlor/mL i PBS. Tillsätt 400 µL pärlor lösning på ett täckglas och mount prov innehavaren av piezoelektriska scenen (volymen av pärlor kommer att bero på provhållaren; diametern på prov innehavaren kammaren används här är 18 mm). För pärlor används här, orsakar PBS partiklarna att deponera på täckglaset.
- Gratis rörliga partikel förberedelse
- Späd 110 nm fluorescerande pärlor till ~ 5 × 108 pärlor/mL med avjoniseratvatten. Tillsätt 400 µL pärlor lösning på ett täckglas och montera på provhållaren piezoelektriska scenen.
3. optimera spårning parametrar
- Raster scan fasta partiklar
- Sätta en fast partikel prov på mikroskopet.
- Slå på den laser, micropositioner controller, piezo nanopositioner controller, TAG linsen controller och EOD controller. Observera att ordningen inte är kritiska. Kör den piezo nanopositioner i slutna.
- Raster Skanna provet i XYZ använder en anpassad scanning-programvara-program (Figur S3, programvara tillgänglig på begäran från författarna), som driver den 2D-EOD i en Riddarens turné (figur 2), samlar in räknas från APD, driver piezo nanopositioner, och utför position beräkning (Figur S2). Stegstorlek är 40 nm och skanning intervallet är 2 µm.
- För att placera täckglaset i fokus för målet, ta bort filtret fluorescens utsläpp och använda reflektion av laser från täckglaset för att maximera signal intensiteten som en funktion av micropositioner Z ställning. Efter att placera provet i fokalplanet, placera tillbaka filtret fluorescens utsläpp.
- Öppna skanningsprogram. Ställ in skanning utbud och stegstorlek genom att skriva numret i 'start', 'Avsluta' och 'steg'. Först ställa en stor skanning utbud och stegstorlek att lokalisera en partikel (t.ex., 10 x 10 µm utbud med 200 nm stegstorlek). Efter att hitta partikeln, krympa skanning intervallet och minska stegstorlek (t.ex., 2 x 2 µm sortiment med 100 nm stegstorlek). Klicka på knappen 'scan' för att utföra en 3D raster genomsökning för att finna den fluorescerande fokus.
- TAG lins inställningar (se även figur 3)
- Klicka på TAGGEN objektiv kontroll mjukvaran. Klicka på 'connect', 'power på' sekventiellt.
- För att ändra fasen utdata utlösa signaler, är det nödvändigt att ändra det utgående trigger-läget. Först ändra läge från 'RGB' till 'Multiplane' och sedan ändra tillbaka. Nu fasen kan ändras (figur 3b).
- Ange fasen produktionen att vara 0 °, 90 ° och 270 °. Medan alla tre faser som täcker fas utrymmet kan användas, dessa tre finns för att arbeta väl empiriskt (figur 3 c).
- Välj inställningen 68,500 Hz frekvens.
- För att hitta den optimala frekvensen är det ofta nödvändigt att ändra Sök frekvensområdet. Klicka på 'Avancerat', 'ställa in'. Ändra den ' Max. FREQ(Hz)' av kolumn 0 från 70 000 Hz till 71,500 Hz. Detta kan justeras till oavsett frekvensområde är lämpligt. Klicka på 'Spara kalibrering', 'utgång kalibrering' (figur 3d).
- För att göra den nya kalibreringen effektivt, växla resonans till en annan frekvens (till exempel 189,150 Hz) och sedan bytte tillbaka till inställningen 68,500 Hz frekvens (figur 3e).
- Ändra amplituden gradvis till 35%. Klicka på 'Låsa resonans'. När frekvensen är låst, klicka på 'Låsa upp resonans' (figur 3e). TAG linsen är redo att använda nu.
- Att kalibrera, ändra de parametrar som används i uppskattning för att gör den beräknade positionen motsvarar den verkliga positionen, som visas i figur 4e, f. ingång skanning spänna av x, y och z och klicka på 'scan' knappen Skanna provet i XYZ att flytta den partikel genom rörliga laser plats. Placeringen av partikeln bör när det söks genom laser fokus håller med den uppskattade partikel bestäms av position uppskattning slingan (Figur S1). Förhållandet mellan den beräknade positionen och riktiga (figur 4 d) kan extraheras från beräknade position bilder (figur 4f). Om positionerna inte samtycker, justera värdena för laser position (ck) används i position uppskattning slingan (Figur S1).
- Justera etiketten lins
- När TAGGEN lins handkontrollen är avstängd, skannade raster partikel bilder (beskrivs nedan) tagit innan du installerar TAG linsen och efter installerande TAG lins bör ser likadana ut. Nästa, utföra fluorescerande partikel Z stack skanning genom att flytta målet med den z nanopositioner att justera position och vinkel av TAGGEN lins (figur 4). Finjustera positionen för TAGGEN objektivet tills det finns ingen drift i partikel bilder i XY-planet längs Z riktning, vilket uppnås när det finns ingen förändring i XY position partikeln som funktion av läget Z (figur 4 d). Uppföljningssystemet är klar att använda efter justering av TAG linsen.
- Installation av sCMOS kamera för övervakning av partikel
- Installera en sCMOS kamera för att visualisera partiklar medan de spåras. Installera sCMOS endast efter att alla komponenter i uppföljningssystemet har installerats och optimerad.
4. 3D realtidsspårning av fritt sprida nanopartiklar
- Put 110 nm gratis flytta partikel prov på mikroskopet.
- Aktivera laser, mikro-lägesställare controller, piezo nanopositioner controller, TAG linsen controller och EOD controller. Kör den piezo nanopositioner i open loop. Ställa in TAG linsen program enligt steg 3,2.
- Öppna och kör mjukvara (tillgänglig på begäran från författarna). Ange position uppskattning parametrar till sina optimerade värden, som konstaterats i avsnitt 3.
- För att placera täckglaset i fokus för målet, ta bort filtret fluorescens utsläpp och använda reflektion av laser från täckglaset för att maximera signal intensiteten som en funktion av micropositioner Z ställning. Efter att hitta täckglaset, öka fokus position 15 µm för att fokusera laser från täckglaset och i lösningen. Placera tillbaka filtret fluorescens utsläpp.
- Ange konstanterna som integrerad kontroll. Integrerad kontroll konstanter kan ställas in på ett lågt värde och långsamt öka tills svängningar kan ses i den partikelns position avläsning. När svängningarna observeras, ange integrerad kontroll konstanterna till 80% av det värde som orsakar svängningarna. Typiska värden kommer att vara runt 0,012 för XY 'integrerad vinst' och 0,004 för Z 'integrerad vinst'.
- Ställa in spårning tröskelvärdena 'Spår tröskeln' och 'Spår Minimum' och starta spårning experimentet genom att klicka på 'Sök' och 'Auto Track'. Tröskeln för terminerande spårning ligger något högre än bakgrundsnivån och tröskeln för att utlösa spårning är cirka två gånger högre än bakgrunden. Här är tröskeln för att utlösa spårning 3 kHz och tröskeln för slutar banan är 1,5 kHz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fast partikel scanning (figur 4) och fritt diffuserande 110 nm fluorescerande partikel spårning (figur 5) utfördes efter protokollet ovan. Partikel skanning utfördes genom att flytta den piezoelektriska nanopositioner och bin fotoner medan samtidigt beräkna partikeln Beräknad position vid varje punkt i genomsökningen. Skannar bilden visar en kvadrat med jämn intensitet (figur 4a) och beräknade positionerna visar en linjär relation med partikelns verkliga position över en 1 × 1 × 2 µm utbud i x, y och z-LED (figur 4b–f).
För att demonstrera realtidsspårning, spårades 110 nm fluorescerande partiklar i vatten av 3D-DyPLoT (figur 5a, b). Mean square deplacement (MSD) analysen visar en typisk linjär beteende kännetecknande för Brownsk rörelse (bild 5 c). MSD analys av 30 banor visade en genomsnittlig hydrodynamiska diameter på 110 nm, i bra avtal med tillverkare specifikation för storleken av den fluorescerande nanopartiklar spåras (figur 5 d). Dessutom film 1 visar realtid piezoelektriska nanopositioner avläsning och synkroniserade sCMOS bilder för en 2 min lång banan för en fritt diffuserande 110 nm fluorescerande partikel.
Förutom att kunna spåra med hög hastighet, kan långsam rörliga partiklar lokaliseras med hög precision. Figur 6a - d visar tillämpningen av 3D-DyPLoT systemet till fasta partiklar med samma feedback parametrar som används för hög hastighet spårning, visar en precision på 17,6 och 26,4 53,4 nm i X, Y och Z, respektive med fotonen räkna andelen 105. Figur 6e - h visar precisionen under feedback kontroll minskas med en faktor på 10, effektivt byta hastighet för precision och uppvisar en precision på 6,5 och 8,3 10,5 nm i X, Y och Z, respektive.
Figur 1. Schematiska 3D spårningssystem. Den 2D-EOD (EOD1 & EOD2) och objektivets etiketten (TAG) avleda lasern längs de XY och Z riktningarna, respektive. APD (APD) används för att samla fluorescens fotoner, som skickas till FPGA (FPGA). FPGA används för ställning beräkningen algoritmen, photon counting, kontroll av den 2D-EOD samt kontroll och avläsning av piezoelektriska nanopositioner (NSxy och NZz). Andra komponenter som märkt i figuren: speglar (M). linser (L #); Pinhole (PH); Glan-Thompson polarisator (GP); halv-wave plattan (W1); dikroiskt filter (DC); objektiv (OL, 100 X NA = 1.49); fluorescens utsläpp filter (F); stråldelare (BS); XY micropositioner scenen (MSxy); Z micropositioner scenen (MSz). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Koordinater för Riddarens turné genomförs i 3D-DyPLoT. Axel 1 och axel 2 bör anpassas längs X- eller Y-axeln vid korrekt justering av den 2D-EOD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. TAG linsen Programvaruinställningar. Se avsnitt 4.2 TAG lins inställningar för mer information. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Partikel skanning och position uppskattning. (a) skanna bild av 190 nm fluorescerande pärlor med 2D-EOD driving laser i en 1 × 1 µm square riddarens tur mönster. Fluorescensintensiteten betecknas med färg. Enhet: kHz. (b) uppskattning av xk, den partikelns position i förhållande till mitten av den 2D-EOD skanna i mikrometer. Färgen i b, coch d betecknar den beräknade positionen. Enhet: µm. (c) uppskattning av yk i mikrometer. (d) uppskattning av zk, den partikelns position i förhållande till axiella centrum TAG linsen skanna i mikrometer. (e), beräknad partikel position yk som funktion av scenen position i genomsnitt över hela nätet från (c). Observera att beräknade partikel ställning förvärvats från position uppskattning algoritmen (yk) instämmer i den verkliga positionen. (f), beräknad partikel position zk som funktion av scenen position i genomsnitt över hela nätet från (d). Den beräknade positionen visar en linjär relation med partikelns verkliga position över 1 × 1 × 2 µm utbud i X, Y och Z-riktning. Observera att den uppskattade partikel ställning förvärvats från den position uppskattning algoritmen (zk) instämmer i den verkliga positionen. Den beräknade positionen visar en linjär relation med partikelns verkliga position över en 1 × 1 × 2 µm utbud i X, Y, och Z-led. Den vita skalan barer i (en–c) representerar 500 nm och svart skalstapeln i (d) representerar 2 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5.Spårning 110 nm fluorescerande partiklar i vatten med 3D-DyPLOT. (en) 3D banan för ett fritt diffuserande 110 nm fluorescerande nanopartiklar i vatten. (b) fluorescerande intensitet som funktion av tiden för banan i (en). (c) MSD av banan i (en). Den blå linjen är den uppmätta MSD medan den streckade röda linjen är bästa fit line från linjär regression. (d), MSD analys av 30 banor, visar en genomsnittlig hydrodynamiska diameter på 110 nm, i bra avtal med storleken av den fluorescerande nanopartiklar som spåras. Diametern på partiklarna beräknades med hjälp av Stokes-Einstein förhållandet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Precision av fast partikel spårning. (en) A fast partikel spåras av 3D-DyPLoT på olika antal priser. Precision är (b) 17,6 nm i X, (c) 26,4 nm i Y och (d) 53,4 nm i Z med en utsläpp på 100 kHz. (e) när sondera långsammare processer, kontrollen feedback konstant (Kjag) kan minskas med en faktor 10 för att öka precisionen. Under detta minskad feedback kontroll är precision (f), 6,5 nm i X, (g), 8,3 nm i Y och (h), 10.5 nm i Z med en utsläpp på 100 kHz. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur S1. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Figur S2. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Figur S3. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Tilläggsinformation. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om många sorter av 3D enda partikel spårning metoder har dykt upp under de senaste åren, är robust realtidsspårning av hög hastighet 3D diffusion på låg fotonen räkna priser med en enkel inställning fortfarande en utmaning, vilket begränsar dess tillämpning på viktiga biologiska problem. 3D-DyPLoT metoden beskrivs i detta protokolladresser dessa utmaningar i en flera sätt. Först, excitation och upptäckt vägar förenklas avsevärt jämfört med andra implementeringar som gör anpassningen enkel och robust. För det andra ger rörliga laser plats och position uppskattning algoritm exakt position uppskattningar av feedbackloop, att göra feedback mer stabil. För det tredje, effektivt stora detektionsområdet (1 x 1 x 4 µm) av dynamiskt rörliga laser plats möjliggör spårning av snabbt rörliga partiklar. För att se varför detta stora avkänningsområdet är avgörande, är det viktigt att överväga den piezoelektriska nanopositioner inneboende responstid. Hög hastighet piezoelektriska stadier har resonanser storleksordningen 1 kHz, begränsa svarstiden vara i storleksordningen 1 ms. i 1 ms, en 100 nm nanopartiklar med en diffusion koefficient 4 µm2/s, kommer diffus på genomsnittet 90 nm från mitten av diffraktion-li begränsat upptäckt volym. Detta är bara genomsnittliga förskjutningen och verkligen är slumpmässig rörelse kommer att ställa ut stegen mycket större än denna, leder till partikeln lämnar fokal volymen och slutar den aktuella banan. Situationen är ännu värre för mindre partiklar, där allt större termisk diffus steg leda till förlust av spårning. Effektivt stort detekteringsområdet möjliggör uppföljningssystemet att övervinna inneboende piezoelektriska scenen eftersläpning och återhämta sig från stora diffus hopp i partikel position, öka den övergripande robustheten av mekanismen för spårning. Slutligen, stora skanningsområdet tillåter systemet att enkelt plocka upp nya partiklar, möjliggör raka banor att fås snabbt och stora datamängder som sammanställt.
Användaren bör ha i åtanke att det finns en del kritiska moment. Första justeringen av både den 2D-EOD och TAG linsen är kritisk. Båda skall vara väl justerad för att erhålla optimal precision. Andra parametrar som används vid position uppskattning i fast partikeln scanning steg måste vara väl kalibrerade (se figur 4). Den uppskatta partikel ståndpunkten ska matcha partikel positionen motsvarar mitten av intervallet för laser-scan. Slutligen bör de feedback integrerad konstanterna (Kjag) stämmas noga, börjar med ett litet värde och rampning fram till svängningar observeras och sedan backa till ca 80% av detta värde.
Det finns några varningar om 3D-DyPLoT att ha i åtanke beroende på önskat program. Även optimerad position uppskattning är utformad för användning med Brownsk rörelse, är det också väl lämpad mot riktad rörelse. Algoritmen kan tillämpas direkt på någon typ av rörelse eftersom det är bara den position osäkerhet som antas vara Gaussisk, inte den verkliga partikel ståndpunkten. För fall där ihållande linjär rörelse förväntas, ett ytterligare villkor kan läggas till förutsägelse benämna i position uppskattning algoritm (se ekvation 3 i Tilläggsinformation).
Valet av parametrar för 2D-EOD och TAG bör övervägas noggrant när du ställer in den 3D-DyPLoT. Särskilt viktigt är det bin tid används för Riddarens turné skannas av den 2D-EOD. I ett idealiskt scenario, skulle Riddarens turné synkroniseras till perioden av TAG linsen att säkerställa effektiv provtagning. Det är dock avgörande för att överväga svarstiden för de 2D-EOD kliva förändringar i spänning. För den enhet som används här, finns det en 2-3 µs svarstid efter spänningen används innan önskad plats nås. Vid 20 µs bin tid är detta ca 10-15% av upphämtningstid. Minska tiden så att den matchar etiketten lins perioden ~ 14 µs ökar andelen av tiden i bin som är fördröjning på det 2D-EOD. Detta leder till felaktiga värden laser ställning och felaktig placering uppskattningar.
En annan faktor för försöksledaren att tänka är temporal upplösning. Medan data visas här samlas på en 100 kHz datahastighet, definieras den ultimata temporal upplösningen i slutändan genom vilken data används för positionsmätning. Om avläsningen av nanopositioner används som partikel position (figur 6), beror den temporal upplösningen på värdet på konstanten integrerad kontroll. Exempelvis för integrerad kontroll visas i figur 6a–d, scenen svaret är storleksordningen 1 ms, medan för figur 6e–h, det är storleksordningen 10 ms. om snabbare temporal upplösning önskas, då den Photon-av-photon resultatet av position uppskattning algoritmen kommer att korrelera med fotonen räkna ränta. Exempelvis en 10 kHz utsläpp hastighet ger 100 µs temporal upplösning och en 100 kHz utsläpp hastighet ger en 10 µs temporal upplösning. Dessutom, sedan den precision följer en 
relation41, rumsliga och tidsmässiga precision är kopplade. Som ett resultat, bestämmer ljusstyrkan på sonden både rumsliga och tidsmässiga precision.
I detta protokoll beskrev vi setup, layout och anpassning av en hög hastighet i realtid 3D enda partikel spårning metod som använder en 2D-EOD och TAG linsen till dynamiskt flytta en fokuserad laser plats att uppnå snabb partikel position uppskattning. Sedan beskrev vi prov förberedelse och parametern optimeringsmetoder. 3D-DyPLoT ger en robust och relativt enkel metod att lock-on snabbrörliga och ödmjuk avger diffus partiklar. Enkla optiska layouten gör det möjligt att enkelt läggas på sida-porten av eventuella befintliga mikroskopstativet så att den kan kombineras med imaging moduler. Med detta protokoll hoppas vi att RT-3D-SPT kan vara mer allmänt som genomfört mer utredarna att lösa snabbt, tre dimensionell biologiska processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institute of General Medical Sciences av det nationella Institutes of Health award nummer R35GM124868 och av Duke University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2D Electro-optic Deflector | ConOptics | M310A | 2 required |
| Power supply for EOD | ConOptics | 412 | Converts FPGA ouput to high voltage for EOD |
| TAG Lens | TAG Optics | TAG 2.0 | Used to deflect laser along axial direction |
| XY piezoelectric nanopositioner | MadCity Labs | Nano-PDQ275HS | Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in |
| Z piezoelectric nanoposiitoner | MadCity Labs | Nano-OP65HS | Used to move the objective lens to follow the diffusing particle |
| Micropositioner | MadCity Labs | MicroDrive | Used to coarsely position sample and evaluate |
| Objective Lens | Zeiss | PlanApo | High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss |
| sCMOS camera | PCO | pco.edge 4.2 | Used to monitor the particle's position |
| APD | Excelitas | SPCM-ARQH-15 | Lower dark counts beneficial |
| Field programmable gate array | National Instruments | NI-7852r | |
| Software | National Instruments | LabVIEW | |
| Tracking excitation laser | JDSU | FCD488-30 | |
| Lens | ThorLabs | AC254-150-A-ML | L1 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L2 |
| Pinhole | ThorLabs | P75S | PH |
| Glan-Thompson Polarizer | ThorLabs | GTH5-A | GT |
| Half-wave plate | ThorLabs | WPH05M-488 | WP |
| Lens | ThorLabs | AC254-75-A-ML | L3 |
| Lens | ThorLabs | AC254-250-A-ML | L4 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L5 |
| Lens | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L6 |
| Dichroic Mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | DC |
| Fluorescence Emission Filter | Chroma | D535/40m | F |
| 10/90 beamsplitter | Chroma | 21012 | BS |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| 190 nm fluorescent nanoparticles | Bangs laboratories | FC02F/9942 | |
| 110 nm fluorescent nanoparticles | Bangs laboratories | FC02F/10617 | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-545A | |
| Powermeter | Thorlabs | PM100D | |
| CMOS | Thorlabs | DCC1545M | |
| Iris | Thorlabs | SM1D12D | |
| Microscope | Mad City Labs | RM21 |
References
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat. Methods. 5 (5), 417 (2008).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044 (2011).
- Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6 (5), 339 (2009).
- Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED). Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).
- Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Welsher, K., Yang, H. Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles. Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).
- Welsher, K., Yang, H. Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy. Faraday Discuss. 184 (0), 359-379 (2015).
- Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking. J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).
- Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles. Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).
- Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts. Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901 (2006).
- Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions. ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).
- Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells. Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).
- Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. Three-dimensional tracking of individual quantum dots. Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).
- McHale, K., Mabuchi, H. Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope. Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).
- McHale, K., Mabuchi, H. Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm. J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).
- McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking. Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).
- Juette, M. F., Bewersdorf, J. Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution. Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).
- Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking. ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).
- Perillo, E. P., Liu, Y. -L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -K., Hung, M. -C., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, (2015).
- Hou, S., Lang, X., Welsher, K. Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot. Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).
- Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).
- Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions. Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).
- Lee, H. -lD., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision. Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701 (2012).
- Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).
- Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges. Optica. 4 (3), 367-373 (2017).
- Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606 (2017).
- Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing. Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).
- Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics. BIOMEDO. 17 (5), (2012).
- Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens. Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).
- Wang, Q., Moerner, W. E. Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap. Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).
- Fields, A. P., Cohen, A. E. Optimal tracking of a Brownian particle. Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
