Summary
Denne undersøgelse gennemført hele genome sequencing for analyse af mutationer i gener, der giver svampedræbende resistens i Candida glabrata. C. glabrata isolater resistente over for echinocandins, azoles og 5-flucytosine, blev sekventeret for at illustrere metoden. Modtagelighed profiler af isolaterne korreleret med tilstedeværelse eller fravær af specifikke mutation mønstre i gener.
Abstract
Candida glabrata kan hurtigt erhverve mutationer, der resultere i resistens over for lægemidler, især til azoles og echinocandins. Identifikation af genetiske mutationer er væsentlige, som modstand opdaget i vitro kan ofte være korreleret med klinisk fiasko. Vi undersøgt muligheden for at bruge hele genome sequencing (WGS) for genome-wide analyse af svampedræbende resistens i C. glabrata. Målet var torecognize katalysatorer og barrierer i forbindelse med gennemførelsen WGS og måle kampagnens effektivitet. Dette papir beskriver centrale kvalitetskontrol checkpoints og væsentlige komponenter af WGS metode til at undersøge genetiske markører forbundet med nedsat følsomhed over for svampedræbende stoffer. Det vurderer også nøjagtigheden af dataanalyse og tur omkring tidspunktet for testning.
Fænotypisk modtagelighed af 12 kliniske og én ATCC stamme af C. glabrata blev fastlagt gennem svampedræbende resistensbestemmelse. Disse inkluderede tre isolere par, fra tre patienter, der udviklede stigning i stof mindste hæmmende koncentrationer. I to par, anden isolere hvert par udviklet resistens over for echinocandins. Den anden isolat af det tredje par udviklet resistens over for 5-flucytosine. De resterende består af modtagelige og azol resistente isolater. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) i gener forbundet med echinocandin, azol og 5-flucytosine modstand blev bekræftet i resistente isolater gennem WGS ved hjælp af den næste generation sequencing. Non-synonym SNPs i svampedræbende resistens gener såsom FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 og FCY2 blev identificeret. Samlet, et gennemsnit på 98% af WGS læser for C. glabrata isolater knyttet til reference genom med ca 75-fold Læs dybde dækning. Ekspeditionstid og omkostninger kunne sammenlignes med Sanger sekvensering.
Afslutningsvis var WGS for C. glabrata muligt i afslørende klinisk signifikant genmutationer involveret i modstanden mod forskellige svampedræbende stof klasser uden behov for flere PCR/DNA-sekventering reaktioner. Dette udgør et positivt skridt mod indførelse af WGS evne i den kliniske laboratorium for samtidige påvisning af svampedræbende modstand giver udskiftninger.
Introduction
Candida glabrata er en stadig mere stødt patogen med betydning som en art, der udviser modstand til azoles og mere for nylig, echinocandins1,2,3. I modsætning til den diploide C. albicanstillade den haploide genom for C. glabrata det at erhverve mutationer og udvikle multi lægemiddelresistens lettere. Co modstand til både narkotika klasser har også været rapporteret4. Tidlig evaluering af svampedræbende modtagelighed og påvisning af resistens i C. glabrata er derfor afgørende for korrekt, målrettet terapi såvel som i forbindelse med svampedræbende stewardship at begrænse førere af antimikrobiel resistens1 , 5 , 6. oprettelse af en effektiv arbejdsgang til hurtigt opdage tilstedeværelsen af genfremsatte mutationer knyttet til modstand biomarkører i resistente isolater vil også bidrage til at forbedre ordination beslutninger og kliniske resultater.
Svampedræbende modtagelighed er normalt vurderes ved at måle mindste hæmmende koncentration (MIC), der er defineret som den laveste drug koncentration, som resulterer i en betydelig reduktion i vækst af en mikroorganisme, sammenlignet med en Stoffri vækst kontrol. Klinisk og laboratorie standarder Institute (der) og europæiske udvalg på antimikrobiel modtagelighed test (EUCAST) har standardiseret modtagelighed testmetoder for at gøre MIC bestemmelse mere nøjagtige og konsekvente7, 8. Nytte af svampedræbende MIC er dog begrænset, især for echinocandins, navnlig med hensyn til sammenlignende sammenligninger hvor varierende metoder og betingelser er brugt9. Der er også usikker korrelation af mikrofoner med svar til echinocandin behandling og manglende evne til at skelne WT (eller modtagelige) isolater fra dem husly FKS mutationer (echinocandin-resistente bakteriestammer)10,11. På trods af tilgængeligheden af genfremsatte enkelt-gen PCR'er og Sanger sekventering af svampedræbende modstand markører, realisering af resultater er ofte forsinket grund til manglende samtidige påvisning af flere modstand markører5,12. Dermed tilbyder samtidige påvisning af resistens-tildeling mutationer i forskellige steder i genomet, aktiveres med hele genome sequencing-baseret analyse, betydelige fordele i forhold til nuværende strategier.
Hele genome sequencing (WGS) er gennemført med succes for at spore sygdommen overføres under udbrud såvel som en tilgang til genome-wide risiko vurdering og drug modstand test i bakterier og vira13. De seneste fremskridt i nukleinsyre sekventering teknologi har gjort hele genome sequencing (WGS) af patogener i et klinisk handlingsrettede tur omkring tid både teknisk og økonomisk muligt. DNA-sekventering tilbyder vigtige fordele frem for andre metoder af patogenet identifikation og karakterisering ansat i mikrobiologi laboratorier14,15,16. Først, det giver en universel løsning med høj hastighed, hastighed og kvalitet. Sekventering kan anvendes til nogen af mikroorganismer og giver mulighed for stordriftsfordele på lokale eller regionale laboratorier. For det andet, den producerer data i en 'fremtidssikret' format imødekommenhed over for sammenligning på nationalt og internationalt plan. Endelig, den potentielle nytte af WGS i medicin er blevet forstærket af den hurtige vækst i offentlige databaser, der indeholder reference genomer, som kan være forbundet med tilsvarende databaser, der indeholder yderligere kliniske og epidemiologiske metadata17 ,18.
Nylige undersøgelser har vist nytten af WGS for identifikation af svampedræbende modstand markører fra kliniske isolater af Candida spp. 10 , 19 , 20. det er for det meste på grund af tilgængeligheden af høj overførselshastighed benchtop sequencere, etablerede Bioinformatik rørledninger og faldende udgifter til sekvensering21,22. Fordel af svampe WGS over Sanger sekventering er at WGS giver sekventering af flere genomer på et enkelt run. Derudover kan WGS af Candida genomer identificere nye mutationer i stof mål, spore genetiske evolution, og fremkomsten af klinisk relevante sekvens-typer20,22,23. Vigtigst af alt, i tilfælde af iboende multidrug resistance, kan WGS hjælpe med tidlig påvisning af resistens-tildeling mutationer før behandling valg22,24.
Her undersøgte vi mulighederne for WGS-aktiveret screening for mutationer i forbindelse med resistens over for lægemidler til forskellige klasser af svampedræbende stoffer. Vi præsenterer en metodik til gennemførelse af WGS fra slutbrugeren og diagnostiske mykologi laboratorium perspektiver. Vi har medtaget i denne analyse tre isolere par kulturperler fra tre separate kliniske tilfælde, i hvilke i vitro resistens over for echinocandins og 5-flucytosine udviklet sig over tid efter antifungal behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ingen etiske godkendelse var påkrævet for denne undersøgelse.
1. subkultur og inokulum forberedelse til Candida glabrata
- Vælg et panel af C.glabrata isolater studeres som også bør omfatte mindst én C. glabrata amerikansk Type kultur samling (ATCC) med kendte modtagelighed mønster.
- Subkultur et isolats ved at røre en enkelt koloni ved hjælp af et sterilt engangs plast loop og striber på en Sabouraud dextrose agar (SDA) plade8.
- Inkuber SDA plade i 24-48 timer ved 35 ° C til ren kultur af isolat med god vækst.
2. bestemmelse af svampedræbende modtagelighed
- Brug en sterile engangs plastic løkke til at vælge 4-5 kolonier på ca 1 mm i diameter fra en frisk subcultured C. glabrata isolere på SDA plade. Resuspend i 3 mL sterilt, destilleret vand. Bland godt ved blid pipettering for at opnå ensartet suspension.
- Justere celle tæthed til 0,5 McFarland, hvilket svarer til 1 x 106 til 5 x 106 celler/mL ved hjælp af en densitometer 8.
- Udfører resistensbestemmelse ved hjælp af kommercielle assay (se tabel af materialer og reagenser) på alle C. glabrata isolerer efter fabrikantens anvisninger. Fortolke modtagelighed af isolater baseret på resulterende mikrofoner af svampemidler ifølge der retningslinjer og forberede rapport (tabel 1)8.
3. genomisk DNA-ekstraktion til sekvensering
- Resuspend en oejefuld af kolonier fra en frisk dyrket SDA plade i 300 µL af 50 mM EDTA i 1,5 mL rør.
- Tilføje 40 µL af zymolyase (10 mg/mL) til suspension, og forsigtigt med pipette overfoeres 5 gange indtil suspensionen er ensartet.
- Inkuber prøve ved 37 ° C i 1-2 timer at fordøje cellevæggen. Afkøles ved stuetemperatur i 5 min.
- Centrifugeres suspension på 14.000 × g for 2 min og derefter forsigtigt fjerne supernatanten.
- Uddrag genomisk DNA efter DNA udvinding kit retningslinjer (se tabel af materialer).
- Resuspend ekstraherede DNA pellet i 50 µL af 10 mM Tris Buffer (pH 7,5-8,5) i stedet for eluering bufferen findes i kit.
- Tjekke renheden af DNA ved måling af ekstinktionen (O.D) på 260/280 nm25.
4. genomisk DNA kvantificering
- Forberede en 1 x Tris EDTA (TE) buffer findes i analysen kit baseret på producentens retningslinjer for fluorescens assay (se tabel af materialer).
- Fortynd DNA-prøven, ved at tilføje 2 µL til 98 µL 1 x TE analysebuffer (endelige rumfang af 100 µL, fortynding faktor 1:50) i en engangs 96 godt plade. Denne fortynding trin kan udføres enten manuelt ved hjælp af en multikanalpipette eller af automatiserede væske håndtering arbejdsstation.
- Forberede vifte af standarder ved at fortynde lambda DNA (100 µg/mL) i fluorescens assay kit (tabel 2) og omfatter måling sammen med prøver.
- Tilsæt 100 µL af de fluorescerende farvestof til 100 µL fortyndet DNA-prøver og standarder for reaktionen. Inkuber i 5 min. ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
- Måle fluorescens af alle prøver baseret på producentens retningslinjer.
- Plot standardkurven ved hjælp af fluorescens aflæsninger og beregne den oprindelige koncentration af DNA-prøver.
- Bestemme mængden af DNA og 10 mM Tris buffer (pH 8) tilføjes til justere DNA-koncentrationen til 0,2 ng/µL.
- Udføre DNA fortyndinger ved hjælp af automatiserede væske håndtering arbejdsstation. Dette trin kan opnås også ved manuel pipettering.
5. DNA bibliotek forberedelse
Bemærk: Bibliotek forberedelse og sekventering blev udført efter producentens protokoller og retningslinjer fastsat af virksomheden (fig. 1A) (se tabel af materialer).
- Tagmentation og PCR forstærkning
- Mærke en ny 96-brønd etui tynd væg plade.
- Tilsæt 5 µL af kvantificerede input DNA på 0,2 ng/µL (1 ng i alt) til hver prøve godt af pladen.
- Tilsæt 10 µL af tagmentation buffer og 5 µL forstærkning af buffer til hver godt indeholdende DNA og forsigtigt afpipetteres for at blande. Forsegle pladen med en selvklæbende plade segl.
- Pladen anbringes i en termisk cycler og køre programmet følgende PCR: 55 ° C i 5 min, og hold på 10 ° C. Når prøven når 10 ° C, gå straks til at neutralisere.
- Tilføj 5 µL af neutralisering buffer på pladen til at neutralisere amplikon reaktion, og forsigtigt afpipetteres mix. Forsegle pladen og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- Tilføj 15 µL af indeksering PCR-mastermix til prøverne.
- Bruge en kasse med indeks primer rør tilgængelige for en opsætning af 96-brønd plade format, så hver prøve får en unik kombination af indeks baseret på indekset skabelon (tabel 3).
- Arrangere indeks primer rør i indeks plade rack (figur 1B) ved hjælp af nævnte rækkefølge i skabelonen på tabel 3 og registrere placeringen af indekser på skabelonen.
- Placere tagmentation pladen med tilføjet PCR-mastermix på indeks plade rack med indeks rør i rækkefølge.
- Sætte indeks primer 1 rør i lodret arrangement, og indekset primer 2 rør i vandrette arrangement på indeks rack. Ved hjælp af en multikanalpipette forsigtigt tilføje 5 µL af indeks primere til hver prøve.
- Udskifte gamle caps indeks rør med nye hætter til at undgå krydskontaminering mellem indekser.
- Forsegle pladen ved hjælp af 96-godt klare plade fangere og udføre den anden PCR som følger: 95 ° C til 30 s, 12 cyklusser af 95 ° C til 10 s, 55 ° C til 30 s, 72 ° C i 30 s og 72 ° C i 5 min.
- PCR oprydning
- Overføre PCR produkt til PCR-oprydning, fra tagmentation pladen til en dyb-godt plade (se tabel af materialer).
- Vortex kommercielle magnetiske perler løsning (se tabel af materialer) baseret på producentens anvisninger og tilføje 30 µL af perler til hver PCR produkt i dyb-godt plade.
- Ryst pladen på en mikrotiterplade shaker ved 1800 rpm i 2 min og inkuberes ved stuetemperatur uden omrøring i 5 min.
- Pladen anbringes på en magnetisk stå i 2 min., indtil supernatanten er ryddet.
- Supernatanten omhyggeligt med pladen stadig på den magnetiske stand.
- Tilføje 200 µL af frisklavede 80% ethanol med pladen på den magnetiske stand.
- Inkuber plade på den magnetiske står for 30 s og forsigtigt fjerne og supernatanten uden at forstyrre perlerne.
- Gentag trinnet vask igen og lad perlerne blive tør til 15 min. Fjern overskydende ethanol, hvis nogen.
- Fjerne pladen fra den magnetiske stå og tilføje 52,5 µL af resuspension buffer til perlerne.
- Ryst pladen på en mikrotiterplade shaker ved 1800 rpm i 2 min og inkuberes ved stuetemperatur i 2 min. uden rystelser.
- Pladen anbringes på den magnetiske stå og tillade supernatanten at rydde.
- Ved hjælp af en multikanalpipette omhyggeligt overføre 50 µL af supernatanten fra oprydning pladen til en ny etui plade.
- Biblioteket normalisering
- Tø bibliotek normalisering reagenser ifølge producentens retningslinjer (se tabel af materialer).
- Overføre 20 µL af supernatanten fra oprydning pladen til en ny dyb-godt plade.
- Tilføje 45 µL af magnetisk bead suspension og forsegle pladen med en plade sealer.
- Ryst pladen på en mikrotiterplade shaker ved 1800 rpm i 30 min. Denne Inkubationstiden er kritisk og bør ikke overskrides.
- Pladen anbringes på en magnetisk stå i 2 min. og bekræfte at supernatanten har ryddet (figur 1B).
- Fjern og kassér supernatanten opbevares i en passende farligt affald container med pladen stadig på den magnetiske stand.
- Fjerne pladen fra den magnetiske stå og vaske perler med 45 µL wash buffer.
- Ryst pladen med wash buffer på en mikrotiterplade shaker ved 1800 rpm i 5 min.
- Placere plade på magnetisk står for 2 min og Fjern supernatanten, når det viser klart.
- Fjerne pladen fra den magnetiske stå og gentage vask med wash buffer.
- Fjerne pladen fra den magnetiske stå og tilføje 30 µL af 0,1 N NaOH.
- Ryst pladen med 0,1 N NaOH på en mikrotiterplade shaker ved 1800 rpm i 5 min og pladen anbringes på den magnetiske står for 2 min, eller indtil væsken er klar.
- Tilsæt 30 µL af eluering buffer til hver brønd af et nye 96-brønd etui tynd væg endelige normaliseret bibliotek plade.
- Overføre 30 µL af supernatanten fra normalisering plade til sidste normaliseret bibliotek pladen at gøre endelige rumfang 60 µL. Bibliotekerne er nu klar til at blive sekventeret.
- Fastlæggelsen af DNA bibliotek koncentration af qPCR
- Tø mastermix, primere og standarder findes i qPCR kit ifølge producentens retningslinjer (se tabel af materialer).
- Kombinere PCR reagens mastermix og primer findes i qPCR kit efter fabrikantens anvisninger og delprøver kan opbevares ved-20 ° C.
- For at bestemme DNA bibliotek koncentration, gøre en 1/8000 fortynding af DNA biblioteker bruge 10 mM Tris buffer (pH 8) ved at udføre en 1: 100 fortynding (1,5 µL DNA bibliotek til 148,5 µL Tris buffer) efterfulgt af en 1:80 fortynding (2 µL fra 1: 100 til 158 µL Tris buffer).
- Ryste fortynding pladen på 700 rpm for mindst 1 min og derefter centrifugeres ved 14000 × g i 1 min.
- Forberede 20 µL af endelige PCR reaktion ved at blande 4 µL fortyndede DNA bibliotek eller DNA standarder og 16 µL af mastermix.
- Udføre PCR efter fabrikantens indstillinger i thermocycler: 95 ° C i 5 min, 35 cykler på 95 ° C til 30 s og 60 ° C i 45 s, og endelige 65 ° C til 95 ° C for smelte kurve analyse.
- Hente Ct værdierne af prøven DNA biblioteker og standarder fra qPCR thermocycler.
- Generere en standardkurve fra Ct værdi af standarder (figur 2). Definere den øvre og nedre QC vifte af ± 3 cykler fra middelværdien. For eksempel, hvis gennemsnitlige Ct værdi er 13 cyklusser derefter vil rækken QC er mellem 16 og 10 cyklusser.
- Bestemme de individuelle og gennemsnitlige bibliotek koncentrationer (ALC) fra standardkurven og Ct værdier.
- Bestemme mængden af samlede poolede biblioteker (PAL) skal bruges baseret på beregningen gives nedenfor for endelige sekventering overvejer at indskyde bibliotek koncentration er mellem 1,4 - 1.8 pM.
Bemærk: Gennemsnit bibliotek koncentration fremstillet af qPCR = ALC; Total poolede biblioteker (PAL) = ALC / 2; Denatureret PAL (DAL) = PAL * 0,666
Afhængigt af mængden af DAL, der er blandet med buffer er koncentrationen af biblioteket føjes til cellen flow. For eksempel, hvis 65 µL af biblioteket føjes til 835 µL af buffer, derefter fra denne fortynding (Dil 1) 195 er føjet til en samlede volumen af 1300 µL: (65/900) * dnPAL = Dil1
Dil1 * (195/1300) = endelige koncentration (bør være mellem 1,4 - 1.8 pM)
6. bibliotek pooling og igangsættende Sequencing i Benchtop Sequencer
- Tø reagens patron ifølge producentens retningslinjer. Tag en ny flow celle fra sin pakke fra 4 ° C opbevaring og bringe til stuetemperatur atleast 30 min før sekventering. Tegne en buffer patron og prechill-sekventering buffer inden brug (se tabel af materialer).
- Forberede en kontrol bibliotek ved at blande 5 µL af bibliotek (1 nM) og 5 µL af 0,2 N NaOH. Vortex kort og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur til at denaturere kontrol bibliotek i enkelt hårstrå.
- Tilsæt 5 µL af 200 mM Tris-HCl, pH 7 og vortex. Tilføj 235 µL prechilled sekventering buffer og bland forsigtigt. Det samlede volumen er 250 µL med kontrol bibliotek endelige koncentration ved 20 pM.
- Pool DNA biblioteker ved at overføre 5 µL af hver prøve biblioteket at blive sekventeret fra endelige normaliseret bibliotek pladen ind i et enkelt low-binde 1,5 mL rør.
- Tilføj 30 µL af poolede bibliotek og 30 µL 0,2 N NaOH til at denaturere biblioteker i en anden lav binde tube.
- Vortex lav-binde tube og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur til at denaturere biblioteker i enkelt hårstrå.
- Tilføj 30 µL af 200 mM Tris-HCl, pH 7 til rør med denatureret biblioteker til at neutralisere reaktion.
- Tilføje 65 µL af neutraliseret denatureret biblioteker suspension og 835 µL af pre kølet sekventering buffer og vortex at blande godt.
- I et afsluttende lav binde rør kombinere følgende: 195 µL fra neutraliseret denatureret biblioteker, 1,30 µL af kontrol bibliotek og 1103.70 µL af sekventering buffer. Bland ordentligt.
- Indlæse endelige bibliotek mix (1300 µL) i det udpegede sted på reagens patron.
- Set-up sekventering køre ved at indtaste projekt og prøve detaljer i sequenceren udpeget hjemmeside efter retningslinjer.
- Indlede sekventering efter retningslinjer. Indlæse flow celle, reagens patron med biblioteker og buffer patron i benchtop sequencer.
- Optage batchnumrene for alle reagens kits og patroner der også brugtes i rækkefølgen.
7. data Download fra sekventering hjemmeside
- Download FASTQ filer efter fabrikantens anvisninger på hjemmesiden.
- For en god kvalitet køre check at procentdelen Q30 er ≥ 75% og klynge tæthed er mellem 170-280 K/mm2 med optimal på 200-210 K/mm2 (tabel 4).
8. sekventering dataanalyse
- Importere FASTQ filer af sekventeret prøver til data analyse integreret softwarepakke (se tabel af materialer).
- Oprette en sekventering arbejdsproces i software ved at tilføje funktioner fra liste nemlig trimning, kortlægning til reference (Vælg reference genom), lokale kursjustering og variant analyse (fig. 3A) ved hjælp af indstillinger angivet i tabel 5.
- Køre arbejdsprocessen ved at vælge et enkelt udsnit eller en batch af prøve FASTQ filer og gemme outputfiler i udpegede prøve mapper.
- Generere rapport for sekvens dækning dybde, tilknyttede områder og listen over strukturelle varianter i genomet (figur 3B).
- Brug listen over strukturelle varianter til at søge efter ikke-synonym single nucleotide polymorphisms (SNPs) i gener, der giver resistens og virulens.
- Forberede betænkningen af notering SNP, genet, og antallet af resistente eller modtagelige isolater (tabel 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
13 C. glabrata bestående af C. glabrata ATCC 90030 og 12 isolater fra det kliniske mykologi referencelaboratorium (isolerer CMRL1 til CMRL12), Westmead Hospital, Sydney blev studeret (tabel 1). Disse omfattede tre par af isolater CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 og CMRL-5/CMRL-6 fremstillet før og efter antifungal behandling med ingen epidemiologiske forbindelser mellem dem 24 (tabel 1).
Mikrofoner blev bestemt ved hjælp af der fortolkende breakpoint for ni svampedræbende stoffer, Amphotericin (AMB), Anidulafungin (ANI), Micafungin (MIF), Caspofungin (CAS), 5-Flucytosine (5-FC), Posaconazole (POS), voriconazol (VRC), itraconazol ( ITR) og fluconazol (FLC). Candida parapsilosis ATCC 22019 og Candida krusei ATCC 6258 blev brugt som kvalitetskontrol stammer. Blandt de isoleres par, CMRL-1 og CMRL-2, var det andet isoleres CMRL-2 resistente over for caspofungin (MIC 8 vs. 0,12 mg/L, tabel 1). CMRL-2 havde også lignende proportional stigninger i mikrofoner af anidulafungin og micafungin (≥ 0,5 mg/L) resulterer i in vitro- modstand til alle tre echinocandins24. Ligeledes, anvendes på isolatet af CMRL-4 havde udviklet echinocandin modstand end isolat CMRL-3 (tabel 1). Mellem det tredje par, isoleres CMRL-6 havde en 5-flucytosine mikrofon (> 64 vs 0,06 mg/L)24. Begge disse isoleres par var modtagelige/wild-type (WT) til andre svampedræbende stoffer testet. Isoleres CMRL-6 og CMRL-12 blev fundet for at være resistente eller ikke-WT til alle azoles. CMRL-7 var resistente over for fluconazol og ikke-WT at voriconazol (tabel 1). C. glabrata ATCC 90030 og isolater CMRL-8 CMRL-11 var modtagelige modtagelige/WT til alle svampedræbende stoffer24.
WGS 13 isolater af blev udført ved hjælp af benchtop sequencer. På et gennemsnit, en mid output sekventering run, givet omkring 27-40 GB data med en fejlprocent mellem 0,5-1,4%. Den gennemsnitlige procentdel Q30 opnået var normalt omkring 80-85%. Klynge flow-celle tæthed (K/mm2), varierede mellem 200-250 (tabel 4). Rå sekvens data fra denne undersøgelse er blevet deponeret på NCBI sekvens Læs arkiv (SRA) under projektnummer PRJNA310057. 98% af sekventering læser knyttet til C. glabrata reference genom (stamme CBS138) gennem analyse i integrerede data analyse software. Gennemsnitlige læser dybde dækning var 75 x med gennemsnit læse længde af 143-bp. strukturelle variant påvisning identificeret mere end 50, 000 SNPs pr. isolat. Især, når du analyserer de stamme par CMRL1/CMRL-2, samlede SNPs fundet på hver isolat var omkring 79,000, for CMRL-3/CMRL-4, blev det samlede antal SNPs omkring 60.000 og for CMRL-5/CMRL-6, mere end 56.000 i forhold til CBS13824. SNP forskellen i forhold mellem isolater i en stamme par var mindre end 25.
Baseret på profilen modtagelighed af isolater, kendt modstand biomarkører blev udvalgt til analyse24, især, FKS1, FKS2 og FKS3 (echinocandin modstand), FCY1 og FCY2 (5- flucytosine modstand), og ERG9, ERG11, CgCDR1, CgPDR1 og CgFLR1 (azol modstand). Generne, der blev kontrolleret for kendte mutationer, og hyppigheden af SNP forekomster. Kun ikke-synonym SNPs i gener med læse dybde dækning af ≥20 dvs., var høj kvalitet SNPs (hq-SNPs) specifikt undersøgt.
Navnlig identificeredes FKS mutationer i genomet af begge echinocandin-resistente isolater24. Af de første to par, de echinocandin resistente isolater, CMRL-2 husede en enkelt FKS2 mutation S629P, og CMRL-4, FKS2 mutation S663P (tabel 6). For det tredje par, blev en SNP i FCY2 (Ala237Thr) fundet i både CMRL-5 (5-flucytosine modtagelige) og CMRL-6 (resistente) (tabel 6). SNPs i FCY2 fandtes også i andre fænotype-WT isolater (CMRL-1, CMRL-2, CMRL-10)24. Isolater CMRL-6 og CMRL-12 var bemærkelsesværdig for deres pan-azol resistente/non-WT karakter og havde SNPs i både CgCDR1 (kodning azol efflux pumper) og CgPDR1 (kodning transskription faktor, der regulerer efflux pumper) (tabel 6)26 ,27. Tilstedeværelsen af mutationer i et andet efflux pumpe gen, CgFLR1 opstod i begge azol-modtagelige, og azol-resistente isolater26,28. Fremgik for SNPs inden for ERG9 (kodning squalen syntase) mutationer, men der var ingen mutationer identificeret i ERG1124.
WGS analyse afslørede også flere ikke-synonym SNPs i Candida cellevæg vedhæftning gener nemlig EPA1, EPA6, PWP2 og PWP5. EPA6 mutationer var til stede i 9/12 isolater. SNPs i PWP2 og PWP5 var også til stede i næsten alle isolater, undtagen isolater CMRL-1 og CMRL-1124.
| Isolere | AMB | ANI | MIF | CAS | 5-FC | POS | VRC | ITR | FLC | Fortolkning af svampedræbende modtagelighed | Gener, der giver resistens identificeret ved WGS | ||
| CMRL-1 | 0,5 | 0,03 | < 0,008 | 0,12 | < 0,06 | 0,5 | 0,12 | 0,25 | 8 | Modtagelige for alle | - | ||
| CMRL-2 | 0,5 | 1 | 1 | 8 | < 0,06 | 0,25 | 0,06 | 0,12 | 4 | Resistente over for alle echinocandins kun | FKS1 | ||
| CMRL-3 | 0,25 | 0.015 | 0.015 | 0,12 | < 0,06 | 1 | 0,25 | 0,5 | 8 | Modtagelige for alle | - | ||
| CMRL-4 | 2 | 1 | 1 | > 8 | < 0,06 | 0,5 | 0,12 | 0,25 | 8 | Resistente over for alle echinocandins kun | FKS2 | ||
| CMRL-5 | 1 | 0,12 | 0.015 | 0,12 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 16 | Modtagelige for alle | - | ||
| CMRL-6 | 1 | 0,06 | 0.015 | 0,06 | > 64 | > 8 | 8 | > 16 | 256 | Resistente over for 5-FC og azoles | FCY2, CgPDR1, CgCDR1 | ||
| CMRL-7 | 0,25 | 0,06 | 0.015 | 0,25 | < 0,06 | 1 | 8 | 0,5 | 256 | Resistente over for alle azoles kun | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| CMRL-8 | 0,5 | 0,03 | 0,008 | 0,06 | < 0,06 | 0,5 | 0,25 | 0,25 | 4 | Modtagelige for alle | - | ||
| CMRL-9 | 1 | 0,03 | 0.015 | 0,25 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 1 | 16 | Modtagelige for alle | - | ||
| CMRL-10 | 1 | 0,03 | < 0,008 | 0,5 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 16 | Modtagelige for alle | - | ||
| CMRL-11 | 0,5 | 0,03 | < 0,008 | 0,03 | < 0,06 | 0,5 | 0,25 | 0,5 | 8 | Modtagelige for alle | - | ||
| CMRL-12 | 0,5 | 0,03 | 0.015 | 0,06 | < 0,06 | > 8 | 2 | 8 | 128 | Resistente over for alle azoles kun | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| ATCC 90030 | 1 | 0,03 | 0.015 | 0,06 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 8 | Modtagelige for alle | - | ||
| Forkortelser: MIC, mindste hæmmende koncentration; AMB, amphotericin B; ANI, anidulafungin; CAS, caspofungin; FLC, fluconazol; ITR, itraconazol; MIF, micafungin; POS, posaconazole; VRC, voriconazol; 5-FC, 5-flucytosine. | |||||||||||||
Bord 1. In vitro følsomhed af 13 Candida glabrata isolerer herunder CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 og CMRL-5/CMRL-6 isolere par fremstillet før og efter antifungal behandling
| Standarder | DNA Standard volumen (μL) | 1 X TE buffer | Reagens (μL) | Alt i 96-brønd plade (μL) | Endelig DNA koncentration (ng/mL) |
| Std-Pico 1 | 8 (standard DNA tube 100 µg/mL) | 1992 | 100 | 200 | 1000 |
| Std-Pico 2 | 10 (fra Std-Pico 1) | 90 | 100 | 200 | 100 |
| Std - Pico 3 | 5 (fra Std-Pico 1) | 95 | 100 | 200 | 50 |
| Std-Pico 4 | 2 (fra Std-Pico 1) | 198 | 100 | 200 | 10 |
| Std-Pico 5 | 10 (Std-Pico 4) | 90 | 100 | 200 | 1 |
| Tom | - | 100 | 100 | 200 | Tom |
Tabel 2. Protokol for at forberede standardkurven Generation for DNA kvantificering standarder
Figur 1 . Sekventering arbejdsproces: (A) en oversigt over analytiske hovedtrin til biblioteket forberedelse og sekventering på en benchtop sequencer. (B) vigtige komponenter til DNA bibliotek forberedelse som (venstre mod højre) indeks plade rack for arrangement af indeks under indeksering og magnetiske rack med dyb 96-brønd plade for magnetisk bead baseret oprensning af DNA biblioteker. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Indeks Sæt A |
N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | 715 | |
| A | S502 | Prøve 1 | Prøve 2 | Prøve 3 | Prøve 4 | Prøve 5 | Prøve 6 | Prøve 7 | Prøve 8 | Eksempel 9 | Prøve 10 | Prøven 11 | Prøven 12 |
| B | S503 | Eksempel 13 | Eksempel 14 | Eksempel 15 | Prøven 16 | Eksempel 17 | Prøve 18 | Prøven 19 | Prøve 20 | Prøve 21 | Prøven 22 | Prøven 23 | Prøven 24 |
| C | S505 | Prøven 25 | Prøve 26 | Prøven 27 | Prøven 28 | Prøven 29 | Prøve 30 | Eksempel 31 | Eksempel 32 | Prøve 33 | Prøven 34 | Prøven 35 | Eksempel 36 |
| D | S506 | Prøven 37 | Prøven 38 | Prøven 39 | Prøve 40 | Prøve 41 | Prøve 42 | Prøven 43 | Eksempel 44 | Eksempel 45 | Prøven 46 | Prøven 47 | Prøven 48 |
| E | S507 | Prøven 49 | Prøve 50 | Prøven 51 | Prøven 52 | Prøven 53 | Eksempel 54 | Prøven 55 | Prøven 56 | Prøven 57 | Prøven 58 | Prøven 59 | Sample 60 |
| F | S508 | Prøven 61 | Prøven 62 | Prøven 63 | Prøve 64 | Prøven 65 | Prøven 66 | Prøven 67 | Prøven 68 | Prøven 69 | Prøven 70 | Prøven 71 | Prøven 72 |
| G | S510 | Prøven 73 | Prøven 74 | Prøven 75 | Prøven 76 | Prøven 77 | Prøven 78 | Prøven 79 | Prøven 80 | Prøven 81 | Prøven 82 | Prøven 83 | Prøven 84 |
| H | S511 | Prøven 85 | Prøven 86 | Prøven 87 | Prøven 88 | Prøven 89 | Prøven 90 | Prøven 91 | Prøven 92 | Prøven 93 | Prøven 94 | Prøven 95 | Prøven 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Indeksere sæt B | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S502 | Prøve 1 | Prøve 2 | Prøve 3 | Prøve 4 | Prøve 5 | Prøve 6 | Prøve 7 | Prøve 8 | Eksempel 9 | Prøve 10 | Prøven 11 | Prøven 12 |
| B | S503 | Eksempel 13 | Eksempel 14 | Eksempel 15 | Prøven 16 | Eksempel 17 | Prøve 18 | Prøven 19 | Prøve 20 | Prøve 21 | Prøven 22 | Prøven 23 | Prøven 24 |
| C | S505 | Prøven 25 | Prøve 26 | Prøven 27 | Prøven 28 | Prøven 29 | Prøve 30 | Eksempel 31 | Eksempel 32 | Prøve 33 | Prøven 34 | Prøven 35 | Eksempel 36 |
| D | S506 | Prøven 37 | Prøven 38 | Prøven 39 | Prøve 40 | Prøve 41 | Prøve 42 | Prøven 43 | Eksempel 44 | Eksempel 45 | Prøven 46 | Prøven 47 | Prøven 48 |
| E | S507 | Prøven 49 | Prøve 50 | Prøven 51 | Prøven 52 | Prøven 53 | Eksempel 54 | Prøven 55 | Prøven 56 | Prøven 57 | Prøven 58 | Prøven 59 | Sample 60 |
| F | S508 | Prøven 61 | Prøven 62 | Prøven 63 | Prøve 64 | Prøven 65 | Prøven 66 | Prøven 67 | Prøven 68 | Prøven 69 | Prøven 70 | Prøven 71 | Prøven 72 |
| G | S510 | Prøven 73 | Prøven 74 | Prøven 75 | Prøven 76 | Prøven 77 | Prøven 78 | Prøven 79 | Prøven 80 | Prøven 81 | Prøven 82 | Prøven 83 | Prøven 84 |
| H | S511 | Prøven 85 | Prøven 86 | Prøven 87 | Prøven 88 | Prøven 89 | Prøven 90 | Prøven 91 | Prøven 92 | Prøven 93 | Prøven 94 | Prøven 95 | Prøven 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Indeksere sæt C | N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | 715 | |
| A | S513 | Prøve 1 | Prøve 2 | Prøve 3 | Prøve 4 | Prøve 5 | Prøve 6 | Prøve 7 | Prøve 8 | Eksempel 9 | Prøve 10 | Prøven 11 | Prøven 12 |
| B | S515 | Eksempel 13 | Eksempel 14 | Eksempel 15 | Prøven 16 | Eksempel 17 | Prøve 18 | Prøven 19 | Prøve 20 | Prøve 21 | Prøven 22 | Prøven 23 | Prøven 24 |
| C | S516 | Prøven 25 | Prøve 26 | Prøven 27 | Prøven 28 | Prøven 29 | Prøve 30 | Eksempel 31 | Eksempel 32 | Prøve 33 | Prøven 34 | Prøven 35 | Eksempel 36 |
| D | S517 | Prøven 37 | Prøven 38 | Prøven 39 | Prøve 40 | Prøve 41 | Prøve 42 | Prøven 43 | Eksempel 44 | Eksempel 45 | Prøven 46 | Prøven 47 | Prøven 48 |
| E | S518 | Prøven 49 | Prøve 50 | Prøven 51 | Prøven 52 | Prøven 53 | Eksempel 54 | Prøven 55 | Prøven 56 | Prøven 57 | Prøven 58 | Prøven 59 | Sample 60 |
| F | S520 | Prøven 61 | Prøven 62 | Prøven 63 | Prøve 64 | Prøven 65 | Prøven 66 | Prøven 67 | Prøven 68 | Prøven 69 | Prøven 70 | Prøven 71 | Prøven 72 |
| G | S521 | Prøven 73 | Prøven 74 | Prøven 75 | Prøven 76 | Prøven 77 | Prøven 78 | Prøven 79 | Prøven 80 | Prøven 81 | Prøven 82 | Prøven 83 | Prøven 84 |
| H | S522 | Prøven 85 | Prøven 86 | Prøven 87 | Prøven 88 | Prøven 89 | Prøven 90 | Prøven 91 | Prøven 92 | Prøven 93 | Prøven 94 | Prøven 95 | Prøven 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Indeksere sæt D | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S513 | Prøve 1 | Prøve 2 | Prøve 3 | Prøve 4 | Prøve 5 | Prøve 6 | Prøve 7 | Prøve 8 | Eksempel 9 | Prøve 10 | Prøven 11 | Prøven 12 |
| B | S515 | Eksempel 13 | Eksempel 14 | Eksempel 15 | Prøven 16 | Eksempel 17 | Prøve 18 | Prøven 19 | Prøve 20 | Prøve 21 | Prøven 22 | Prøven 23 | Prøven 24 |
| C | S516 | Prøven 25 | Prøve 26 | Prøven 27 | Prøven 28 | Prøven 29 | Prøve 30 | Eksempel 31 | Eksempel 32 | Prøve 33 | Prøven 34 | Prøven 35 | Eksempel 36 |
| D | S517 | Prøven 37 | Prøven 38 | Prøven 39 | Prøve 40 | Prøve 41 | Prøve 42 | Prøven 43 | Eksempel 44 | Eksempel 45 | Prøven 46 | Prøven 47 | Prøven 48 |
| E | S518 | Prøven 49 | Prøve 50 | Prøven 51 | Prøven 52 | Prøven 53 | Eksempel 54 | Prøven 55 | Prøven 56 | Prøven 57 | Prøven 58 | Prøven 59 | Sample 60 |
| F | S520 | Prøven 61 | Prøven 62 | Prøven 63 | Prøve 64 | Prøven 65 | Prøven 66 | Prøven 67 | Prøven 68 | Prøven 69 | Prøven 70 | Prøven 71 | Prøven 72 |
| G | S521 | Prøven 73 | Prøven 74 | Prøven 75 | Prøven 76 | Prøven 77 | Prøven 78 | Prøven 79 | Prøven 80 | Prøven 81 | Prøven 82 | Prøven 83 | Prøven 84 |
| H | S522 | Prøven 85 | Prøven 86 | Prøven 87 | Prøven 88 | Prøven 89 | Prøven 90 | Prøven 91 | Prøven 92 | Prøven 93 | Prøven 94 | Prøven 95 | Prøven 96 |
Tabel 3. Skabelon af forskellige Index Arrangement
Figur 2 : En standard graf genereret med Ct-værdier på standarder. Bruge standardkurven skæring og stigning værdier til at bestemme den gennemsnitlige bibliotek koncentration fra Ct værdi af prøven biblioteker i dubletter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Målinger | Standard værdier | Opnåede værdier (gennemsnit) |
| Udbytte | 32,5-50 Gb for mid output | 42 Gb for mid output |
| 100-130 Gb for høj-output | 120 Gb for høj-output | |
| Procentdel Q30 | ≥ 75% | 80% |
| Klynge tæthed | 170-230 K/mm2, Optimal på 200 K/mm2 | 210 K/mm2. |
| Klynger passerer filtre | > 70% | 89.09% |
| Intensitet af cyklus | Over 1000 for hver flise i flowcell | Over 1500 for hver flise i flowcell |
| Fejlprocent | Under 1,5 | 1.4 |
Tabel 4. Målinger til en standard sekvensering indkøre Benchtop Sequencer
Figur 3 : Sequencing Data analyse Software. (A) opretter en ønskede arbejdsproces, herunder sekvensen trimning, tilknytning til reference og kvalitet baseret variant påvisning. Køre arbejdsprocessen ved at vælge eksempelfiler i forbindelse med FASTQ (enkelte eller flere prøver i batch). (B) listen over strukturelle varianter viser reference placering, dækning, nukleotid ændring og aminosyre ændring fremstillet til analyse af prøven sekvenser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| 1. trim sekvenser | Indstillingen anvendes |
| Trim baser | Standardindstillingerne |
| Filtrere på længde med maksimale antal nukleotid i læser | 1000 |
| Filtrere på længde med minimum antal nukleotid i læser | 50 |
| 2. kortlægning læser til at henvise til | |
| Reference valgt | CBS138 |
| Reference maskering med maskering tilstand | Ingen maskering |
| Indstillinger for brugertilknytning | Standardindstillingerne |
| 3. lokale kursjustering | |
| Indstillinger for justering | Standardindstillingerne |
| 4. kvalitet baseret Variant påvisning | |
| Kvarter radius | 5 |
| Minimale hullet og uoverensstemmelse tæller | 2 |
| Minimum kvarter kvalitet | 15 |
| Centrale minimumskvalitet | 20 |
| Læs filtre | Standardindstillingerne |
| Minimumsdækningen | 4 |
| Variant minimumsfrekvens (%) | 75 |
| Variant filtre | Standardindstillingerne |
| Maksimale forventede alleler (Ploidi) | 2 |
| Genetiske kode | Standard |
Tabel 5. Arbejdsprocessen parametre og indstillinger på Software
| Strukturelle Variant nukleotid Position | Gen | Drug(s) | Fundet i Antallet af Isolater |
Resistente isolater | Modtagelige isolater | |
| SNP_Cg_95352_S629P_fks1 | CgFKS1 | CAS, ANI, MIF | 1 | CMRL-2 | - | |
| SNP_Cg_375361_S633P_fk2 | CgFKS2 | CAS, ANI, MIF | 1 | CMRL-4 | - | |
| SNP_Cg_285870_A237T_fcy2 | CgFCY2 | 5-FC | 2 | CMRL-6 | CMRL-5 | |
| SNP_Cg_286311_I384F_fcy2 | CgFCY2 | 5-FC | 2 | 0 | CMRL-1, CMRL-2 | |
| SNP_Cg_720995_C128F_erg9 | CgERG9 | FLC, POS, VRC, ITR | 3 | CMRL-6 | CMRL-5, CMRL-10 | |
| SNP_Cg_48683_R376Q_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-6 | - | |
| SNP_Cg_50384_G250N_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_49640_P695L_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | 0 | CMRL-11 | |
| SNP_Cg_49858_N768D_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
| SNP_Cg_203787_H58Y_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 5 | CMRL-6, CMRL-12 | CMRL-5, CMRL-10, CMRL-11 | |
| SNP_Cg_205529_M638I_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_206938_N1108S_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_589884_I116V_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 4 | CMRL-7 | CMRL-1, CMRL-2, CMRL-9 | |
| SNP_Cg_589470_V254I_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
Tabel 6. Betænkning af strukturelle variant stilling i gener forbundet med svampedræbende lægemiddelresistens fundet i antallet af isolater af C. glabrata
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse fastslået gennemførlighed, omtrentlige tidslinjer og præcision af WGS-styrede påvisning af resistens i C. glabrata. Ekspeditionstid (TAT) for biblioteket forberedelse og sekventering var fire dage og rapportering af analyseret resultaterne 1-2 dage. Dette skal sammenlignes med mindst et lignende beløb TAT for modtagelighed assays fra kultur plader og Sanger sekventering med betydeligt højere antal prøver. Omkring 30-90 C. glabrata genomer kan blive sekventeret baseret på sekvensering flow-celle kapacitet, med 80-100% sekventering dækning. Da Sekventeringen blev udført på en in-house WGS laboratorium setup, omkostninger/ressourcebehovene i denne undersøgelse var svarende til aktuelle omkostninger af Sanger sekvensering og sonde-baserede assays med en anslået udgift af AUD 80-100 pr. prøve. Modtagelighed af alle isolater var bestemt af en kommerciel assay kit, der blev læst visuelt ved hjælp af en læsning spejl. Kultur vækst blev anført af ændring i kolorimetriske vækst indikator fra blå til pink. MIC blev læst som den første blå godt efter en serie af pink (vækst) brønde dvs, den laveste koncentration af de svampedræbende middel, der betydeligt hæmmer vækst. Til WGS, blev genomisk DNA biblioteker udarbejdet ved hjælp af biblioteket forberedelse kit. De isoleres biblioteker var kvantificeres ved qPCR. De kvantificerede biblioteker var samlet sammen til den endelige sekvensering køre udført i benchtop sequencer.
I vores analyse, tilstedeværelsen af SNPs i gener, der giver resistens i isolater korreleret godt med den forhøjede in vitro- MIC mod narkotika. MutationerS629P i FKS1 og S663P i FKS2 identificeret var klart forbundet med resistens over for echinocandins. Begge mutationer er velkendt at overdrage fænotypiske modstand29,30. Samtidige genome-wide sekventering afslørede også mutationer i gener forbundet med 5-flucytosine (gen FCY2) og azol modstand (CgPDR1, CgCDR1 og CgFLR1), der er knyttet til modstand gennem aktivering / overekspression som efflux pumper26,27,28. Men virkningerne af mutationer i gener forbundet med azol og 5-flucytosine modstand31 behov skal bekræftes ved yderligere funktionelle analyserer for at vurdere niveauet gen udtryk. Interessant, blev stort antal SNPs også fundet i cellevæggen adhesins i alle isolater32,33. Mutationer i vedhæftning genet EPA6, som koder Biofilmdannelse, opstod relativt hyppigt33. Desuden isolerer CMRL-3, CMRL-4 og CMRL-8, manglede mutationer i azol resistensgener havde ingen dokumenterede SNPs i EPA1 og EPA624,34. Men samlet set ingen specifikke association mellem SNPs i adhesins og narkotika mikrofoner kunne findes på grund af det lave antal test isolater inkluderet.
Gennemførelsen af WGS i klinisk mykologi kræver gennemførelsen af robuste kvalitetsstyringssystem. Høj kvalitet genomisk DNA og kvalitetskontrol overvågningspunkter, ledsager hvert trin i eksperimentet er afgørende for en god WGS resultatet. Renheden af C. glabrata prøve DNA indsendt for biblioteket forberedelse kan valideres ved hjælp af UV absorbans metode (absorbans ved 260/280 nm og 260/230 nm25. Vores erfaring, for C. glabrata DNA er 260/280 forventes at være inden for det anbefalede interval af 1,8-2 og for 260/230 mellem 2-2.2. Hvis DNA ekstrakter ikke opfylder disse kvalitetskrav til, kan yderligere rensning af ethanol nedbør udføres. Tagmentation er et vigtigt skridt for at tilføje unik stregkode sekvenser kaldet indeks primere så som aktiverer differentiering af flere prøve under sekventering (multiplexing). Derfor i indekseringen, skal ekstra forsigtighed træffes til at undgå krydskontaminering mellem indeks rør og prøver for at opretholde entydighed af indeksene. Normalisering i sekventering sikrer, at eventuelle forskelle i stikprøven DNA biblioteker, der kan indføre bias i sequencing data er elimineret. En normalisering trin ved hjælp af en perle baseret clean-up normalt tillader fjernelse af overskydende DNA bibliotek fragmenter og variationer i biblioteket størrelse, der kan opstå under bibliotek forberedelse. 30 min inkubation er derfor afgørende for optimal klynge tæthed. Klynge tæthed, som er massefylden af de klonede klynger af prøven biblioteker genereret af massive forstærkning under sekventering påvirkninger datakvalitet som Q30 scores og samlede data output. Mens underclustering kan give høje datakvalitet, vil det også resultere i lavere data output boer overclustering lav Q30 scores. DNA-biblioteker bør være fri for magnetisk bead restkoncentrationer under PCR oprydning og normalisering som der kan forstyrre sequencing datakvalitet. QPCR bør udføres på mindst et par repræsentativ biblioteker herunder en referencestamme som positiv kontrol (ATCC stammen af C. glabrata i dette tilfælde) fra et bestemt sæt af indekser. De gennemsnitlige Ct-værdier bør være mellem 15-18 cykler. Enhver prøve inden for dette område anses for acceptabel for sekventering køre. Men hvis Ct-værdier uden for dette interval af qPCR bør gentages. Prøver kan nogle gange undlader qPCR enten på grund af lav kvalitet input DNA eller fejl under bibliotek forberedelse. Baseret på beregninger fra den positive kontrol, bør den mindste koncentration af biblioteker, der vil producere god sekvens data fastsættes. Ved hjælp af den gennemsnitlige koncentration af de biblioteker, der er fremstillet af qPCR, kan volumen af endelige bibliotek skal føjes til sekvensering beregnes. Dette skal producere anbefalede endelige bibliotek koncentration mellem 1,4 - 1:8 pM. For C. glabrata biblioteker, rækken etablerede Ct ved hjælp af C. glabrata ATCC isolat var mellem 16-18 cykler med en gennemsnitlig bibliotek koncentrationsområde på 300-500 pM. Tilsvarende mængden af poolede denatureret DNA biblioteker var inden for rækkevidde af 60-65 µL for en klynge tæthed vifte mellem 200-250 K/mm2.
Sekvens datafiler skal være demultiplexed før yderligere analyse. Dette kan opnås ved at sortere i deres respektive biblioteker benytter deres stregkoder efter sekvensering har fundet sted. Et valgfrit trin af kvalitet trimning af FASTQ filer kan udføres før dataanalyse. Sekvens læser i isolater fra WGS blev analyseret ved hjælp af en brugerdefineret arbejdsproces, der oprettes i en standard softwarepakke. Dette tillod trimning af lav kvalitet læser og derefter knytte til referencen Candida genom. Reference genomet, CBS138, blev hentet fra Candida genom Database (CGD) og knyttet til workflow før analyse. Tilstedeværelsen af DNA gentager i Candida genom (for eksempel adhesin gener har DNA gentager) kan komplicere tilpasning af kort-Læs sekvenser og SNP kald. Dette kan forbedres ved den yderligere lokale Genjustering af tilknyttede sekvenser. Output fra arbejdsprocessen var en strukturelle varianter liste, der kommenterede gener med ikke-synonym og synonym SNP positioner og dækning. Det blev brugt til at identificere SNPs i gener af interesse og forberede den endelige analyserapport for isolater (tabel 6).
Nogle begrænsninger i vores undersøgelse og tilgang bør anerkendes. Vores betænkning er baseret på små antal isolater og der er ingen standard svampe resistome database for kliniske mykologi. Selvom Sanger DNA-sekventering er i øjeblikket mere tilgængelige for kliniske laboratorier, det har begrænset evne til at detektere samtidig flere genmutationer, der giver resistens i Candida spp. (> 20 FKS mutationer for echinocandin modstand alene). Med konsolidering af patologi tjenester og faldende sekventering omkostninger, den praktiske gennemførlighed af benytter WGS over Sanger sekventering, forventes at stige. En vigtig overvejelse er dog indledende laboratorium setup og udgifterne til WGS instrument gennemførelse samt SLUTBRUGERUDDANNELSE af laboratoriepersonale. Langsigtede omkostninger vil hovedsagelig omfatte, fremskaffelse af sekventering reagens kits og tilbehør. Ekstra gebyr og en højere TAT bør forventes, hvis WGS instrument ikke er in-house. Derudover kan tilstedeværelsen af DNA gentagne sekvenser i genomer komplicere tilpasning af kort-Læs sekvenser og SNP kald. Tilgængeligheden af høj kvalitet reference genomer sekventeret benytter lang-Læs teknologier vil bidrage til at opretholde kvaliteten af SNP identifikation.
Fremover forventes WGS at bringe forbedringer i klinisk behandling af fast-tracking rapportering tid i diagnostisk indstillinger, som er let tilgængelig og fortolket af klinikere20,22. Dette kan opnås med udvikling af kurateret og up-to-date WGS svampedræbende stof modstand databaser af romanen og bekræftende mutationer at udlede svampedræbende modstand. Efterhånden som flere genomer af klinisk relevante gær af kendte fænotypiske drug modtagelighed bliver tilgængelige for analyse, er roman markører og mekanismer svampedræbende lægemiddelresistens tilbøjelige til at blive opdaget. Disse udviklinger vil væsentligt reducere risici ved behandling fejl på grund af multi lægemiddelresistens og lægemiddeltoksicitet. Afslutningsvis, den næste generation sequencing med passende kvalitet management protokoller gør det muligt for genom-dækkende påvisning af mutationer give modstand i Candida glabrata som kan forøge fænotypiske test i mykologi laboratorier. Den indsigt, som hurtig genome sequencing af klinisk relevante Candida spp kan fundamentalt ændre vores forståelse af mekanismerne for modstand til forskellige klasser af svampedræbende midler og forbedre forvaltningen af patienter med invasiv svampesygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser og nogen interessekonflikt at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af centret for smitsomme sygdomme og mikrobiologi, offentlige sundhed. Forfatterne har ikke modtaget andre midler til denne undersøgelse. Forfatterne takke Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann og Ranjeeta Menon for deres ekspertrådgivning og bistand med hele genome sequencing eksperiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
References
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
- Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
- Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
- Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
- Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
- Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
- Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , USA. Fourth Informational Supplement (M27-S4) (2012).
- Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
- Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
- Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
- Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
- Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
- Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
- Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
- Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
- Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
- Mardis, E. R.
- Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J.
- Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
- Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
- Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
- Cannon, R. D., et al.
- Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
- Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
- Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
- Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
- Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
- de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
- Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).
