Summary
Bu çalışmada Candida glabrataantifungal ilaç direnci veriyor genlerdeki mutasyonlar çözümlenmesi için tüm genom sıralama uygulanmaktadır. C. glabrata yalıtır echinocandins, azoles ve 5-flucytosine, dayanıklı metodoloji göstermek için sıralı. Duyarlılık profilleri varlığı ya da yokluğu genler belirli mutasyon desenleri ile ilişkili yalıtır.
Abstract
Candida glabrata hızla ilaç direnci, özellikle azoles ve echinocandins neden mutasyonlar elde edebilirsiniz. Direnç vitro kez klinik başarısızlık ile ilişkili olduğu tespit gibi Genetik mutasyonlar tanımlanması önemlidir. Genom geniş analizi C. glabrataantifungal ilaç direnci için tüm genom sıralama (WGS) kullanarak fizibilite inceledi. Amaç torecognize yardımcı teknolojiler ve engelleri WGS uygulamasında ve onun etkinliğini ölçmek. Bu kağıt anahtar kalite kontrol kontrol noktaları ve genetik işaretler antifungal ajanları düşük duyarlılık ile ilgili araştırmaya WGS metodolojisi temel bileşenlerine önerilmektedir. Ayrıca veri analizi doğruluğunu ve dönüş çevresinde-test zamanı tahmin ediyor.
12 klinik fenotipik duyarlılık ve C. glabrata bir ATCC suşu antifungal duyarlılık testi ile tespit edilmiştir. Dahil bu üç çift, uyuşturucu minimum inhibitör konsantrasyonu artış geliştirilmiş üç hastalardan izole et. İki çift olarak ikinci izole echinocandins her çift geliştirilen direnç. Üçüncü çiftinin ikinci izole 5-flucytosine direnç geliştirmiştir. Kalan duyarlı ve azole dayanıklı yalıtır oluşur. Tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) echinocandin, azole ve 5-flucytosine direnç bağlantılı genlerdeki dayanıklı yalıtır WGS sonraki nesil sıralama kullanarak üzerinden teyit edildi. Sigara eşanlamlı SNPs antifungal direnç genleri FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 ve FCY2 gibi tespit edildi. Genel olarak, ortalama % 98 oranında başvuru genom ile yaklaşık 75-fold okuma derinlik örtmek için eşlenen C. glabrata yalıtır WGS okur. Gerçekleştirme süresi ve maliyeti Sanger için karşılaştırılabilir sıralama.
Sonuç olarak, C. glabrata WGS klinik olarak anlamlı gen mutasyonlarının farklı antifungal ilaç sınıfları birden fazla PCR/DNA sıralama reaksiyonlar için gerek kalmadan direnç yer vermeden mümkün. Bu WGS yeteneklilik içinde eşzamanlı antifungal direnç saldırıyı oyuncu değişikliği algılanması için klinik laboratuvar kurulması yolunda olumlu bir adım temsil eder.
Introduction
Candida glabrata giderek karşılaşılan bir patojen azoles yanı sıra son zamanlarda, echinocandins1,2,3direnç sergileyen bir tür olarak öneme sahip olduğunu. Diploit C. albicans, C. glabrata haploit genom mutasyonlar elde etmek ve çoklu ilaç direnci daha kolay geliştirmek için izin verebilir. Co direnç için her iki ilaç sınıfları Ayrıca olmuştur4bildirdi. Bu nedenle, erken antifungal duyarlılık değerlendirilmesi ve C. glabrata ilaç direnci tespiti doğru hedeflenen tedavisi için Antimikrobiyal direnç1 sürücüleri sınırlamak için antifungal yönetimi bağlamında olduğu gibi çok önemlidir , 5 , 6. hızla direnç biyolojik olarak dirençli yalıtır bağlı doğrulama mutasyonların varlığı da reçete artırmak için yardımcı kararlar olduğunu algılar için etkin bir iş akışı ve klinik sonuçlar oluşturma.
Antifungal duyarlılık genellikle bir uyuşturucu ücretsiz büyüme ile karşılaştırıldığında bir mikroorganizma gelişimini önemli bir azalma sonucunda en düşük ilaç konsantrasyonu olarak tanımlanan minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) ölçülerek değerlendirilir Denetim. Klinik ve laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) ve Avrupa Komitesi antimikrobiyal duyarlılık testi (EUCAST) üzerinde duyarlılık testi yöntemleri mikrofon tespiti yapmak için standartlaşmış daha doğru ve tutarlı7, 8. Ancak, antifungal mikrofon yarar özellikle inter-laboratory karşılaştırmalar açısından çeşitli metodolojiler ve koşullar kullanılan9nerede özellikle echinocandins için sınırlı kalır. Ayrıca mikrofon belirsiz ilişki echinocandin tedavi ve yetersizlik WT ayırt etmek için yanıt ile olduğunu (ya da duyarlı) bu FKS mutasyonlar (echinocandin dirençli suşların)10,11yataklık yalıtır. Doğrulayıcı tek gen PCR ve Sanger rağmen antifungal direnç işaretleri sıralama, sonuçları gerçekleştirilmesinin kez nedeniyle birden fazla direnç işaretleri5,12eşzamanlı Algılama eksikliği gecikir. Bu nedenle, tüm genom analizi tarafından-dayandırılmış, etkin genom, farklı yerlerdeki direnci veriyor mutasyonların eş zamanlı algılama güncel yaklaşımları önemli avantajlar sunmaktadır.
(WGS) sıralama tüm genom genom genelinde risk değerlendirme ve ilaç direnci bakteri ve virüsleri13' te test için bir yaklaşım yanı sıra hastalık iletim sırasında salgınlar izlemek için başarıyla uygulamaya konmuştur. Nükleik asit sıralama teknolojisindeki son gelişmeler tüm genom sıralama (WGS) patojenler bir klinik olarak dava açmak-çevresinde-zamanında hem teknik hem de ekonomik açıdan uygulanabilir yaptık. DNA sıralama patojen kimlik ve Mikrobiyoloji laboratuvarları14,15,16' istihdam karakterizasyonu diğer yöntemler üzerinde önemli avantajlar sunmaktadır. İlk olarak, yüksek işlem hacmi, hız ve kalite ile evrensel bir çözüm sağlar. Sıralama mikroorganizmaların için uygulanabilir ve yerel veya bölgesel laboratuarlarında ölçek ekonomileri sağlar. İkinci olarak, ulusal ve uluslararası düzeyde karşılaştırma için mükellef bir 'gelecek-proof' biçiminde veri üretir. Son olarak, WGS potansiyel yarar tıpta genel veri tabanları ek klinik ve epidemiyolojik meta veriler17 içeren eşdeğer veri tabanları için bağlı başvuru genleri içeren hızlı büyüme tarafından artar ,18.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda WGS yarar antifungal direnç işaretleri Candida sppklinik yalıtır üzerinden tanımlaması için göstermiştir. 10 , 19 , 20. bu çoğunlukla yüksek-den geçerek benchtop sıralayıcılar, kurulan Biyoinformatik boru hatları ve21,22sıralama maliyeti azalan durumu nedeniyle olduğunu. Avantajı mantar WGS Sanger sıralama WGS sıralama birden çok genleri bir tek kaçak sağlanmıştır. Buna ek olarak, WGS Candida genleri roman mutasyonların uyuşturucu hedefleri belirlemek, genetik evrim ve klinik sıra türleri20,22,23ortaya çıkması izleyebilirsiniz. En önemlisi, içsel tedavisine direnç durumlarda, erken teşhis tedavi seçimi22,24önce direnç veriyor mutasyonların WGS yardımcı olabilir.
Burada, WGS etkin tarama antifungal ajanların farklı sınıflar için ilaç direnci ile ilgili mutasyonlar için fizibilite inceledi. Biz bir metodoloji WGS uygulanması son kullanıcı ve tanılama Mikoloji laboratuvar bakış açıları için mevcut. Biz üç üç ayrı klinik durumlarda hangi vitro echinocandins ve 5-flucytosine direnç antifungal tedavi aşağıdaki zaman içinde geliştirilen kültürlü çiftleri ayırmak bu analizde dahil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik onay bu çalışma için gerekli oldu.
1. alt kültür ve inoculum hazırlık Candida glabrata için
- Hangi de en az bir C. glabrata Amerikan tipi kültür koleksiyonu (ATCC) bilinen duyarlılık desenli içermelidir belirlenmesi için C.glabrata yalıtır panelini seçin.
- Alt kültür bir koloni dokunarak bir izole bir steril tek kullanımlık plastik döngü kullanarak ve'nın bir Sabouraud dekstroz agar (SDA) çizgiler plaka8.
- 24-48 h izole iyi büyüme ile saf kültür için 35 ° C'de SDA plaka kuluçkaya.
2. Antifungal duyarlılık tespiti
- 4-5 kolonileri yaklaşık 1 mm çapında taze subcultured C. glabrata almak için steril bir tek kullanımlık plastik döngü izole SDA plaka üzerinde kullanın. 3 mL steril distile su resuspend. De nazik tek tip süspansiyon elde etmek için pipetting tarafından karıştırın.
- 1 x 106 5 x 106 hücre/ml Densitometre 8kullanarak eşdeğeri olan 0.5 McFarland için hücre yoğunluğu ayarlayın.
- Ticari tahlil kullanarak duyarlılık testi yapmak (bkz: malzemeler tablo ve reaktifler) tüm C. glabrata üzerinde üretici talimatları izole ediyor. Sonuç MICs CLSI esaslarına göre antifungal ilaçların temel yalıtır duyarlılık yorumlayabilir ve rapor (tablo 1)8hazırlamak.
3. genomik DNA ekstraksiyon sıralama için
- 50 mm EDTA 1,5 mL tüp içinde 300 µL içinde bir loopful kolonileri taze yetişkin SDA plaka resuspend.
- Süspansiyon Tekdüzen olana zymolyase (10 mg/mL) 40 µL süspansiyon ve damlalıklı yavaşça 5 kez eklemek.
- Örnek 1-2 h hücre duvarı sindirimi için 37 ° C'de kuluçkaya. Oda sıcaklığında 5 min için serin.
- 14.000 × g 2 min için de süspansiyon santrifüj kapasitesi ve dikkatle süpernatant kaldır.
- Genomik DNA (tablo malzemeleri görmek) DNA ekstraksiyon kiti yönergeleri izleyerek ayıklayın.
- Resuspend 10 mm Tris arabellek (pH 7.5-8.5) kit ile sağlanan elüsyon tampon yerine 50 µL DNA Pelet ayıklanır.
- DNA saflık optik yoğunluğu (O.D) 260/280 nm25ölçümü tarafından kontrol edin.
4. genomik DNA miktar
- 1 x Floresans tahlil için üreticisinin yönergeleri dayalı tahlil kitinde sağlanan Tris EDTA (TE) arabelleği hazırlamak (tablo malzemeleri görmek).
- DNA örneği 2 µL 1 TE tahlil arabellek (son hacmi 100 µL, seyreltme faktörü 1:50) bir tek kullanımlık 96 iyi plaka x 98 µL ekleyerek sulandırmak. Bu seyreltme adım da kullanarak el ile bir çok kanallı pipet gerçekleştirilebilir veya otomatik sıvı iş istasyonu işleme tarafından.
- Lambda DNA sulandrarak standartları aralığını hazırlamak (100 µg/mL) Floresans tahlil Seti'nde (Tablo 2) sağlanan ve örnekleri ile birlikte ölçüm için içerir.
- DNA örnekleri ve reaksiyon için standartları için 100 µL floresan boya 100 µL seyreltilmiş ekleyin. Işıktan korunan oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
- Tüm örneklerini üreticisinin yönergeleri dayalı Floresans ölçmek.
- Floresans okuma kullanarak standart eğri çizmek ve DNA örnekleri özgün konsantrasyonu hesaplayın.
- DNA ve 10 mM Tris arabellek (pH 8) hacmi 0,2 ng/µL için DNA toplama ayarlamak için eklenecek belirlemek.
- DNA dilutions otomatik sıvı iş istasyonu işleme kullanarak gerçekleştirin. Bu adımı da el ile pipetting tarafından elde edilebilir.
5. DNA Kütüphane hazırlık
Not: Kütüphane hazırlık ve sıralamanın gerçekleştirilen üreticinin iletişim kuralları ve şirket (şekil 1A) tarafından sağlanan yönergeleri izleyerek (tablo malzemeleri görmek).
- Tagmentation ve PCR güçlendirme
- Yeni bir 96-şey sert kabuklu ince duvar tabağı etiketleyin.
- 5 µL quantified giriş DNA 0.2 ng/µL ekleyin (1 Toplam ng) plaka de her örneği için.
- Tagmentation arabellek 10 µL ve amplifikasyon arabelleği 5 µL de içeren her DNA ekleyin ve karışımı yavaşça pipet. Plaka ile bir yapışkan plaka mühür mühür.
- Plaka bir termal cycler yerleştirin ve aşağıdaki PCR programını çalıştırın: 5 min ve tutun 10 ° C'de 55 ° C Örnek 10 ° C ulaştığında hemen etkisiz hale getirmek için devam edin.
- 5 µL nötralizasyon arabelleği amplicon reaksiyon nötralize etmek için plaka ekleyin ve hafifçe karıştırın pipet. Plaka mühür ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- 15 µL PCR mastermix örnekleri için dizin ekleyin.
- Böylece her örnek dizin şablonu (Tablo 3) temel alan dizinler benzersiz bir kombinasyonu alır dizin astar tüpleri kullanılabilir bir kutu 96-şey plaka biçimi bir kurulum için kullanın.
- Tablo 3 şablonunda sağlanan sıra kullanarak dizin astar tüpler dizin plaka rafa (şekil 1B) düzenlemek ve endeksler şablonu konumunu kaydetmek.
- Tagmentation plaka ile eklenen PCR mastermix dizin plaka raf dizin tüpler sırayla yerleştirin.
- Dizin astar 1 tüplerde dikey düzenleme ve dizin astar 2 tüpler yatay düzenleme dizin rafa koymak. Bir çok kanallı pipet kullanarak, her örnek için dizin astar 5 µL dikkatle ekleyin.
- Dizin tüplerinin eski kapaklar endeksleri arasında çapraz bulaşma önlemek için yeni kapaklar ile değiştirin.
- 96-şey açık plaka tutkal kullanarak plaka mühür ve ikinci PCR aşağıdaki gibi yapın: 30 95 ° C s, 12 devredir 10 95 ° c s, 30 55 ° C s, 30 72 ° C s ve 5 min için 72 ° C.
- PCR Temizleme
- PCR ürünü derin-şey plaka tagmentation plakasına PCR-temizlik için transfer (tablo malzemeleri görmek).
- Girdap ticari manyetik boncuklar çözüm üretici yönergelerine dayanarak (tablo malzemeleri görmek) ve derin-şey plaka her PCR ürünü 30 µL boncuk ekleyin.
- Plaka 2 min için 1800 devirde bir Mikroplaka shaker çalkalanır ve oda sıcaklığında 5 dk'ya sallayarak olmadan kuluçkaya.
- Süpernatant temizledi kadar 2 min için manyetik bir stand plaka koyun.
- Süpernatant dikkatle hala manyetik stand üzerinde plaka ile atmak.
- Plaka ile taze hazırlanmış %80 etanol 200 µL manyetik kürsüye ekleyin.
- Plaka 30 için manyetik stand üzerinde kuluçkaya s ve dikkatle kaldırmak ve süpernatant boncuk bozmadan.
- Tekrar yıkama adımı yineleyin ve boncuk varsa 15 dk. Kaldır aşırı etanol için kurumasını bekleyin.
- Plaka manyetik standından kaldırın ve resuspension arabelleği 52,5 µL boncuk için ekleyin.
- Plaka 2 min için 1800 devirde bir Mikroplaka shaker çalkalanır ve sallayarak olmadan, oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.
- Plaka manyetik kürsüye yerleştirin ve temizlemek süpernatant sağlar.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak, dikkatle süpernatant ile 50 µL Temizleme plaka yeni bir sert kabuklu tabağa aktarın.
- Kütüphane normalleştirme
- Kütüphane normalleştirme reaktifler (tablo malzemeleri görmek) Üretici esaslarına göre çözülme.
- 20 µL süpernatant ile Temizleme plaka yeni bir derin-şey tabağa aktarın.
- Manyetik boncuk süspansiyon, 45 µL ekleyin ve bir plaka mühürleyen ile plaka mühür.
- Plaka üzerinde 30 dk için 1800 devirde bir Mikroplaka shaker sallamayın. Bu kuluçka süresi kritik ve aşılmaması gereken.
- Plaka 2 min için manyetik bir stand yerleştirin ve süpernatant (şekil 1B) işaretli doğrulayın.
- Kaldırmak ve süpernatant hala manyetik stand üzerinde plaka ile bir uygun tehlikeli atık kapsayıcısında atın.
- Manyetik standından plaka kaldırmak ve boncuk 45 µL yıkama arabelleği ile yıkayın.
- Yıkama arabellek ile plaka 5 min için 1800 devirde bir Mikroplaka shaker sallamayın.
- Zaman açık döner levha 2 dk ve atma süpernatant için manyetik stand yerleştirin.
- Manyetik standından plaka kaldırmak ve yıkama yıkama arabellek ile tekrar tekrar.
- Plaka manyetik standından kaldırın ve 0.1 N NaOH 30 µL ekleyin.
- 0.1 N NaOH ile plaka 5 min için 1800 devirde bir Mikroplaka shaker çalkalanır ve plaka 2 dk ya da sıvı temizlenene kadar manyetik mahkemeye yerleştirin.
- 30 µL elüsyon arabelleği yeni bir 96-şey sert kabuklu ince duvar son normalleştirilmiş Kütüphane tabak her şey için ekleyin.
- 30 µL süpernatant, normalleştirme tabaktan son hacim 60 µL yapmak için son normalleştirilmiş Kütüphane plakasına aktarın. Kitaplıkları artık sıralı hazırsınız.
- DNA Kütüphane konsantrasyonu tayini qPCR tarafından
- Mastermix, astar ve qPCR seti (tablo malzemeleri görmek) Üretici esaslarına göre sağlanan standartları çözülme.
- PCR reaktif mastermix ve astar üreticisinin yönergeleri izleyerek qPCR Seti'nde sağlanan birleştirmek ve aliquots-20 ° C'de depolanan
- DNA Kütüphane konsantrasyonu belirlemek için 1/8000 seyreltme 1:80 seyreltme (158 µL Tris arabelleğine 1: 100 den 2 µL) ardından bir 1: 100 seyreltme (1,5 µL DNA kitaplığına 148,5 µL Tris arabellek) gerçekleştirerek 10 mM Tris tampon (pH 8) kullanarak DNA kütüphanelerinin olun.
- 14000 × g 1 dk. için de santrifüj kapasitesi ve en az 1 dk. için 700 RPM seyreltme plaka sallamak.
- Son PCR reaksiyon 20 µL 4 µL seyreltilmiş DNA kütüphane veya DNA standartları ve mastermix 16 µL karıştırarak hazırlayın.
- Thermocycler ayarlarında üretici takip PCR gerçekleştirmek: 5 min, 95 35 döngüleri için 95 ° C ° C-30 ve 60 ° C için 45 s ve son 65 ° C ila 95 ° C eritebilir eğrisi analizi için için.
- Örnek DNA kütüphaneleri ve standartları Ct değerleri qPCR thermocycler edinin.
- Standart bir eğri standartları (Şekil 2) Ct değeri oluşturur. Üst ve alt QC aralığı ± tarafından ortalama üzerinden 3 kür tanımlayın. Örneğin, Ct değeri ortalama 13 döngüleri ise QC aralığı 16 ve 10 döngüleri arasında olur.
- Standart eğri ve Ct değerleri bireysel ve ortalama kitaplığına konsantrasyonları (ALC) belirlemek.
- Toplam havuza alınan kütüphaneler (PAL) kullanılmak üzere hacmi son sıralama hedef kitaplığı konsantrasyon 1.4 - 1.20: arasında olduğunu düşünürsek için aşağıda verilen hesaplama dayalı olmadığını.
Not: Ortalama qPCR elde edilen Kütüphane konsantrasyon ALC; = Toplam havuza alınan kütüphaneler (PAL) ALC = / 2; Denatüre PAL (DAL) PAL = * 0,666
Arabellek ile karışık DAL hacmine bağlı olarak, akış hücreye eklemek için kütüphane bölgedir. 65 µL kitaplığının arabelleği 835 µL eklediyseniz, örneğin, daha sonra bu seyreltme (Dil 1) 195 toplam hacmi 1300 µL için eklenir: (65/900) * dnPAL Dil1 =
Dil1 * (195/1300) son konsantrasyonu (1.4 - 1.20: arasında olmalı) =
6. Kütüphane havuz ve Benchtop sıralayıcıdaki Initiating sıralama
- Tezcan reaktif kartuşu üreticisinin esaslarına göre. 4 ° C depolama ambalajından yeni akışı hücreden çıkar ve oda sıcaklığında en az 30 dk önce sıralama getirmek. Arabellek kartuş ve prechill sıralama tampon kullanmadan önce çıkarın (bkz. tablo malzeme).
- Denetim Kitaplığı Kütüphane 5 µL karıştırarak hazırlayın (1 nM) ve 0.2 N NaOH 5 µL. Kısaca girdap ve Denetim Kitaplığı tek iplikçikler halinde denatüre için oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
- 200 mM Tris-HCl, pH 7 ve girdap 5 µL ekleyin. 235 µL prechilled sıralama arabellek ekleyin ve karışımı yavaşça. Toplam birim Denetim Kitaplığı son konsantrasyon 20 ile 250 µL değil am.
- Son normalleştirilmiş Kütüphane plaka bir tek düşük bağ 1.5 mL tüp sıralı için her örnek kitaplık 5 µL aktarma tarafından DNA kitaplıkları Havuzu.
- Havuza alınan kitaplığının 30 µL ve başka bir düşük bağlama tüp kitaplıklarda denatüre için 0.2 N NaOH 30 µL ekleyin.
- Girdap düşük bağ tüp ve kitaplıkları tek iplikçikler halinde denatüre için oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
- 200 mm Tris-HCl, pH 7 Tube tepki nötralize etmek için denatüre kütüphaneler ile 30 µL ekleyin.
- 65 µL etkisiz denatüre kitaplıkları süspansiyon ve önceden soğutulmuş sıralama arabellek ve girdap karıştırın 835 µL ekleyin.
- Şu son düşük bağlama tüpte birleştirmek: 195 µL etkisiz denatüre kitaplıkları, Denetim Kitaplığı ve sıralama arabelleği 1103.70 µL 1.30 µL. Düzgün karıştırın.
- Reaktif kartuşu belirlenen yerinde içine son Kütüphane mix (1300 µL) yükleyin.
- Set-up Sequencer proje ve örnek ayrıntıları girerek çalıştırmak sıralama yönergeleri izleyerek Web sitesi özel içilir.
- Yönergeleri izleyerek başlatın sıralama. Yük akımı hücre, reaktif kartuşu kitaplıklarla ve arabellek kartuş benchtop sıralayıcıdaki.
- Toplu iş numaraları tüm reaktif kitleri ve sıralama içinde kullanılan kartuşu kaydedin.
7. veri sıralama Web sitesinden indirin
- Sitede verilen üretici talimatları FASTQ dosyaları indirmek.
- İyi bir kalite kontrol için yüzde Q30 ≥ % 75 ve küme yoğunluğu ile 170-280 K/mm2 arasında olduğunu en iyi 200-210 K/mm2 (Tablo 4).
8. sıralama veri analizi
- FASTQ dosyaları sıralı örnek veri çözümleme entegre yazılım paketi almak (tablo malzemeleri görmek).
- Başvuru (select başvuru genom) eşleme, yerel yeniden düzenlenmesi ve varyant analizi (şekil 3A) ayarları kullanarak listelenen tablo 5'te, yani düzeltme listesinden özellikler ekleyerek yazılımında sıralama iş akışı oluşturun.
- İş akışı tek bir örnek veya örnek FASTQ dosyaları toplu seçerek çalıştırın ve belirlenen örnek klasörlerde çıktı dosyalarını kaydetmek.
- Rapor sırası kapsama derinlik, eşlenen bölgeler ve yapısal değişik listesi için genom (şekil 3B) oluşturun.
- Eşanlamlı olmayan tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) direnç ve virülans veriyor genlerdeki aramak için yapısal varyantları listesini kullanın.
- Rapor SNP konumu, gen ve dayanıklı veya duyarlı yalıtır (tablo 6) sayısı listeleyerek hazırlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onüç C. glabrata C. glabrata ATCC 90030 ve 12 yalıtır (izole CMRL1 CMRL12 için) klinik Mikoloji başvuru laboratuvarından oluşan, Westmead hastane, Sydney inceledi (tablo 1). Bu CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 ve CMRL-5/CMRL-6 elde önce ve sonra aralarında epidemiyolojik hiçbir bağlantıları ile antifungal tedavi yalıtır üç çift dahil 24 (tablo 1).
Mikrofonlar CLSI yorumsal kesme noktası dokuz antifungal ajanları için Yani, amfoterisin (AMB), Anidulafungin (anı), Micafungin (MIF), kullanılarak belirlenmiştir Caspofungin (CAS), 5-Flucytosine (5-FC), Posaconazole (POS), Voriconazole (VRC), itrakonazol () ITR) ve Flukonazol kullanımı (FLC). Candida parapsilosis ATCC 22019 ve Candida krusei ATCC 6258 kalite kontrol suşları kullanılmıştır. Ayrı tut moduyla çifti arasında CMRL-1 ve CMRL-2, ikinci ayrı tut CMRL-2 caspofungin (MIC 8 0,12 mg/L, tablo 1 vs) dayanıklı oldu. CMRL-2 de anidulafungin ve micafungin doz benzer orantılı artar vardı (≥ 0.5 mg/L) vitro direnç tüm üç echinocandins24sonuçlanan. Aynı şekilde, izole CMRL-4 echinocandin direnç (tablo 1) izole CMRL-3 daha geliştirmişti. Üçüncü çifti arasında ayrı tut CMRL-6 5 flucytosine mikrofon vardı (> 64 vs 0.06 mg/L)24. Her iki ayrı tut bu çiftleri duyarlı/yaban-tipi (WT) test diğer antifungal ajanları olduğunu. Ayrı tutma CMRL-6 ve CMRL-12 için tüm azoles dayanıklı veya WT sigara bulundu. CMRL-7 Flukonazol ve voriconazole (tablo 1) için WT dayanıklıdır. C. glabrata ATCC 90030 ve yalıtır CMRL-8 CMRL-11'e duyarlı duyarlı/WT tüm antifungal ajanları24idi.
13 yalıtır WGS benchtop sequencer kullanarak gerçekleştirildi. Bir ortalama olarak, bir orta çıkış sıralama çalışma vermiştir 27-40 GB veri hata oranı 0.5-1.4 arasında etrafında %. Ortalama yüzde elde Q30 genellikle yaklaşık % 80-85 oldu. Akış-hücre küme yoğunluğu (K/mm2) (Tablo 4) 200-250 arasında değişiyordu. Bu çalışmada elde edilen ham sıra veriler proje numarası PRJNA310057 altında NCBI sıra okuma Arşiv (SRA) adlı yatırılır. sıralama % 98'i tümleşik veri analiz yazılımı analizi ile C. glabrata başvuru genom (zorlanma CBS138) için eşlenen okur. Ortalama derinlik kapsama 75 x okuma uzunluğu 143-bp. yapısal varyant algılama tanımlanan daha fazla 50, 000 SNPs izole başına ortalama ile okuyun. Özellikle, CMRL1/CMRL-2, her izole üzerinde bulunan toplam SNPs 79,000 CMRL 3/CMRL-4 civarında olduğunu zorlanma çiftleri analiz ederken SNPs toplam sayısı 60.000 çevresinde ve CBS13824için karşılaştırıldığında 56.000 daha çok CMRL-5/CMRL-6 için... SNP fark arasında bir gerginlik çift yalıtır karşılaştırıldığında daha az 25 oldu.
FKS1, FKS2 ve FKS3 (echinocandin direnç), FCY1 ve FCY2 (5-biyolojik analiz24için özellikle, seçilmiş olan direnç bilinen yalıtır duyarlılık profiline dayalı flucytosine direnç) ve ERG9, ERG11, CgCDR1, CgPDR1 ve CgFLR1 (azole direnç). Genlerin bilinen mutasyonlar ve SNP yinelenme sıklığını kontrol edildi. Genlerdeki ile eşanlamlı sigara SNPs yani ≥20 derinlik kapsama okumak sadece yüksek kaliteli SNPs (hq-SNPs) özel olarak incelenmiştir.
Özellikle, FKS mutasyonlar her iki echinocandin dayanıklı yalıtır24genom tespit edilmiştir. Bir tek FKS2 mutasyon S629P ve CMRL-4, FKS2 mutasyon S663P CMRL-2 ilk iki çift, echinocandin dayanıklı yalıtır harbored (tablo 6). Üçüncü çifti, CMRL-5 (5-flucytosine duyarlı) ve CMRL-6 (dayanıklı) (tablo 6) FCY2 (Ala237Thr) içinde SNP bulundu. Ancak, FCY2 SNPs da diğer phenotypically WT yalıtır (CMRL-1, CMRL-2, CMRL-10)24' te bulunmuştur. CMRL-12 ve yalıtır CMRL-6 onların pan-azole dayanıklı/sigara için önemli-WT karakter ve CgCDR1 (azole sızma pompalar kodlama) ve CgPDR1 (sızma pompalar düzenleyen transkripsiyon faktörü kodlama) SNPs vardı (tablo 6)26 ,27. Başka bir sızma pompa gen mutasyonların varlığı, her iki azole duyarlı ve azole dayanıklı yalıtır26,28 CgFLR1 oluştu. ERG9 (kodlama skualen synthase) içinde SNPs için mutasyonlar göstermiştir ama hiçbir mutasyonlar ERG1124saat içinde tespit edildi.
WGS çözümleme Ayrıca birden çok eş anlamlı olmayan SNPs genlerdeki Candida hücre duvarı yapışma Yani, EPA1, EPA6, PWP2 ve PWP5ortaya. EPA6 mutasyonlar 9/12 yalıtır mevcuttu. PWP2 ve PWP5 SNPs de yalıtır CMRL-1 ve CMRL-1124hariç hemen hemen tüm yalıtır yoktu.
| İzole | AMB | ANI | FİNANS YÜKSEK LİSANS | CA'LARI | 5-FC | POS | VRC | ITR | FLC | Antifungal duyarlılık yorumlanması | Genler WGS tarafından tanımlanan direnç veriyor | ||
| CMRL-1 | 0,5 | 0.03 | < 0.008 | 0,12 | < 0,06 | 0,5 | 0,12 | 0,25 | 8 | Tüm duyarlı | - | ||
| CMRL-2 | 0,5 | 1 | 1 | 8 | < 0,06 | 0,25 | 0,06 | 0,12 | 4 | Bütün echinocandins sadece dayanıklı | FKS1 | ||
| CMRL-3 | 0,25 | 0,015 | 0,015 | 0,12 | < 0,06 | 1 | 0,25 | 0,5 | 8 | Tüm duyarlı | - | ||
| CMRL-4 | 2 | 1 | 1 | > 8 | < 0,06 | 0,5 | 0,12 | 0,25 | 8 | Bütün echinocandins sadece dayanıklı | FKS2 | ||
| CMRL-5 | 1 | 0,12 | 0,015 | 0,12 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 16 | Tüm duyarlı | - | ||
| CMRL-6 | 1 | 0,06 | 0,015 | 0,06 | > 64 | > 8 | 8 | > 16 | 256 | 5-FC ve azoles karşı dayanıklıdır | FCY2, CgPDR1, CgCDR1 | ||
| CMRL-7 | 0,25 | 0,06 | 0,015 | 0,25 | < 0,06 | 1 | 8 | 0,5 | 256 | Bütün azoles sadece dayanıklı | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| CMRL-8 | 0,5 | 0.03 | 0.008 | 0,06 | < 0,06 | 0,5 | 0,25 | 0,25 | 4 | Tüm duyarlı | - | ||
| CMRL-9 | 1 | 0.03 | 0,015 | 0,25 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 1 | 16 | Tüm duyarlı | - | ||
| CMRL-10 | 1 | 0.03 | < 0.008 | 0,5 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 16 | Tüm duyarlı | - | ||
| CMRL-11 | 0,5 | 0.03 | < 0.008 | 0.03 | < 0,06 | 0,5 | 0,25 | 0,5 | 8 | Tüm duyarlı | - | ||
| CMRL-12 | 0,5 | 0.03 | 0,015 | 0,06 | < 0,06 | > 8 | 2 | 8 | 128 | Bütün azoles sadece dayanıklı | CgPDR1, CgCDR1, CgFLR1 | ||
| ATCC 90030 | 1 | 0.03 | 0,015 | 0,06 | < 0,06 | 1 | 0,5 | 0,5 | 8 | Tüm duyarlı | - | ||
| Kısaltmalar: MIC, minimum inhibitör konsantrasyonu; AMB, Amfoterisin B; ANI, anidulafungin; CAS, caspofungin; FLC, flukonazol; ITR, itrakonazol; Finans Yüksek Lisans, micafungin; POS, posaconazole; VRC, voriconazole; 5-FC, 5-flucytosine. | |||||||||||||
Tablo 1. CMRL-1/CMRL-2 de dahil olmak üzere 13 vitro duyarlılık Candida glabrata izole ediyor, CMRL-3/CMRL-4 ve CMRL-5/CMRL-6 öncesi ve antifungal tedavi sonrası elde edilen çiftleri ayırmak
| Standartları | DNA standart birim (μL) | 1 X TE arabellek | Reaktif (μL) | 96-şey plaka (μL) Toplam | Son DNA toplama (ng/mL) |
| STD-Pico 1 | 8 (Standart DNA tüp 100 µg/mL) | 1992 | 100 | 200 | 1000 |
| STD-Pico 2 | 10 (dan Std-Pico 1) | 90 | 100 | 200 | 100 |
| STD - Pico 3 | 5 (dan Std-Pico 1) | 95 | 100 | 200 | 50 |
| STD-Pico 4 | 2 (den Std-Pico 1) | 198 | 100 | 200 | 10 |
| STD-Pico 5 | 10 (Std-Pico 4) | 90 | 100 | 200 | 1 |
| Boş | - | 100 | 100 | 200 | Boş |
Tablo 2. DNA miktar için standart eğri oluşturmada standartların hazırlanması için iletişim kuralı
Resim 1 . Sıralama iş akışı: (A) için kütüphane hazırlık ve sıralamanın bir benchtop sequencer üzerinde önemli analitik adımları bir taslağını. (B) için DNA Kütüphane hazırlık (soldan sağa) gibi önemli bileşenleri plaka raf dizin oluşturma sırasında endeksi düzenlenmesi için dizin ve manyetik boncuk için derin 96-şey plakalı manyetik raf DNA kütüphanelerinin temizlik dayalı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Dizin Kümesi A |
N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S502 | Örnek 1 | Örnek 2 | Örnek 3 | Örnek 4 | Örnek 5 | Örnek 6 | Örnek 7 | Örnek 8 | Örnek 9 | Örnek 10 | Örnek 11 | Örnek 12 |
| B | S503 | Örnek 13 | Örnek 14 | Örnek 15 | Örnek 16 | Örnek 17 | Örnek 18 | Örnek 19 | Örnek 20 | Örnek 21 | Örnek 22 | Örnek 23 | Örnek 24 |
| C | S505 | Örnek 25 | Örnek 26 | Örnek 27 | Örnek 28 | Örnek 29 | Örnek 30 | Örnek 31 | Örnek 32 | Örnek 33 | Örnek 34 | Örnek 35 | Örnek 36 |
| D | S506 | Örnek 37 | Örnek 38 | Örnek 39 | Örnek 40 | Örnek 41 | Örnek 42 | Örnek 43 | Örnek 44 | Örnek 45 | Örnek 46 | Örnek 47 | Örnek 48 |
| E | S507 | Örnek 49 | Örnek 50 | Örnek 51 | Örnek 52 | Örnek 53 | Örnek 54 | Örnek 55 | Örnek 56 | Örnek 57 | Örnek 58 | Örnek 59 | Örnek 60 |
| F | S508 | Örnek 61 | Örnek 62 | Örnek 63 | Örnek 64 | Örnek 65 | Örnek 66 | Örnek 67 | Örnek 68 | Örnek 69 | Örnek 70 | Örnek 71 | Örnek 72 |
| G | S510 | Örnek 73 | Örnek 74 | Örnek 75 | Örnek 76 | Örnek 77 | Örnek 78 | Örnek 79 | Örnek 80 | Örnek 81 | Örnek 82 | Örnek 83 | Örnek 84 |
| H | S511 | Örnek 85 | Örnek 86 | Örnek 87 | Örnek 88 | Örnek 89 | Örnek 90 | Örnek 91 | Örnek 92 | Örnek 93 | Örnek 94 | Örnek 95 | Örnek 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Küme B dizin | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S502 | Örnek 1 | Örnek 2 | Örnek 3 | Örnek 4 | Örnek 5 | Örnek 6 | Örnek 7 | Örnek 8 | Örnek 9 | Örnek 10 | Örnek 11 | Örnek 12 |
| B | S503 | Örnek 13 | Örnek 14 | Örnek 15 | Örnek 16 | Örnek 17 | Örnek 18 | Örnek 19 | Örnek 20 | Örnek 21 | Örnek 22 | Örnek 23 | Örnek 24 |
| C | S505 | Örnek 25 | Örnek 26 | Örnek 27 | Örnek 28 | Örnek 29 | Örnek 30 | Örnek 31 | Örnek 32 | Örnek 33 | Örnek 34 | Örnek 35 | Örnek 36 |
| D | S506 | Örnek 37 | Örnek 38 | Örnek 39 | Örnek 40 | Örnek 41 | Örnek 42 | Örnek 43 | Örnek 44 | Örnek 45 | Örnek 46 | Örnek 47 | Örnek 48 |
| E | S507 | Örnek 49 | Örnek 50 | Örnek 51 | Örnek 52 | Örnek 53 | Örnek 54 | Örnek 55 | Örnek 56 | Örnek 57 | Örnek 58 | Örnek 59 | Örnek 60 |
| F | S508 | Örnek 61 | Örnek 62 | Örnek 63 | Örnek 64 | Örnek 65 | Örnek 66 | Örnek 67 | Örnek 68 | Örnek 69 | Örnek 70 | Örnek 71 | Örnek 72 |
| G | S510 | Örnek 73 | Örnek 74 | Örnek 75 | Örnek 76 | Örnek 77 | Örnek 78 | Örnek 79 | Örnek 80 | Örnek 81 | Örnek 82 | Örnek 83 | Örnek 84 |
| H | S511 | Örnek 85 | Örnek 86 | Örnek 87 | Örnek 88 | Örnek 89 | Örnek 90 | Örnek 91 | Örnek 92 | Örnek 93 | Örnek 94 | Örnek 95 | Örnek 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Küme C dizin | N701 | N702 | N703 | N704 | N705 | N706 | N707 | N710 | N711 | N712 | N714 | N715 | |
| A | S513 | Örnek 1 | Örnek 2 | Örnek 3 | Örnek 4 | Örnek 5 | Örnek 6 | Örnek 7 | Örnek 8 | Örnek 9 | Örnek 10 | Örnek 11 | Örnek 12 |
| B | S515 | Örnek 13 | Örnek 14 | Örnek 15 | Örnek 16 | Örnek 17 | Örnek 18 | Örnek 19 | Örnek 20 | Örnek 21 | Örnek 22 | Örnek 23 | Örnek 24 |
| C | S516 | Örnek 25 | Örnek 26 | Örnek 27 | Örnek 28 | Örnek 29 | Örnek 30 | Örnek 31 | Örnek 32 | Örnek 33 | Örnek 34 | Örnek 35 | Örnek 36 |
| D | S517 | Örnek 37 | Örnek 38 | Örnek 39 | Örnek 40 | Örnek 41 | Örnek 42 | Örnek 43 | Örnek 44 | Örnek 45 | Örnek 46 | Örnek 47 | Örnek 48 |
| E | S518 | Örnek 49 | Örnek 50 | Örnek 51 | Örnek 52 | Örnek 53 | Örnek 54 | Örnek 55 | Örnek 56 | Örnek 57 | Örnek 58 | Örnek 59 | Örnek 60 |
| F | S520 | Örnek 61 | Örnek 62 | Örnek 63 | Örnek 64 | Örnek 65 | Örnek 66 | Örnek 67 | Örnek 68 | Örnek 69 | Örnek 70 | Örnek 71 | Örnek 72 |
| G | S521 | Örnek 73 | Örnek 74 | Örnek 75 | Örnek 76 | Örnek 77 | Örnek 78 | Örnek 79 | Örnek 80 | Örnek 81 | Örnek 82 | Örnek 83 | Örnek 84 |
| H | S522 | Örnek 85 | Örnek 86 | Örnek 87 | Örnek 88 | Örnek 89 | Örnek 90 | Örnek 91 | Örnek 92 | Örnek 93 | Örnek 94 | Örnek 95 | Örnek 96 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Set D dizin | N716 | N718 | N719 | N720 | N721 | N722 | N723 | N724 | N726 | N727 | N728 | N729 | |
| A | S513 | Örnek 1 | Örnek 2 | Örnek 3 | Örnek 4 | Örnek 5 | Örnek 6 | Örnek 7 | Örnek 8 | Örnek 9 | Örnek 10 | Örnek 11 | Örnek 12 |
| B | S515 | Örnek 13 | Örnek 14 | Örnek 15 | Örnek 16 | Örnek 17 | Örnek 18 | Örnek 19 | Örnek 20 | Örnek 21 | Örnek 22 | Örnek 23 | Örnek 24 |
| C | S516 | Örnek 25 | Örnek 26 | Örnek 27 | Örnek 28 | Örnek 29 | Örnek 30 | Örnek 31 | Örnek 32 | Örnek 33 | Örnek 34 | Örnek 35 | Örnek 36 |
| D | S517 | Örnek 37 | Örnek 38 | Örnek 39 | Örnek 40 | Örnek 41 | Örnek 42 | Örnek 43 | Örnek 44 | Örnek 45 | Örnek 46 | Örnek 47 | Örnek 48 |
| E | S518 | Örnek 49 | Örnek 50 | Örnek 51 | Örnek 52 | Örnek 53 | Örnek 54 | Örnek 55 | Örnek 56 | Örnek 57 | Örnek 58 | Örnek 59 | Örnek 60 |
| F | S520 | Örnek 61 | Örnek 62 | Örnek 63 | Örnek 64 | Örnek 65 | Örnek 66 | Örnek 67 | Örnek 68 | Örnek 69 | Örnek 70 | Örnek 71 | Örnek 72 |
| G | S521 | Örnek 73 | Örnek 74 | Örnek 75 | Örnek 76 | Örnek 77 | Örnek 78 | Örnek 79 | Örnek 80 | Örnek 81 | Örnek 82 | Örnek 83 | Örnek 84 |
| H | S522 | Örnek 85 | Örnek 86 | Örnek 87 | Örnek 88 | Örnek 89 | Örnek 90 | Örnek 91 | Örnek 92 | Örnek 93 | Örnek 94 | Örnek 95 | Örnek 96 |
Tablo 3. Şablon farklı dizin düzenleme /
Resim 2 : Standartları Ct değerleri ile oluşturulan bir standart grafik. Çoğaltmaları kitaplıklarda örnek Ct değerinden ortalama Kütüphane konsantrasyonu belirlemek için standart eğri yolunu kesmek ve eğim değerlerini kullanın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Ölçümleri | Standart değerleri | Elde edilen değerler (ortalama) |
| Verim | 32.5 Orta çıkış için - 50 Gb | Orta çıkış için 42 Gb |
| Yüksek çıkış için 100-130 Gb | Yüksek çıkış için 120 Gb | |
| Yüzde S30 | ≥ %75 | % 80 |
| Küme yoğunluğu | 170-230 K/mm2, en iyi 200 K/mm2 | 210 K/mm2. |
| Filtreler geçen kümeleri | > %70 | %89.09 |
| Yoğunluk döngüsü tarafından | 1000 flowcell her fayansları için yukarıda | 1500 flowcell her fayansları için yukarıda |
| Hata oranı | 1,5 | 1.4 |
Tablo 4. Standart bir sıralama Benchtop Sequencer çalıştırmak için ölçütleri
Şekil 3 : Veri analiz yazılımı sıralama. (A) sıra düzeltme de dahil olmak üzere istediğiniz bir iş akışı oluşturun, başvuru ve kalite için eşleme göre değişken algılama. İş akışı örnek FASTQ dosyaları (bireysel veya toplu iş içinde birden fazla örnekleri) seçerek çalıştırın. (B) başvuru konumunu, kapsamı, nükleotid değişim ve örnek dizileri analizi için elde edilen amino asit değişiklik gösteren yapısal değişik listesi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| 1. trim dizileri | Kullanılan ayarı |
| Üsleri döşeme | Varsayılan ayarları |
| Uzunluğu en fazla nükleotit sayısı ile okur süzme | 1000 |
| Uzunluğu en az sayıda nükleotid ile okur süzme | 50 |
| 2. okuma başvurmak için eşleme | |
| Seçili başvuru | CBS138 |
| Modu maskeleme ile başvuru maskeleme | Hiçbir maskeleme |
| Eşleme seçenekleri | Varsayılan ayarları |
| 3. Yerel yeniden düzenlenmesi | |
| Hizalama ayarları | Varsayılan ayarları |
| 4. kalite varyant algılama dayalı | |
| Mahalle RADIUS | 5 |
| En az bir boşluk ve uyuşmazlığı sayısı | 2 |
| En küçük mahalle kalite | 15 |
| En az orta kalite | 20 |
| Okuma filtreleri | Varsayılan ayarları |
| Asgari sigorta kapsamı | 4 |
| En az varyant sıklığı (%) | 75 |
| Varyant filtreleri | Varsayılan ayarları |
| En çok beklenen gen (Ploitlik) | 2 |
| Genetik kod | Standart |
Tablo 5. İş akışı parametreleri ve yazılım ayarları
| Yapısal varyant nükleotit pozisyon | Gen | İlaç (lar) | Bulundu Sayısı Yalıtan |
Dayanıklı yalıtır | Duyarlı yalıtır | |
| SNP_Cg_95352_S629P_fks1 | CgFKS1 | CA'LARI, ANI, FİNANS YÜKSEK LİSANS | 1 | CMRL-2 | - | |
| SNP_Cg_375361_S633P_fk2 | CgFKS2 | CA'LARI, ANI, FİNANS YÜKSEK LİSANS | 1 | CMRL-4 | - | |
| SNP_Cg_285870_A237T_fcy2 | CgFCY2 | 5-FC | 2 | CMRL-6 | CMRL-5 | |
| SNP_Cg_286311_I384F_fcy2 | CgFCY2 | 5-FC | 2 | 0 | CMRL-1, CMRL-2 | |
| SNP_Cg_720995_C128F_erg9 | CgERG9 | FLC, POS, VRC, ITR | 3 | CMRL-6 | CMRL-5, CMRL-10 | |
| SNP_Cg_48683_R376Q_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-6 | - | |
| SNP_Cg_50384_G250N_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_49640_P695L_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | 0 | CMRL-11 | |
| SNP_Cg_49858_N768D_pdr1 | CgPDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
| SNP_Cg_203787_H58Y_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 5 | CMRL-6, CMRL-12 | CMRL-5, CMRL-10, CMRL-11 | |
| SNP_Cg_205529_M638I_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_206938_N1108S_cdr1 | CgCDR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-7 | - | |
| SNP_Cg_589884_I116V_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 4 | CMRL-7 | CMRL-1, CMRL-2, CMRL-9 | |
| SNP_Cg_589470_V254I_flr1 | CgFLR1 | FLC, POS, VRC, ITR | 1 | CMRL-12 | - | |
Tablo 6. Varyant bulunduğu yapısal genler rapor C. glabrata yalıtır sayısında buldum antifungal ilaç direnci bağlı
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, fizibilite, yaklaşık zaman çizelgeleri ve hassas WGS-güdümlü algılama C. glabratailaç direnci belirledi. Kütüphane hazırlık ve sıralama gerçekleştirme süresi (TAT) dört gün ve raporlama analiz sonuçları iki gün oldu. Bu kültür plakaları ve Sanger duyarlılık deneyleri için benzer en az bir miktar TAT ile karşılaştırır anlamlı olarak daha yüksek sayıda örnekleri sıralama. Yaklaşık 30-90 C. glabrata genleri hücre içi akış kapasitesi, 80-%100 sıralama kapsamı ile sıralama göre sıralı. Nasıl yapılacağını bir in-house WGS laboratuvar kurulumu gerçekleştirildi, bu çalışmanın maliyeti/kaynak gereksinimleri alınmaya başlanmıştır Sanger maliyetinin geçerli eşdeğer sıralama ve sonda tabanlı deneyleri ile en düşük AUD 80-100 örnek başına bir tahmini maliyet. Tüm yalıtır duyarlılık görsel okuma ayna kullanarak okunan bir ticari tahlil paketi tarafından tespit. Kültür büyüme değişim Renkölçer büyüme göstergesi mavi tarafından belirtilen pembe. Mikrofon okumak ilk mavi iyi pembe (büyüme) bir dizi Yani, kuyuları sonra önemli ölçüde büyümesini engeller antifungal ajan en düşük konsantrasyon. WGS için genomik DNA kitaplıkları Kütüphane hazırlık Seti kullanılarak hazırlanmıştır. Ayrı tutma kitaplıkları tarafından qPCR sayısal. Quantified kütüphaneler birlikte benchtop sequencer gerçekleştirilen çalıştırmak son sıralama için havuza alınan.
Bizim analizi, yükseltilmiş vitro mikrofon karşı ilaçlar ile iyi yalıtır direnişinde veriyor genler SNPs varlığında korelasyon. Tespit FKS2 mutasyonlarınFKS1 S629P ve S663P açıkça echinocandins direnci ile ilişkili bulunmuştur. Her iki mutasyon fenotipik direnç29,30tanımak iyi bilinmektedir. Eşzamanlı genom çapındaki sıralama aynı zamanda direnç etkinleştirme ile ilgili olan 5-flucytosine (gen FCY2) ve azole direnç (CgPDR1, CgCDR1 ve CgFLR1) bağlantılı genlerdeki mutasyonlar ortaya / sızma pompalar26,27,28olarak overexpression. Ancak, ek olarak fonksiyonel onaylanması için azole ve 5-flucytosine direnç31 ihtiyaçlarına bağlı genlerdeki mutasyonlar etkileri gen ifade düzeyini değerlendirmek için analiz eder. İlginçtir, SNPs çok sayıda hücre duvarı adhesins tüm yalıtır32,33içinde de bulundu. Yapışma gen biyofilm oluşumu, kodlar EPA6, mutasyonların33nispeten sık oluştu. Ayrıca, CMRL-3, CMRL-4 ve CMRL-8 azole direnç genleri yoksun mutasyonların EPA1 ve EPA624,34yok belgelenmiş SNPs vardı izole ediyor. Ancak, genel olarak, adhesins ve uyuşturucu MICs SNPs arasında hiçbir ilişki dahil test yalıtır az sayıda nedeniyle bulundu.
Klinik Mikoloji WGS uygulanmasında sağlam kalite yönetim sisteminin uygulanması gerekir. Her adım deneyinde eşlik kaliteli genomik DNA ve kalite kontrol denetim noktaları için bir iyi WGS sonuç esastır. C. glabrata örnek DNA saflığı gönderilmiş Kütüphane hazırlık UV Absorbans yöntemini kullanarak onaylanabildiğini için (260/280 Absorbans nm ve 260/230 nm25. Deneyim, C. glabrata için DNA 260/280 1,8-2 ve 260/230 2-2.2 arasında için önerilen Aralık içinde olması bekleniyor. DNA özler bu kalite gereksinimleri karşılamıyorsa, ek arıtma etanol yağış tarafından gerçekleştirilebilir. Tagmentation benzersiz barkod dizileri endeksi astar olarak (çoğullama) sıralama sırasında birden çok örnek farklılaşma sağlar olarak adlandırılan ekleme önemli bir adımdır. Bu nedenle, dizin oluşturma sürecinde ilave dikkat indisler benzersizliğini sağlamak için dizin tüpler ve örnekleri arasında çapraz bulaşma önlemek için alınmalıdır. Normalleştirme sıralama sıralama veri içinde önyargı tanıtmak örnek DNA kütüphanelerde kaynaklanan herhangi bir fark ortadan sağlar. Bir normalleştirme adım bir boncuk dayalı temizlik genellikle aşırı DNA Kütüphane parçaları ve varyasyonları Kütüphane hazırlık sırasında ortaya çıkabilecek Kütüphane boyutunda izin verir kullanma. Bu nedenle 30 dk kuluçka için en iyi küme yoğunluğu önemlidir. Etkileri veri kalitesi sıralama sırasında büyük amplifikasyon tarafından oluşturulan örnek kütüphaneleri klonal kümeleri yoğunluğu olan küme yoğunluğu Q30 puanları ve toplam veri çıkışı gibi. Underclustering yüksek veri kalitesi vermek olmayabilir iken, aynı zamanda düşük Q30 puanları overclustering ise çıkış daha düşük veri neden olur. DNA kütüphaneler-meli var olmak özgür veri kalitesi sıralama ile engelleyebilir manyetik boncuk kalıntı PCR Temizleme ve normalleştirme olarak sırasında. QPCR en az birkaç temsilcisi örnek kütüphaneler de dahil olmak üzere bir başvuru yük endeksi belirli bir dizi olumlu denetimi (ATCC suşu C. glabrata bu durumda) olarak gerçekleştirilmelidir. Ortalama Ct değerler 15-18 döngüleri arasında olması gerekir. Herhangi bir örnek bu aralıkta sıralama çalıştırmak için kabul edilebilir olarak kabul edilir. Ancak, Ct değerleri bu aralığın dışında qPCR yinelenmelidir. Örnekleri bazen Kütüphane hazırlık sırasında qPCR düşük kaliteli giriş DNA veya hata nedeniyle başarısız olabilir. Hesaplamalar olumlu denetiminden dayanarak, iyi dizisi veri üretecektir kütüphanelerin en düşük konsantrasyon kurulmalıdır. QPCR elde edilen kütüphanelerin ortalama konsantrasyon kullanarak, sıralama için eklenecek son Kütüphane hacmi hesaplanır. Bu önerilen son Kütüphane konsantrasyonu arasında 1.4 - 1.20: üretmek gerekir. C. glabrata kitaplıkları için 16-18 devir ortalama Kütüphane konsantrasyon aralığı 300-500 arasında C. glabrata ATCC izole kullanarak kurulan Ct Aralık oldu am. İlgili birimin havuza alınan denatüre DNA kütüphanelerinin 60-65 µL 200-250 K/mm2arasında bir küme yoğunluğu aralığının Aralık içinde yapıldı.
Sırası veri dosyalarını daha fazla analiz daha önce demultiplexed. Bu sıralama yerini almıştır sonra onların bar kodları kullanarak ilgili arşivlerine sıralama tarafından sağlanabilir. Kalite düzeltme FASTQ dosyaların isteğe bağlı bir adım önce veri analizi gerçekleştirilebilir. WGS den yalıtır sıra okuma bir standart yazılım paketinde oluşturulan özel bir iş akışı kullanarak analiz edildi. Bu düşük kaliteli okuma kırparak ve referansı Candida genom eşleme izin verdi. Başvuru genom, CBS138, Candida genom veritabanı (ÇGD) üzerinden indirilen ve iş akışı analiz önce bağlı. DNA varlığı Candida genom yineler (örneğin, adhesin genler DNA tekrarlar var) ve uyum kısa okuma dizileri ve SNP arama karmaşık. Bu ek yerel yeniden düzenlenmesi eşlenen sıralarının tarafından geliştirilebilir. İş akışı çıktısı ek açıklama eklenen genleri eşanlamlı sigara ve eşanlamlı SNP pozisyonları ve kapsamı ile sağlanan bir yapısal değişik listesi oldu. Bu faiz genlerinde SNPs tanımlamak ve son tahlilde rapor yalıtır (tablo 6) için hazırlamak için kullanıldı.
Bizim çalışma ve yaklaşım bazı sınırlamalar kabul. Bizim rapor yalıtır az sayıda temel ve klinik Mikoloji için standart mantar resistome veritabanı yok. Sanger DNA sıralama şu anda klinik laboratuvarlar için daha kolay erişilebilir olmakla birlikte, aynı anda Candida spp. ilaç direnci görüşmek birden çok gen mutasyonlarının algılamak için yetenek sınırlıdır (> 20 FKS mutasyonlar için echinocandin direnç yalnız). Konsolidasyon patoloji hizmetleri ve azalan sıralama maliyeti, WGS Sanger üzerinde kullanarak pratiklik ile sıralama, artırmak muhtemeldir. Ancak, önemli bir göz ilk laboratuvar kurulumu ve WGS enstrüman uygulama maliyetini yanı sıra son kullanıcı eğitimi laboratuvar personeli var. Uzun vadeli maliyeti aslında, tedarik sıralama reaktif kitleri ve aksesuarları içerir. WGS araç içi ise ek maliyet ve daha yüksek bir TAT beklenmelidir. Ayrıca, DNA genleri tekrar serilerinde varlığı ve uyum kısa okuma dizileri ve SNP arama karmaşık. Yüksek kaliteli başvurusu genleri sıralı kullanma durumu uzun okuma teknolojileri SNP kimlik kalitesini sürdürmek için yardımcı olacaktır.
Gelecekte, WGS klinik tedavide iyileştirmeler getirmek için kolayca erişilebilir ve klinisyenler20,22tarafından yorumlanmış hızlı izleme raporlama zamanında tanı ayarlarını tarafından bekleniyor. Bu iyileştirici ve güncel WGS antifungal ilaç direnci veritabanları roman ve antifungal direnç anlaması için doğrulayıcı mutasyonlar gelişimi ile elde edilebilir. Gibi daha fazla genleri klinik Mayalar fenotipik uyuşturucu duyarlılık analizi için kullanılabilir, roman işaretleri ve antifungal ilaç direnci mekanizmaları keşfedilmeyi muhtemeldir. Bu gelişmeler önemli ölçüde tedavi hataları nedeniyle çoklu ilaç direnci ve uyuşturucu toksisite riskini azaltacaktır. Sonuç olarak, uygun kalite yönetim protokolleri ile sonraki nesil sıralama direnç www.cdc.gov/drugresistance fenotipik Mikoloji laboratuvarlarda test çoğaltmak olabilir Candida glabrata veriyor mutasyonlar tespiti genom geniş sağlar. Klinik Candida spp hızlı genom sıralama tarafından sağlanan yorumlara temelde direnç mekanizmaları anlayışımızı antifungal ajanların farklı sınıflar için değiştirmek ve hasta ile invaziv yönetimini geliştirmek Mantar hastalıkları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının ve hiçbir çıkar çatışması ifşa etmek hakkına sahiptir.
Acknowledgments
Bu eser enfeksiyon hastalıkları ve Mikrobiyoloji, halk sağlığı Merkezi tarafından desteklenmiştir. Yazarlar bu çalışma için diğer bir fon almadım. Yazarlar Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann ve Ranjeeta Menon onların uzman tavsiyesi ve tüm genom sıralama deney ile yardım için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
References
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
- Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
- Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
- Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
- Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
- Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
- Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , USA. Fourth Informational Supplement (M27-S4) (2012).
- Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
- Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
- Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
- Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
- Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
- Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
- Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
- Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
- Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
- Mardis, E. R.
- Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J.
- Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
- Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
- Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
- Cannon, R. D., et al.
- Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
- Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
- Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
- Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
- Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
- de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
- Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).
