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Chemistry

闪烁表面增强拉曼散射的观测与分析

Published: January 11, 2018 doi: 10.3791/56729
Automatic Translation
1
1Department of Chemistry, Kwansei Gakuin University

Summary

该协议描述了由于在银色表面上使用幂定律的单个分子的随机游走而引起的表面增强拉曼散射的分析。

Abstract

从一个单一的分子在银 nanoaggregate 结, 闪烁的表面增强拉曼散射 (SERS) 观察。本文介绍了如何制备 SERS 活性银 nanoaggregate, 在显微图像中记录某些闪烁点的视频, 并分析闪烁的统计数据。在这个分析中, 幂律再现了明亮事件相对于其持续时间的概率分布。黑暗事件的概率分布由幂律和指数函数拟合。幂定律的参数代表了光明和黑暗状态的分子行为。随机游走模型和分子在整个银色表面的速度可以估计。即使使用平均值、自相关函数和超分辨率 SERS 成像, 也难以估计。在未来, 幂律分析应与频谱成像相结合, 因为这种分析方法不能单独证实闪烁的起源。

Introduction

表面增强拉曼散射 (SERS) 是高灵敏度的拉曼光谱从一个高贵的金属表面。由于拉曼光谱提供了基于尖峰位置的分子结构的详细信息, 通过分子中官能团的振动模式, 可以研究金属表面上的单个分子的信息使用 SERS1,2,3。从银 nanoaggregate 与吸附在分子水平, 一个闪烁的信号被 观察1,2,3,45,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16, 频谱波动1,2,3,4,5,67,8, 9,10,11,12,13,14。眨眼可以由一个单一的分子, 随机进出一个增强电磁 (EM) 领域在一个纳米银 nanoaggregate 交界处。因此, 闪烁被认为是分子检测的简单证据, 与使用 SERS 强度的泊松分布和双分析物2、3、17的技术相比。然而, 闪烁和波动频谱的详细机制, 可能强烈依赖于分子行为在 Ag 表面, 仍然是有争议的。

在先前的研究中, 用自相关函数分析了闪烁的 SERS, 它可以计算在增强的 EM 场中进出的分子的扩散系数和浓度12,13,14.此外, 一个标准化的标准偏差评分, 代表了不稳定性的总强度, 是从信号的时间剖面的15。然而, 这些分析方法可能是基于一些分子的行为。相比之下, 在一个超分辨率成像的闪烁 SERS, 分子行为在增强 EM 领域可以识别16。但是, 这些技术只能在增强的 EM 域中获得这些参数。单个分子在广泛范围内的随机行为 (例如, 在闪烁的 SERS 中) 可以表示为幂定律, 而不是平均4,5,6,7,8 ,9,10,11, 类似于单个半导体量子点 (数字)18,19中闪烁的荧光。通过使用幂律分析4、5、6、7、8、91011, 分子行为可以估计在明亮状态 (在增强的 EM 领域) 和黑暗状态10;那是, 分子的行为在整个银色表面可以估计。

对于此技术, 银胶体粒子使用4,5,6,,8,9,10,11。这些粒子显示各种局部的表面等离子共振 (LSPR) 波段, 强烈影响增强的电磁场时, 他们是在一定的波长兴奋。因此, SERS 活性银纳米粒子存在于胶体悬浮液中, 并能立即获得一些数据。在简单的纳米结构的情况下, 有特定的大小, 形状和安排, LSPR 依赖的 SERS 闪烁可以隐藏其他依赖性7;也就是说, 如果使用了 LSPR 的好的或坏的纳米结构, 则参数将是恒定的, 因此其他的依赖将被隐藏。幂律分析已被用于发现从银胶体粒子的各种依赖的闪光 SERS, 4,5,6,7,89,10,11。

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Protocol

1. 样品制备

  1. 制备银胶体纳米粒子20
    1. 制备银胶体纳米粒子, 溶解0.030 克硝酸银和0.030 克柠檬酸三钠, 在150毫升水中的200毫升圆形底烧瓶。
    2. 将烧瓶与回流 (Dimroth) 冷凝器结合。
    3. 用磁力搅拌器和搅拌棒在烧瓶中搅拌溶液。然后, 在150° c 的油浴中, 在烧瓶中加热搅拌溶液60分钟。
      注: 溶液将变成黄色, 然后是乳白色的灰色。
    4. 在室温下冷却悬浮液, 并保持在冰箱内用铝箔覆盖的烧瓶中的悬浮。
      注意: 在此点可以暂停协议。在一个月内, 用胶体纳米微粒储存在冰箱里。
  2. 多色闪烁发射样品的制备11
    1. 要准备一个显微镜幻灯片, 用手用肥皂冲洗玻璃盘子, 并用清水冲洗。
    2. 在玻璃板上加入0.1% 多聚 l-赖氨酸水溶液, 用鼓风机将溶液取出。
    3. 将银胶体悬浮液添加到玻璃板上, 然后用鼓风机将悬浮液除去。
    4. 用液体阻挡笔将玻璃板上的拖放区域括起来。
    5. 将蒸馏水滴在玻璃板上, 用另一玻璃板盖上, 以制造显微镜滑动, 防止水蒸发。
  3. 为单调的彩色闪烁 SERS 进行样品制备7,8,9,10
    1. 要准备一个显微镜幻灯片, 用手用肥皂冲洗玻璃盘子, 并用清水冲洗。
    2. 将银胶体悬浮液与 thiacyanine 或 thiacarbocyanine 染料 (分别为25或4µM) 和氯化钠 (10 毫米) 水溶液混合, 体积比为 2:1: 1。
    3. 将样品悬浮液放在玻璃板上, 然后用鼓风机将悬挂装置卸下。
    4. 用液体阻挡笔将玻璃板上的拖放区域括起来。
    5. 将氯化钠 (1 米) 的水溶液滴在玻璃板上, 使银纳米颗粒固定, 并用另一玻璃板盖住, 以制造显微镜滑动板, 防止溶液蒸发。

2. 闪光银纳米粒子的观察

  1. 样品照明
    1. 将使用协议1.2 或1.3 的样品玻璃板放在倒置显微镜的舞台上。
    2. 通过暗场冷凝器照亮样品玻璃板, 用物镜 (60X) 在玻璃板上聚焦各种彩色斑点 (蓝色、绿色、黄色和红色)。
    3. 用衰减光束照射样品玻璃板, 其相对于样品表面的角度为30°, 从二极管泵浦固态 (DPSS) continuous-wave (cw) 激光器通过干涉滤光片。
    4. 利用激光照射在同色的环境中观察银粒子为单调的彩色斑点, 将激光照射区移至视图中心, 并通过调整 z 方向上的舞台来聚焦在玻璃板上的斑点上。
  2. 闪烁的观察
    1. 在物镜后插入一个 long-pass 过滤器, 并通过干涉滤光片, 在30°相对于样品表面的情况下, 用 DPSS 的连续激光光束照射样品玻璃板。
    2. 通过在 x 和 y 方向移动舞台, 查找图 1中显示的闪烁点 (也请参见辅助材料中的图 S1 )。
    3. 用倒置显微镜记录闪烁斑点的视频, 耦合到一个冷却的数字电荷耦合器件 (CCD) 相机, 它的时间分辨率为 61-120 毫秒, 为20分钟。

3. 闪光 SERS 的分析

  1. 从视频中推导时间剖面
    1. 在控制 CCD 摄像机的软件中, 打开视频文件。
    2. 若要选择闪烁的斑点和暗区, 请拖动单独覆盖视频图像中有斑点的区域的区域。
    3. 若要从视频中的闪烁点和暗区域派生信号强度时间配置文件, 请在分析中选择时间分析, 然后在时间分析窗口中单击计算。
    4. 将数据另存为文本文件。
  2. 时间剖面分析
    1. 通过从暗区和/或与多项式函数的拟合中减去时间轮廓来拼合时间模板的基线, 如图 2A和2B所示。
    2. 计算由大约2000点、 I基和基线强度标准偏差 (σ) 组成的平均基线强度, 如图 2C和2D中所示。
    3. 使用比I基+ 3 的阈值更大的强度来区分明亮事件和暗事件, 并记录每个事件的持续时间。例如, 在图 3中, 将事件从0记录为黑色事件 (其持续时间为t = 3.5476 秒), 并将事件从3.5476 个到4.0981 秒记录为明亮事件 (持续时间为t = 0.5505 秒)。重复过程, 如表 1所示。
    4. 按照表 2的第一和第二行中的表示, 计算每个持续时间内的亮和暗事件数。
    5. 对每个工期的事件数求和, 但事件少于持续时间t。例如, 在表 2的第二和第三行中表示, 对每个持续时间的事件数进行求和 ( t = 0.0612 秒的事件除外) 为 41 + 18 + 9 +..。结果等于t = 0.1223 s 的求和,即103。
    6. 按每个工期划分总结, 并对其进行规范化。例如, 如表 2所示, 将持续时间的总和t = 0.0612 s 除以持续时间0.0612 秒。结果是3351.5791。然后, 将结果除以表 2中第四行中的结果总数。概率分布被导出为0.64494。
    7. 将明亮事件的概率分布绘制为Pon(t), 并将其持续时间t在对数对数图中, 并适合日志10P(t) 的日志10()Equation 1在上为特定的闪烁点推断幂定律指数α。Equation 1如果Pon(t) 是由安装的, 则拟合的行将在P(t)上的小数值上偏离图形, 如图 4A中的虚线所示。
    8. 按日志10将暗事件的概率分布绘制为P关(t), 并将其持续时间t在对数对数图中, 并适合日志10P关闭(t)。从相同的闪烁点推断出幂律指数α Equation 3 off和截断时间τ 。如果Poff(t) 是由安装的, 则拟合的曲线将从位于Equation 3 P关闭(t) 的小值中偏离图形。
    9. 对视频中的其他闪烁点重复3.2.1 到3.2.8。

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Representative Results

从1.2 号协议制备的多聚 l-赖氨酸银粒子, 观察到了 SERS 和表面增强荧光的多色闪烁斑点, 如图 111所示。相比之下, 由 1.37、8、9、10所制备的染料分子, 在银粒子上观察到来自 SERS 的单调彩色闪烁点。有两种类型的 "阴性" 结果: 连续的结果, 或结果, 没有 SERS 的观察。前者和后者的结果可能是由高或低浓度的分子在胶体银表面, 分别。

来自单个银 nanoaggregate 的信号在不同的时间显示各种强度, 如图 2B所示。这是不同的闪烁荧光的一个单一的量子。荧光强度的直方图显示两个不同的峰值, 它们代表光明和黑暗状态18。在较长范围内的时间分布类似于在短范围内的扩展, 如图 34。这被称为 "自相似" 或 "分形";也就是说, 如果扩展了对象的长度尺度, 它们的特征就会被认为是相似的。

在对数对数图中, 明亮和暗事件的概率分布分别以直线和曲线的形式绘制, 如图 4所示 (相对于单个量子数的闪烁)19。在图中, 直线的斜率对应幂律指数。相反, 较短的截断时间是从一个事实, 即黑暗状态的幂律被截断在较短的尾巴。对于暗 SERS 事件, 概率分布有时是由幂律而不是指数函数拟合的。即, 很长的截断时间有很大的错误, 有时会导出9,10。然而, 具有指数函数的幂律不能重现暗 SERS 事件的概率分布, 这并不是一个 "负" 结果。

幂定律指数α开/关和截断时间τ从单个银纳米粒子推断出不同的值, 如 图 5所示。从多个幂律指数中, 推导出一个标准误差的平均值, 并与不同条件下的其他值进行比较。在截断时间的情况下, 中位数而不是平均值可能适合比较。幸运的是, 大量的数据可以从几个闪烁的视频中收集到, 因为在视频中可以同时观察到十几个闪烁的斑点。

Figure 1
图 1:有代表性的闪烁的 SERS 图像.多色闪烁斑点从银粒子观察与聚 l-赖氨酸。缩放条 = 10 µm。这是采取倒置显微镜耦合到彩色 CCD 相机通过一个长的通行证过滤器 (见相应的视频电影在图 S1的补充材料)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: (A) 来自闪烁点的信号强度的代表时间波形.(B) 通过多项式函数从暗区和/或管接头中减去时间剖面, 使基线已被拼合的时间配置文件。转载的许可, 从皇家化学学会8。(C) 放大 (B) 中的正方形, 即时间模板的基线。(D) 基线点强度的示意图密度。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3:来自闪烁点的信号强度的代表时间轮廓和明暗事件定义的阈值 (水平线)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4:针对其工期绘制的闪烁点的代表性概率分布。(a) 在对数对数图中针对其工期绘制的亮事件的概率分布。Equation 1实线 Equation 1和虚线是使用公式进行拟合的结果, 它们分别为日志10pon(t) = 日志10() 和p(t) =。(B) 在对数对数图中针对其工期绘制的暗事件的概率分布。它们可以被拟合为幂律具有指数函数的曲线。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5:来自幂律的参数的代表性直方图。(A) 幂定律指数对亮事件的直方图。(B) 暗事件幂律指数的直方图。(C) 幂律中截断时间的直方图, 用于暗事件的指数函数。请单击此处查看此图的较大版本.

Supplemental Figure 1
图 S1: 具有代表性的闪烁 SERS 的电影.多色闪烁斑点从银粒子观察与聚 l-赖氨酸。这包括一个面积50µm x 40 µm, 并采取了倒置显微镜耦合到彩色 CCD 相机通过一个长传球过滤器。请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.

Supplemental Figure 2
图 S2: 具有代表性的扫描电子显微镜图像的银 nanoaggregate 形成的多聚 l-赖氨酸或氯化钠.请单击此处查看此图的较大版本.

Supplemental Figure 3
图 S3: thiacarbocyanine 粉末的常规拉曼光谱, 以及具有代表性的具有 thiacarbocyanine 的单银 nanoaggregate 的时间波动的 SERS 谱.转载的许可, 从皇家化学学会8。请单击此处查看此图的较大版本.

事件 开始时间/秒 结束时间/秒 持续时间/秒
黑暗 0.0000 3.5476 3.5476
明亮 3.5476 4.0981 0.5505
黑暗 4.0981 5.8720 1.7738
明亮 5.8720 5.9331 0.0612
黑暗 5.9331 6.3613 0.4282
明亮 6.3613 6.4836 0.1223
黑暗 6.4836 6.6671 0.1835
明亮 6.6671 6.7895 0.1223
黑暗 6.7895 7.0341 0.2447
明亮 7.0341 7.0953 0.0612
黑暗 7.0953 8.3798 1.2845
明亮 8.3798 8.4409 0.0612
黑暗 8.4409 8.6856 0.2447
明亮 8.6856 8.7468 0.0612
黑暗 8.7468 9.6643 0.9175
明亮 9.6643 9.9089 0.2447
黑暗 9.9089 9.9701 0.0612
明亮 9.9701 10.3371 0.3670
黑暗 10.3371 10.3983 0.0612

表 1: 暗或亮事件、事件开始时间、事件结束时间和事件持续时间的代表性表.这些派生自图 3。

持续时间/秒 笑的事件 求和 (总和)/(持续时间) 概率分布/s-1
0.0612 102 205 3351.5791 0.64494
0.1223 41 103 841.9821 0.16202
0.1835 18 62 337.8828 0.06502
0.2447 9 44 179.8408 0.03461
0.3058 4 35 114.4442 0.02202
0.3670 3 31 84.4707 0.01626
0.4282 3 28 65.3967 0.01258
0.4893 4 25 51.0911 0.00983
0.5505 1 21 38.1481 0.00734
0.6117 1 20 32.6983 0.00629
0.6728 5 19 28.2395 0.00543
0.7340 2 14 19.0740 0.00367
0.9786 1 12 12.2619 0.00236
1.0398 1 11 10.5789 0.00204
1.1621 2 10 8.6048 0.00166
1.3456 1 8 5.9452 0.00114
1.4068 1 7 4.9758 0.00096
1.9573 1 6 3.0655 0.00059
2.0796 1 5 2.4043 0.00046
2.2631 1 4 1.7675 0.00034
2.4466 1 3 1.2262 0.00024
2.8136 1 2 0.7108 0.00014
2.9359 1 1 0.3406 0.00007

表 2: 代表性的工期表、每个工期的事件数、较长工期的事件数求和、总结除以每个工期以及它们的规范化概率分布。

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Discussion

从银 nanoaggregate 结, SERS 被发射。因此, 我们需要准备粒子而不是胶体纳米粒子, 这是被柠檬酸阴离子覆盖。银聚合体是由添加多聚 l-赖氨酸所产生的盐析效应形成的, 它具有-NH3+ , 是来自氯化钠的 SERS、Na+阳离子的来源, 如补充材料的图 S2所示。此外, 为了照亮宽区的许多斑点, 不聚焦的激光光束是通过一个不附着在显微镜上的透镜, 相对于样品表面, 以30°的角度交付的。有可能观察区域没有被照亮。我们调整和移动激光区域以高放大率照亮观察区域。经过这一优化, 单调的彩色斑点是可见的在同色的环境。这些都是用于闪烁 SERS 观察的关键步骤。

在此, 讨论了幂律分析中需要注意的问题。首先, 明暗事件定义的阈值会影响闪烁的分析。当阈值增加时, 幂律指数和截断次数也趋于增加,4,5,9。当指数 (αon和αoff) 和截断时间呈现不同的趋势时, 可以发现闪烁的 SERS 的依赖性。其次, 较小幂律指数表示在对数对数图中幂律所给出的直线的陡斜率, 表示亮或暗事件7的长持续时间的较低概率。因为明亮的事件不能持续很长的时间, 所以在图中绘制明亮事件的点数比暗事件的少。然后, αon值往往小于αoff, 值7, 不同于从单个量子点 (αoff = α在=-1.5)18的闪烁。第三, 指数只会稍微大于-110, 因为概率分布是通过以下公式给出的:

Equation 7,

其分子在中期 (派生自协议 3.2.5; 请参见表 2的第三行) 倾向于减少 t 的较长的持续时间,因为即使更长的持续时间的光明和黑暗事件的数量往往会因以下事实而减少分子随机移动, 几乎不能停留在一个发射状态或放射状态 (nanoaggregate 的交界处) 很长一段时间, 在第二行表 2中表示。幂定律指数α =-1.5 或-1, 可以从分子随机行走于银表面一-或 two-dimensionally, 分别为4,5,18的事实派生。相比之下, 截断时间缩短的分子随机步行和/或更高的能量屏障从发射到放射状态4,5,19。我们注意到, 概率分布不能用幂律来再现的事件的百分比是重要的数据9,10, 因为复制失败源自很长截断时间。

在以前的研究中12,13,14, 自相关函数也用于闪烁的 SERS。自相关函数, 这是用于荧光相关光谱学, 代表扩散系数和浓度的荧光分子进出的重点领域21,22。然而, 对于闪烁的 SERS, 没有简单的函数可以重现自相关函数14。这意味着一个复杂的过程, 闪烁的 SERS, 因为自相关函数可以确定一些周期性。在另一种定量分析中, 从信号的时间波形15中导出了规范化的标准偏差分数。大比分表明, 总强度不稳定。这些分析方法可能适用于少数分子的行为, 而不是单个分子的行为。此外, 明亮事件的平均工期用于分析闪烁的 SERS4,14。这些可以揭示分子在增强的 EM 场中的行为, 类似于 SERS16的超分辨率成像。然而, 黑暗事件的平均值不能得到;即, 由单个银粒子的暗 sers 事件的总持续时间是通过增加事件4的次数而减少的, 而明亮的 sers 事件的总工期则增加了。因此, 只有光 SERS 事件的分子行为才能被这些技术所研究。通过使用幂定律分析, 另一方面, 黑暗状态的分子行为 (即在银表面上, 除了银粒子的接合点) 可以根据幂律指数αoff和截断时间10来估计.这与以前的技术有很大的不同。

为了确认该闪烁是由 SERS 引起的, 光谱是从一个 nanoaggregate 的中心, 通过一个针孔来测量的, 如在补充材料的图 S3中所示。但是, 它不是从所有闪烁的点7、8、9、10、11中进行测量的。对于多聚 l-赖氨酸的11, 在长波区域中闪烁的原因不是 sers, 而是表面增强的荧光, 这也来源于增强的 EM 领域, 如 sers。此外, 有争议的是连接的波动频谱与闪烁。这是目前技术的一个局限。

在未来, 应根据每个峰值来分析闪烁的 SERS。即幂律分析应与频谱成像相结合。通过使用双分析物技术17, 在混合分析中观察到独特的振动特征, 分子 SERS 的起源得到了证实。然而, 由于时间的推移, 分子行为不能被显著的研究。最近, 通过每个光过滤器和幂定律分析11, 通过观察每个闪烁点, 从截断时间上检测出每个源的不同行为。

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Disclosures

作者没有什么要透露的。

Acknowledgments

作者感谢 Prof. y Ozaki (Kwansei 学院大学) 和 Dr. (国家高等工业科技研究院) 对这项工作进行了卓有成效的讨论。这项工作得到了教育、文化、体育、科学和技术部 (No. 16K05671) 的 KAKENHI (补助金) 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silver nitrate, 99.8% Wako 194-00832
Trisodium citrate dihydrate, 99. % Wako 191-01785
Poly-L-lysine aqueous solution, 0.1% Sigma-Aldrich P8920
3,3'-disulfopropylthiacyanine triethylamine Hayashibara Biochemical Laboratories NK-2703 a kind of thiacyanine dyes
3,3'-diethyl-5,5'-dichloro-9-methylthiacarbocyanine iodine salt Hayashibara Biochemical Laboratories SMP-9 a kind of thiacarobocyanine dyes
Sodium chloride, 99.5% Wako 191-01665
Dimroth condenser Iwaki 61-9722-22 perchased from AS ONE
Magnetic stirrer Corning DC-420D
Oil bath Advantech OS-220
Glass plate Matsunami S-1112 Microscope slide
Blower Hozan Z-288 Air duster
Liquid blocker pen Daido Sangyo LIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). Ready-to-use hydrophobic barrier pen designed for immunohistochemistry applications
Inverted microscope Olympus IX-70
Objective lens Olympus LCPlanFl 60× NA 0.7
Dark field condenser Olympus U-DCD NA 0.8–0.92
Cooled digital CCD camera Hamamatsu ORCA-AG controlled by software Aqua Cosmos
Software for the cooled digital CCD camera Hamamatsu AquaCosmos used for also derivation of the time-profiles from the blinking spots in the video 
Color CCD camera ELMO TNC-C920 not used for analysis
DPSS laser RGB laser system NovaPro532-75 λ = 532 nm;
60 mW (corresponds to a power density of 600 W/cm2)
Interference filter Semrock LL01-532-12.5
Long pass filter Semrock BLP01-532R-25
Software for the distinguishment and counting of the bright/dark events home-maid programmed by C++
Software for the fitting by a power law LightStone Origin6.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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化学 问题 131 闪烁 幂定律 随机游走 单分子检测 银胶体纳米粒子 表面增强拉曼散射 表面增强荧光 聚 l-赖氨酸 Thiacyanine Thiacarbocyanine 暗场显微镜,局部表面等离子体共振
闪烁表面增强拉曼散射的观测与分析
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Kitahama, Y. Observation and… More

Kitahama, Y. Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering. J. Vis. Exp. (131), e56729, doi:10.3791/56729 (2018).

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