Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Analyse der blinkende Oberfläche-enhanced Raman Streuung durch die Irrfahrt eines einzelnen Moleküls auf einer silbernen Oberfläche mittels macht Gesetze.
Abstract
Aus einem einzigen Molekül an eine silberne Nanoaggregate-Kreuzung wird blinkend Oberfläche-enhanced Raman-Streuung (SERS) beobachtet. Hier ist ein Protokoll zum Vorbereiten der SERS-Active präsentiert Silber Nanoaggregate, eine Video von bestimmten blinkenden Stellen im mikroskopischen Bild aufzeichnen und analysieren die blinkenden Statistiken. In dieser Analyse reproduziert ein Potenzgesetz Wahrscheinlichkeitsverteilungen für helle Veranstaltungen im Verhältnis zu ihrer Dauer. Die Wahrscheinlichkeitsverteilungen für dunklen Ereignisse sind durch ein Potenzgesetz mit einer Exponentialfunktion ausgestattet. Die Parameter des Kraft Gesetzes darstellen molekulare Verhalten in hellen und dunklen Staaten. Die Random-Walk-Modell und die Geschwindigkeit des Moleküls über die gesamte Silberoberfläche können geschätzt werden. Es ist schwer zu schätzen, auch bei Verwendung von Durchschnittswerten, Autokorrelation Funktionen und Höchstauflösung SERS Imaging. In Zukunft sollte Kraft Gesetz Analysen mit spectral imaging, kombiniert werden, da die Ursprünge des blinken von dieser Analysemethode allein nicht bestätigt werden können.
Introduction
Oberfläche-enhanced Raman-Streuung (SERS) ist hochsensiblen Raman-Spektroskopie von einer edlen Metall-Oberfläche. Da das Raman-Spektrum detaillierte Informationen über molekulare Struktur basierend auf den scharfen Peak-Positionen durch die Schwingungs-Modi von funktionellen Gruppen in den Molekülen liefert kann die Informationen eines einzelnen Moleküls auf einer Metalloberfläche untersucht werden Verwendung von SERS1,2,3. Aus einem silbernen Nanoaggregate mit einem adsorptiv Einzelmolekül-Ebene wird ein Blinksignal1,2,3,4,5,6, beobachtet. 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16und das Spektrum schwankt1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13,14. Blinken kann durch ein einzelnes Molekül induziert werden, die nach dem Zufallsprinzip innerhalb und außerhalb eine verbesserte elektromagnetischen (EM) Feld an einer Kreuzung nanometergroßen Silber Nanoaggregate bewegt. Daher gilt das Blinken einfache Beweise für die Einzelmolekül-Erkennung, verglichen mit einer Technik, die mit einer Poisson-Verteilung von SERS Intensität und eine Bi-Analyt2,3,17. Die detaillierten Mechanismen des blinkenden und schwankenden Spektrums, das molekulare Verhalten auf der Ag-Oberfläche stark abhängen kann, sind jedoch nach wie vor umstritten.
In früheren Studien wurde blinken SERS analysiert mithilfe der Autokorrelationsfunktion, die die Diffusionskoeffizienten und Konzentration der Moleküle, die eine verbesserte EM Feld12,13,14 zunehmenden berechnen können . Darüber hinaus hat der zeitliche Verlauf der Signal-15eine normalisierte Standardabweichung Punktzahl, die Instabilität in die Gesamtintensität darstellt, abgeleitet. Jedoch können diese analytische Ansätze auf das Verhalten von wenigen Molekülen beruhen. Im Gegensatz dazu kann in eine super-Resolution Imaging blinkender SERS, Einzelmolekül-Verhalten in einem erweiterten EM-Feld identifizierten16sein. Allerdings können diese Techniken solche Parameter nur in einer erweiterten EM-Feld erhalten. Das zufällige Verhalten eines einzelnen Moleküls in einem weiten Bereich (z. B. in SERS blinkt) kann als ein Potenzgesetz, anstatt eine durchschnittliche4,5,6,7,8 dargestellt werden ,9,10,11, ähnlich wie blinkende Fluoreszenz aus einem einzigen Halbleiter Quantum Dot (QD)18,19. Durch den Einsatz einer Kraft Gesetz Analyse4,5,6,7,8,9,10,11, molekulare Verhalten kann im hellen Zustand (in der erweiterten EM-Feld) und dunklen Zustand10geschätzt werden; Das heißt, kann das Verhalten des Moleküls Silber vollflächig geschätzt werden.
Für diese Technik sind Silber kolloidales Nanoaggregates verwendeten4,5,6,7,8,9,10,11. Diese Nanoaggregates zeigen verschiedene lokalisierte Oberflächen Plasmon-Resonanz (LSPR)-Bands, die stark verbesserte elektromagnetische Felder beeinflussen, wenn sie aufgeregt bei bestimmten Wellenlängen sind. So erhalten Sie sofort SERS-Active Silber Nanopartikel in kolloidalen Suspension und einige Daten vorhanden sind. Bei einfachen Nanostrukturen, die bestimmte Größen, Formen und Arrangements haben, kann die LSPR Abhängigkeit des SERS blinken andere Abhängigkeiten7verbergen; nämlich, wenn das gut oder schlecht Nanostruktur, LSPR verwendet wird, werden die Parameter konstant, und die anderen Abhängigkeiten werden daher ausgeblendet werden. Kraft Gesetzes Analyse wurde verwendet, um verschiedene Abhängigkeiten von der blinkenden SERS aus Silber kolloidales Nanoaggregates4,5,6,7,8, zu entdecken 9 , 10 , 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. die Probenvorbereitung
-
Vorbereitung von kolloidalem Silber-Nanopartikeln 20
- Um kolloidales Silber-Nanopartikeln zu fabrizieren, lösen Sie 0,030 g Silbernitrat und 0,030 g Trinatrium Citrat Dihydrat in 150 mL Wasser in einen 200-mL Rundboden-Kolben.
- Kombinieren Sie die Flasche mit einem Reflux (Dimroth) Kondensator.
- Rühren Sie die Lösung in die Flasche mit einem magnetischen Rührer und rühren. Dann Hitze rühren Lösung in die Küvette in einem Ölbad bei 150 ° C für 60 min.
Hinweis: Die Lösung leuchtet gelb, dann milchig grau. - Kühlen Sie die Federung bei Raumtemperatur ab, und halten Sie die Aufhängung in die Küvette mit Alu-Folie im Kühlschrank abgedeckt.
Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten werden. Verwenden Sie die kolloidale Nanopartikel nach Lagerung im Kühlschrank, innerhalb eines Monats.
-
Vorbereitung der Probe für mehrfarbige blinkende emission 11
- Um einen Objektträger bereit, eine Glasplatte mit Seife per hand waschen und mit Wasser abspülen.
- Die Glasplatte 0,1 % Poly-L-Lysin wässriger Lösung hinzu, und entfernen Sie die Lösung mit einem Gebläse.
- Die Glasplatte Silber kolloidalen Suspension hinzu, und entfernen Sie die Aufhängung mit einem Gebläse.
- Fügen Sie einen Dropdown-Bereich auf der Glasplatte mit einem flüssigen Blocker Stift.
- Tropfen Sie destilliertes Wasser auf der Glasplatte, und bedecken Sie es mit einem anderen Glasplatte auf einen Objektträger zu schaffen und verhindern, dass Wasser verdunstet.
-
Vorbereitung der Probe für monotone farbigen blinkenden SERS 7 , 8 , 9 , 10
- Um einen Objektträger bereit, eine Glasplatte mit Seife per hand waschen und mit Wasser abspülen.
- Mischen Sie silberne kolloidale Suspension mit Thiacyanine oder Thiacarbocyanine Farbstoff (25 oder 4 µM, beziehungsweise) und eine wässrige Lösung von NaCl (10 mM) in einem Volumenverhältnis von 2:1:1.
- Fallen Sie die Probe-Suspension auf der Glasplatte, und entfernen Sie die Aufhängung mit einem Gebläse.
- Fügen Sie einen Dropdown-Bereich auf der Glasplatte mit einem flüssigen Blocker Stift.
- Legen Sie eine wässrige Lösung von NaCl (1 M) auf der Glasplatte, die Silber-Nanopartikel zu immobilisieren, und bedecken Sie es mit einem anderen Glasplatte zum Erstellen einer Mikroskop-Gleitplatte und verhindern, dass die Lösung verdunstet.
2. Beobachtung von Silber-Nanopartikeln zu blinken
-
Beleuchtung der Probe
- Legen Sie die Probe Glasplatte mit Protokoll 1,2 oder 1,3 auf der Bühne von einem inversen Mikroskop zubereitet.
- Beleuchten Sie die Probe Glasplatte mit weißem Licht durch ein Dunkelfeld Kondensor und Fokus auf verschiedenen farbigen Flecken (blau, grün, gelb und rot) auf der Glasplatte mit einem Objektiv (60 X).
- Beleuchten Sie die Probe Glasplatte mit eine abgeschwächte Strahl, geliefert in einem Winkel von 30° im Verhältnis zu der Oberfläche der Probe aus einem Diodenlaser gepumpten Festkörperlaser (DPSS) Dauerstrich-(cw) durch ein Interferenzfilter.
- Laser-Beleuchtung verwenden, um die silberne Nanoaggregates als eintönig farbige Flecken in einer gleichfarbigen Umgebung zu beobachten, verschieben Sie der Laserbereich Beleuchtung in den Mittelpunkt der Ansicht, und konzentrieren Sie sich auf die Flecken auf der Glasplatte durch Anpassen der Bühne in Z-Richtung.
-
Beobachtung von blinken
- Fügen Sie einen lang-Pass-Filter nach der Objektivlinse und beleuchten Sie die Probe Glasplatte mit einem DPSS cw-Laserstrahl in einem Winkel von 30° gegenüber der Probenoberfläche durch ein Interferenzfilter geliefert.
- Finden Sie das Blinken Flecken, wie in Abbildung 1 dargestellt (siehe auch Abbildung S1 in das ergänzende Material) von der Bühne in x- und y-Richtung verschieben.
- Videoaufnahme der blinkenden Spots mit der inversen Mikroskop, gekoppelt mit einer gekühlten kostenlos – Coupled Digitalgerät (CCD) Kamera, die eine zeitlichen Auflösung von 61-120 ms hat, für 20 Minuten.
3. Analyse der SERS blinkt
-
Ableitung der zeitliche Verlauf von video
- In der Software steuert, dass die CCD-Kamera, die video-Datei zu öffnen.
- Wenn die blinkende Flecken und dunklen Bereich auswählen möchten, ziehen Sie Bereiche, die separat Regionen mit und ohne Flecken im Videobild zu decken.
- Um die blinkende Flecken und dunkle Bereiche im Video Signal Intensität Zeitprofile abgeleitet, wählen Sie Zeitliche Analyse Analyse, und klicken Sie auf berechnen im Fenster Zeitliche Analyse .
- Speichern Sie die Daten als Textdatei.
-
Analyse der das Zeitprofil
- Glätten Sie einen Überblick über den zeitlichen Verlauf durch Subtraktion der zeitliche Verlauf von den dunklen Bereich und/oder Armatur mit eine Polynomfunktion, wie in den Abbildungen 2A und 2 bdargestellt.
- Bewerten Sie eine gemittelte Baseline-Intensität, die besteht aus ca. 2000 Punkte ichbaseund einer Standardabweichung von Baseline Intensitäten, σ, wie in den Figuren 2 und 2Ddargestellt.
- Dunklen Ereignissen mit größerer Intensität als ein Schwellenwert von ichbase + 3σ unterscheiden Sie hellen Ereignisse, und notieren Sie die Dauer der jeweiligen Veranstaltung. In Abbildung 3, z. B. Aufzeichnen der Veranstaltung von 0 bis 3.5476 s als das dunkle Ereignis (mit einer Laufzeit von t = 3.5476 s), und notieren Sie das Event vom 3.5476 bis 4.0981 s als helles Ereignis (mit einer Laufzeit von t = 0.5505 s). Wiederholen Sie Vorgang, wie in Tabelle 1dargestellt.
- Die Anzahl der hellen und dunklen Ereignisse für jede Dauer ausgedrückt in die erste und zweite Zeile der Tabelle 2.
- Addieren Sie die Anzahl der Ereignisse für jede Dauer, außer bei Veranstaltungen kürzer als Dauer t. Ausgedrückt in den zweiten und dritten Zeilen der Tabelle 2Summe zum Beispiel die Anzahl der Ereignisse für jede Dauer (außer bei Veranstaltungen für t = 0.0612 s) als 41 + 18 + 9 +...; Das Ergebnis ist gleich die Summe für t = 0.1223 s, d. h. 103.
- Unterteilen Sie die Summierungen von jeder Dauer und normalisieren sie. Wie in Tabelle 2angegeben, z. B. Teilen Sie die Summe für die Dauer t = 0.0612 s durch die Dauer 0.0612 s. Das Ergebnis ist 3,351.5791. Teilen Sie das Ergebnis dann durch die Summe der Ergebnisse in die vierte Zeile in Tabelle 2. Die Wahrscheinlichkeitsverteilung wird abgeleitet, um 0.64494 zu sein.
- Die Wahrscheinlichkeitsverteilungen für die hellen Ereignisse Pauf(t) gegen ihre Dauer t in einem Logarithmus-Logarithmus Graphen Plotten, und Log10Ppassenauf(t) durch Log10 (
), die Kraft Gesetz Exponent αauf für eine bestimmte Stelle blinkt abzuleiten. Wenn Pauf(t), durch ausgestattet ist , der Anpassungslinie weicht von den Parzellen bei kleinen Werten von Pauf(t), wie gezeigt durch die gestrichelte Linie in Abbildung 4A. - Die Wahrscheinlichkeitsverteilungen für dunklen Ereignisse Paus(t) gegen ihre Dauer t in einem Logarithmus-Logarithmus Graphen Plotten, und Log10Paus(t) von Log10(passen
, die Kraft Gesetzes Exponent αaus und die Trunkierung Zeit τ aus der gleichen blinken vor Ort abzuleiten. Wenn Paus(t), durch ausgestattet ist , die angepasste Kurve weicht von den Parzellen bei kleinen Werten von Paus(t). - Wiederholen Sie 3.2.1 zu 3.2.8 für die anderen blinkende Punkte im Video.
, die Kraft Gesetzes Exponent αaus und die Trunkierung Zeit τ aus der gleichen blinken vor Ort abzuleiten. Wenn Paus(t), durch ausgestattet ist Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aus der silbernen Nanoaggregates mit Poly-L-Lysin ausgearbeiteten Protokoll 1.2 sind mehrfarbige blinkende Spots von SERS und Oberfläche verbessert Fluoreszenz beobachtet, wie in Abbildung 111gezeigt. Im Gegensatz dazu wurden eintönige farbige blinkende Flecken von SERS mit der Farbstoffmoleküle ausgearbeiteten Protokoll 1.37,8,9,10Silber Nanoaggregates beobachtet. Es gibt zwei Arten von "negativen" Ergebnisse: kontinuierliche Ergebnisse, oder wo keine SERS beobachtet. Die ehemalige und Letztere Ergebnisse können durch hohe oder niedrige Konzentrationen von Molekülen auf der kolloidalen Silber Oberfläche bzw. verursacht werden.
Die Signale aus einem einzigen Silber Nanoaggregate zeigen verschiedene Intensitäten zu verschiedenen Zeiten, wie in Abbildung 2Bdargestellt. Dies unterscheidet sich von den blinkenden Fluoreszenz von einem einzigen QD. Histogramme für die Fluoreszenzintensität zeigen zwei verschiedene Spitzen, die hellen und dunklen Staaten18darstellen. Das Zeitprofil über eine große Reichweite ist ähnlich wie seine Expansion in eine kurze Reichweite, wie in Abbildung 34. Dies bezeichnet man als "Selbstähnlichkeit" oder "Fraktal"; Objekte Funktionen gelten nämlich ähnlich, wenn ihre Längenskalen erweitert werden.
In einem Logarithmus-Logarithmus-Diagramm die Wahrscheinlichkeitsverteilungen für helle und dunkle Veranstaltungen gegen deren Dauer als eine Linie und Kurve, beziehungsweise, wie in Abbildung 4 (im Gegensatz zu blinken aus einem einzigen QD)19dargestellt. In der Grafik entspricht der Steigung der geraden der Kraft Gesetz Exponent. Im Gegensatz dazu ist die kürzere Zeit abschneiden aus der Tatsache abgeleitet, dass das Gesetz für den dunklen Zustand bei kürzeren Schwänzen abgeschnitten ist. Für die dunklen SERS-Veranstaltung sind die Wahrscheinlichkeitsverteilungen gelegentlich durch ein Potenzgesetz anstatt durch eine Exponentialfunktion ausgestattet. Das heißt, sind sehr lange abschneiden Zeiten mit großen Fehlern manchmal abgeleiteten9,10. Es ist jedoch keine "negative" Ergebnis, dass ein Potenzgesetz mit einer Exponentialfunktion Wahrscheinlichkeitsverteilungen für eine dunkle SERS Veranstaltung nicht reproduzieren kann.
Die Kraft Gesetz Exponenten αein-/ausschalten und Trunkierung Zeiten τ abgeleitet aus einzelnen Silber-Nanopartikeln zeigen verschiedene Werte, wie in Abbildung 5dargestellt. Von den vielen Kraft Gesetz Exponenten ist durchschnittlich mit einem Standardfehler abgeleitet und im Vergleich zu anderen Werten unter verschiedenen Bedingungen. Bei abschneiden Mal kann der Median als Durchschnitt für Vergleich geeignet sein. Glücklicherweise kann eine Fülle von Daten aus mehreren Videos von blinken, gesammelt werden, weil etwa ein Dutzend blinkende Punkte in dem Video gleichzeitig beobachtet werden können.
Abbildung 1: repräsentative Bilder von der blinkenden SERS. Mehrfarbige blinkende Punkte sind aus Silber Nanoaggregates mit Poly-L-Lysin beobachtet. Maßstabsleiste = 10 µm. Dies erfolgt mit einem inversen Mikroskop gekoppelt an ein Farb CCD-Kamera durch einen langen Pass Filtern (siehe die entsprechenden Videofilm in Abbildung S1 des zusätzlichen Materials). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: (A) repräsentative zeitliche Verlauf der Signalintensität aus blinken vor Ort. (B) das Zeitprofil dessen Grundlinie durch Subtraktion der zeitliche Verlauf aus dem dunklen Bereich und/oder Montage über eine Polynomfunktion abgeflacht hat. Reproduziert mit freundlicher Genehmigung von der Royal Society of Chemistry-8. (C) Erweiterung der Platz in (B), nämlich der Grundlinie der zeitliche Verlauf. (D) schematische Dichte der Intensitäten der Grundlinie Punkte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: repräsentative zeitliche Verlauf der Signalintensität aus dem blinken vor Ort und der Schwellenwert für die Definition von hellen und dunklen Ereignisse (horizontale Linie). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: repräsentative Wahrscheinlichkeitsverteilungen für blinkende Punkte aufgetragen gegen deren Dauer. (A) Wahrscheinlichkeitsverteilungen für helle Veranstaltungen gegen deren Dauer in einem Logarithmus-Logarithmus-Graphen geplottet. Solide und gestrichelte Linien sind passende Ergebnisse mit Gleichungen als Log10Pauf(t) = Log10(
) und Pauf(t) = , beziehungsweise. (B) Wahrscheinlichkeitsverteilungen für dunklen Ereignissen aufgetragen gegen deren Dauer in einem Logarithmus-Logarithmus-Diagramm. Sie können eine Kurve durch ein Potenzgesetz mit einer Exponentialfunktion gegeben ausgerüstet werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: repräsentative Histogramme der Parameter aus dem Potenzgesetz. (A) Histogramm der Kraft Gesetz Exponenten für helle Veranstaltungen. (B) Histogramm der Kraft Gesetz Exponenten für dunklen Ereignisse. ()C) Histogramm der Trunkierung Zeiten in Kraft Gesetz mit einer Exponentialfunktion für die dunklen Ereignisse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung S1: repräsentative Film blinkender SERS. Mehrfarbige blinkende Punkte sind aus Silber Nanoaggregates mit Poly-L-Lysin beobachtet. Dies umfasst eine Fläche von 50 µm × 40 µm und wurde mit einem inversen Mikroskop gekoppelt an eine Farb-CCD-Kamera durch einen langen Pass Filter aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Abbildung S2: repräsentative Rasterelektronenmikroskop Bild der silbernen Nanoaggregate gebildet durch Zugabe von Poly-L-Lysin oder NaCl. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung S3: konventionelle Raman-Spektrum für Thiacarbocyanine Pulver und repräsentative zeitliche schwankte SERS Spektren aus einem einzigen Silber Nanoaggregate mit Thiacarbocyanine. Reproduziert mit freundlicher Genehmigung von der Royal Society of Chemistry-8. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Event | Start Time/s | Ende Zeit/s | Dauer/s |
| dunkel | 0.0000 | 3.5476 | 3.5476 |
| hell | 3.5476 | 4.0981 | 0.5505 |
| dunkel | 4.0981 | 5.8720 | 1.7738 |
| hell | 5.8720 | 5.9331 | 0.0612 |
| dunkel | 5.9331 | 6.3613 | 0.4282 |
| hell | 6.3613 | 6.4836 | 0.1223 |
| dunkel | 6.4836 | 6.6671 | 0.1835 |
| hell | 6.6671 | 6.7895 | 0.1223 |
| dunkel | 6.7895 | 7.0341 | 0.2447 |
| hell | 7.0341 | 7.0953 | 0.0612 |
| dunkel | 7.0953 | 8.3798 | 1.2845 |
| hell | 8.3798 | 8.4409 | 0.0612 |
| dunkel | 8.4409 | 8.6856 | 0.2447 |
| hell | 8.6856 | 8.7468 | 0.0612 |
| dunkel | 8.7468 | 9.6643 | 0.9175 |
| hell | 9.6643 | 9.9089 | 0.2447 |
| dunkel | 9.9089 | 9.9701 | 0.0612 |
| hell | 9.9701 | 10.3371 | 0.3670 |
| dunkel | 10.3371 | 10.3983 | 0.0612 |
Tabelle 1: repräsentative Tabelle dunkel oder hell-Event, Ereignisstartzeit, Event-Endzeit und Veranstaltungsdauer. Diese stammen aus Abbildung 3.
| Dauer/s | Nein. der Veranstaltung | Summierung | (Summation)/(Duration) | Wahrscheinlichkeitsverteilung/s-1 |
| 0.0612 | 102 | 205 | 3351.5791 | 0.64494 |
| 0.1223 | 41 | 103 | 841.9821 | 0.16202 |
| 0.1835 | 18 | 62 | 337.8828 | 0.06502 |
| 0.2447 | 9 | 44 | 179.8408 | 0.03461 |
| 0.3058 | 4 | 35 | 114.4442 | 0.02202 |
| 0.3670 | 3 | 31 | 84.4707 | 0.01626 |
| 0.4282 | 3 | 28 | 65.3967 | 0.01258 |
| 0.4893 | 4 | 25 | 51.0911 | 0.00983 |
| 0.5505 | 1 | 21 | 38.1481 | 0.00734 |
| 0.6117 | 1 | 20 | 32.6983 | 0.00629 |
| 0.6728 | 5 | 19 | 28.2395 | 0.00543 |
| 0.7340 | 2 | 14 | 19.0740 | 0.00367 |
| 0.9786 | 1 | 12 | 12.2619 | 0.00236 |
| 1.0398 | 1 | 11 | 10.5789 | 0.00204 |
| 1.1621 | 2 | 10 | 8.6048 | 0.00166 |
| 1.3456 | 1 | 8 | 5.9452 | 0.00114 |
| 1.4068 | 1 | 7 | 4.9758 | 0.00096 |
| 1.9573 | 1 | 6 | 3.0655 | 0.00059 |
| 2.0796 | 1 | 5 | 2.4043 | 0.00046 |
| 2.2631 | 1 | 4 | 1.7675 | 0.00034 |
| 2.4466 | 1 | 3 | 1.2262 | 0.00024 |
| 2.8136 | 1 | 2 | 0.7108 | 0,00014 |
| 2.9359 | 1 | 1 | 0.3406 | 0.00007 |
Tabelle 2: Repräsentative Tabelle von Dauer, Anzahl der Ereignisse für jede Dauer, Summe der Anzahl der Ereignisse für die längere Dauer Summierungen geteilt durch jede Dauer "und" ihre normalisierte Wahrscheinlichkeitsverteilungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Von der Kreuzung Silber Nanoaggregate wird SERS ausgegeben. Wir müssen also bereiten Sie Nanoaggregates anstatt kolloidale Nanopartikel, die mit Citrat Anionen bedeckt sind. Silber Aggregate werden durch das Einsalzen, Effekt, der durch die Zugabe von Poly-L-Lysin, die NH -3+ und ist der Ursprung der SERS, geformt oder Na+ Kationen aus NaCl, wie in Abbildung S2 des zusätzlichen Materials dargestellt. Darüber hinaus wird zur Beleuchtung der vielen Stellen in den weiten Bereich der unkonzentriert Laserstrahl in einem Winkel von 30° gegenüber der Probenoberfläche durch eine Linse geliefert, die nicht mit dem Mikroskop verbunden ist. Gibt es eine Möglichkeit, dass der Überwachungsbereich nicht beleuchtet ist. Wir stellen ein und Verschieben der Laserbereich der Überwachungsbereich mit starker Vergrößerung zu beleuchten. Nach dieser Optimierung sind eintönige farbige Flecken in der gleichfarbigen Umgebung sichtbar. Dies sind wichtige Schritte für SERS Beobachtung zu blinken.
Hier werden Fragen, die Aufmerksamkeit für die Kraft Gesetzes Analyse erfordern diskutiert. Die Schwelle für die Definition von hellen und dunklen Ereignisse beeinflusst zunächst die blinkende Analyse. Wenn die Schwelle erhöht wird, tendenziell die Kraft Gesetzes Exponenten und Trunkierung Zeiten sowie4,5,9erhöhen. Wenn die Exponenten (αauf und αab) und abschneiden Zeiten unterschiedliche Tendenzen aufweisen, kann die Abhängigkeit der blinkenden SERS entdeckt zu werden. Zweitens stellt die kleinere Kraft Gesetz Exponent der steilere Steigung der geraden gegeben durch das macht-Gesetz in der Logarithmus-Logarithmus-Grafik, repräsentieren die geringere Wahrscheinlichkeit von langer Dauer für die helle oder dunkle Ereignis7. Weil die hellen Ereignisse nicht für lange Laufzeiten weiter, werden weniger Punkte für die helle Ereignisse in der Grafik dargestellt, als sie für die dunklen Ereignisse sind. Dann ist αauf Werte sind in der Regel kleiner als der αaus, Werte7, anders als das Blinken aus einem einzigen QD (aus α = αauf = -1,5)18. Drittens werden die Exponenten nur etwas größer als-110, weil die Wahrscheinlichkeitsverteilung gegeben ist:
,
deren Zähler in der Mitte (abgeleitet von Protokoll 3.2.5; sehen Sie die dritte Zeile der Tabelle 2) neigt dazu, bei längeren Laufzeiten von t, zu verringern, weil auch die Anzahl der hellen und dunklen Ereignisse für längere Laufzeiten tendenziell dadurch verringert werden, die Moleküle bewegen sich nach dem Zufallsprinzip und können kaum bleiben in einem nicht-emissiven oder emissiven Zustand (der Kreuzung der Nanoaggregate) für eine längere Zeit, ausgedrückt in der zweiten Zeile der Tabelle 2. Die Kraft Gesetzes Exponent α = -1,5 oder 1, kann aus der Tatsache, dass das Molekül nach dem Zufallsprinzip auf die silberne Oberfläche ein- oder zweidimensional, jeweils4,5,18geht abgeleitet werden. Im Gegensatz dazu ist die Kürzung von einem schneller molekulare Random-Walk und/oder höhere energetische Barriere aus einem nicht-emissiven emissiven Zustand4,5,19verkürzt. Es wird darauf hingewiesen, dass die Prozentsätze von Ereignissen, deren Wahrscheinlichkeitsverteilung durch ein Potenzgesetz mit einer Exponentialfunktion nicht reproduziert werden können, wichtige Daten9,10, weil Reproduktion scheitern sehr lange stammt Trunkierung Zeiten.
In früheren Studien12,13,14diente die Autokorrelationsfunktion auch für blinkende SERS. Die Autokorrelationsfunktion, die für die Korrelation Fluoreszenzspektroskopie verwendet wurde, vertrat die Diffusionskoeffizienten und Konzentrationen von fluoreszierenden Molekülen zunehmenden ein Schwerpunktbereich21,22. Für blinkende SERS, jedoch kann keine einfache Funktion der Autokorrelation Funktion14reproduzieren. Dies deutet auf einen komplexen Prozess für blinkende SERS, weil eine Autokorrelationsfunktion einige Periodizität identifizieren kann. In einem anderen quantitativen Analyse wurde eine normalisierte Standardabweichung Punktzahl von ein Zeitprofil Signal15abgeleitet. Eine große Punktzahl Instabilität in Gesamtintensität angegeben. Diese Analyse-Ansätze sind für das Verhalten von wenigen Molekülen, anstatt ein einzelnes Molekül Verhalten geeignet. Darüber hinaus dienten die durchschnittliche Dauer für helle Veranstaltungen für die Analyse von blinken SERS4,14. Diese könnte das Verhalten des Moleküls in einen erweiterten EM-Feld, ähnlich wie die Super-Resolution Imaging SERS16aufdecken. Die Durchschnittswerte für dunklen Ereignisse konnte jedoch nicht abgeleitet werden; nämlich, wurden die Gesamt Dauer der dunklen SERS Ereignissen aus einzelnen Silber Nanoaggregates sank um eine Zunahme der Zahl der Veranstaltungen4, während der Gesamtdauer der hellen SERS Veranstaltungen erhöht. Daher konnten nur das molekulare Verhalten der hellen SERS Ereignisse durch diese Techniken untersucht werden. Durch den Einsatz einer Kraft Gesetz Analysis auf der anderen Seite des molekularen Verhaltens für den dunklen Zustand (d. h. auf die Silberoberfläche, mit Ausnahme von Kreuzungen von Silber Nanoaggregates) abgeschätzt werden, in Bezug auf die Kraft Gesetz Exponent αab und abschneiden10 . Dies ist ein signifikanter Unterschied von früheren Techniken.
Um zu bestätigen, dass das Blinken von SERS induziert wird, wird das Spektrum von Silber Nanoaggregate in der Mitte des einen Blick durch eine Lochblende gemessen, wie in Abbildung S3 in das ergänzende Material gezeigt. Jedoch ist es nicht von allen blinkende Punkte7,8,9,10,11gemessen. Für Poly-L-Lysin11ist in einem langwelligen Bereich blinken zugeschrieben, SERS nicht, sondern Oberfläche verbessert Fluoreszenz, die auch im erweiterten EM-Felder wie SERS stammt. Darüber hinaus ist es umstritten, die fluctuated Spektren mit dem blinkenden zu verbinden. Dies ist eine Einschränkung der heutigen Technik.
In Zukunft sollte blinken SERS in Bezug auf jede Spitze analysiert werden. Das heißt, sollte die Kraft Gesetz Analyse mit spektralen Bildgebung kombiniert werden. Durch den Einsatz einer Bi-Analyt Technik17, in denen eindeutige Schwingungs Signaturen aus gemischten Analyten beobachtet werden ist der Ursprung der Einzelmolekül-SERS bestätigt worden. Jedoch kann nicht molekulare Verhalten deutlich untersucht werden, aufgrund der zeitlichen Auflösung. Vor kurzem wurde das unterschiedliche Verhalten von jeder Herkunft im Hinblick auf die Trunkierung Zeiten, durch die Beobachtung aller die blinkenden Punkte durch jede optische Filter und Kraft Gesetz Analyse11erkannt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der Autor hat nichts preisgeben.
Acknowledgments
Der Autor dankt Prof. Y. Ozaki (Kwansei Gakuin University) und Dr. T. Itoh (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) für ihre fruchtbare Diskussionen dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (Nr. 16 K 05671) von KAKENHI (Beihilfe für wissenschaftliche Forschung C) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver nitrate, 99.8% | Wako | 194-00832 | |
| Trisodium citrate dihydrate, 99. % | Wako | 191-01785 | |
| Poly-L-lysine aqueous solution, 0.1% | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3,3'-disulfopropylthiacyanine triethylamine | Hayashibara Biochemical Laboratories | NK-2703 | a kind of thiacyanine dyes |
| 3,3'-diethyl-5,5'-dichloro-9-methylthiacarbocyanine iodine salt | Hayashibara Biochemical Laboratories | SMP-9 | a kind of thiacarobocyanine dyes |
| Sodium chloride, 99.5% | Wako | 191-01665 | |
| Dimroth condenser | Iwaki | 61-9722-22 | perchased from AS ONE |
| Magnetic stirrer | Corning | DC-420D | |
| Oil bath | Advantech | OS-220 | |
| Glass plate | Matsunami | S-1112 | Microscope slide |
| Blower | Hozan | Z-288 | Air duster |
| Liquid blocker pen | Daido Sangyo | LIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). Ready-to-use hydrophobic barrier pen designed for immunohistochemistry applications | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Objective lens | Olympus | LCPlanFl 60× | NA 0.7 |
| Dark field condenser | Olympus | U-DCD | NA 0.8–0.92 |
| Cooled digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-AG | controlled by software Aqua Cosmos |
| Software for the cooled digital CCD camera | Hamamatsu | AquaCosmos | used for also derivation of the time-profiles from the blinking spots in the video |
| Color CCD camera | ELMO | TNC-C920 | not used for analysis |
| DPSS laser | RGB laser system | NovaPro532-75 | λ = 532 nm; 60 mW (corresponds to a power density of 600 W/cm2) |
| Interference filter | Semrock | LL01-532-12.5 | |
| Long pass filter | Semrock | BLP01-532R-25 | |
| Software for the distinguishment and counting of the bright/dark events | home-maid | programmed by C++ | |
| Software for the fitting by a power law | LightStone | Origin6.1 |
References
- Qian, X. M., Nie, S. M. Single-molecule and single-nanoparticle SERS: from fundamental mechanisms to biomedical applications. Chem. Soc. Rev. 37, 912-920 (2008).
- Pieczonka, N. P. W., Aroca, R. F. Single molecule analysis by surfaced-enhanced Raman scattering. Chem. Soc. Rev. 37, 946-954 (2008).
- Kneipp, J., Kneipp, H., Kneipp, K. SERS -a single-molecule and nanoscale tool for bioanalytics. Chem. Soc. Rev. 37, 1052-1060 (2008).
- Kitahama, Y., Ozaki, Y. Analysis of blinking SERS by a power law with an exponential function. Frontiers of Surface-Enhanced Raman Scattering: Single-Nanoparticles and Single Cells. , Wiley. Chichester. Chapter 6 (2014).
- Kitahama, Y. Truncated Power Law Analysis of Blinking SERS. Frontiers of Plasmon Enhanced Spectroscopy Volume 1 (ACS Symposium series Vol. 1245). , American Chemical Society. Washington DC. Chapter 4 (2016).
- Bizzarri, A. R., Cannistraro, S. Lévy Statistics of Vibrational Mode Fluctuations of Single Molecules from Surface-Enhanced Raman Scattering. Phys. Rev. Lett. 94, 068303 (2005).
- Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Power-law analysis of surface-plasmon-enhanced electromagnetic field dependence of blinking SERS of thiacyanine or thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates. Phys. Chem. Chem. Phys. 13, 7439-7448 (2011).
- Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Analysis of excitation laser intensity dependence of blinking SERRS of thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates by using a power law with an exponential function. Chem. Commun. 47, 3888-3890 (2011).
- Kitahama, Y., Enogaki, A., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Truncated power law analysis of blinking SERS of thiacyanine molecules adsorbed on single silver nanoaggregates by excitation at various wavelengths. J. Phys. Chem. C. 117, 9397-9403 (2013).
- Kitahama, Y., Araki, D., Yamamoto, Y. S., Itoh, T., Ozaki, Y. Different behaviour of molecules in dark SERS state on colloidal Ag nanoparticles estimated by truncated power law analysis of blinking SERS. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 21204-21210 (2015).
- Kitahama, Y., Nagahiro, T., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Analysis of blinking from multicoloured SERS-active Ag colloidal nanoaggregates with poly-L-lysine via truncated power law. J. Raman. Spectrosc. 48, 570-577 (2017).
- Habuchi, S., et al. Single-Molecule Surface Enhanced Resonance Raman Spectroscopy of the Enhanced Green Fluorescent Protein. J. Am. Chem. Soc. 125, 8446-8447 (2003).
- Weiss, A., Haran, G. Time-Dependent Single-Molecule Raman Scattering as a Probe of Surface Dynamics. J. Phys. Chem. B. 105, 12348-12354 (2001).
- Emory, S. R., Jensen, R. A., Wenda, T., Han, M., Nie, S. Re-examining the origins of spectral blinking in single-molecule and single-nanoparticle SERS. Faraday Discuss. 132, 249-259 (2006).
- Itoh, T., Iga, M., Tamaru, H., Yoshida, K., Biju, V., Ishikawa, M. Quantitative evaluation of blinking in surface enhanced resonance Raman scattering and fluorescence by electromagnetic mechanism. J. Chem. Phys. 136, 024703 (2012).
- Willets, K. A. Super-resolution imaging of SERS hot spots. Chem. Soc. Rev. 43, 3854-3864 (2014).
- Dieringer, J. A., Lettan, R. B., Scheidt, K. A., Van Duyne, R. P. A Frequency Domain Existence Proof of Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 129, 16249-16256 (2007).
- Cichos, F., von Borczyskowski, C., Orrit, M. Power-law intermittency of single emitters. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 12, 272-284 (2007).
- Tang, J., Marcus, R. A. Mechanisms of fluorescence blinking in semiconductor nanocrystal quantum dots. J. Chem. Phys. 123, 054704 (2005).
- Lee, P. C., Meisel, D. Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols. J. Phys. Chem. 86, 3391-3395 (1982).
- Krichevsky, O., Bonnet, G. Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications. Rep. Prog. Phys. 65, 251-297 (2002).
- Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and Chemical Applications of Fluorescence Correlation Spectroscopy: A Review. Biochemistry. 41, 697-705 (2002).
