Chemistry

התבוננות וניתוח של מהבהב פיזור ראמאן השטח משופרת

Published: January 11, 2018 doi: 10.3791/56729

¹Department of Chemistry, Kwansei Gakuin University

Summary

פרוטוקול זה מתאר הניתוח של מהבהב ראמאן משופרת השטח פיזור עקב ההליכה אקראי של מולקולה בודדת על משטח כסף באמצעות חוקים כוח.

Abstract

ממולקולה בודדת-צומת סילבר nanoaggregate, מהבהב ראמאן משופרת השטח פיזור (SERS) הוא ציין. כאן, פרוטוקול מוצג כיצד להתכונן הפעילים SERS סילבר nanoaggregate להקליט וידאו של כתמים מהבהב מסוימים בתמונה מיקרוסקופית, לנתח את הסטטיסטיקה מהבהב. ניתוח זה, חוק החשמל מתרבה של התפלגויות ההסתברות לאירועים בהיר יחסית משך הזמן שלהם. התפלגויות ההסתברות לאירועים כהה מצוידים ע פ חוק החשמל הפונקציה המעריכית. הפרמטרים של החוק כוח לייצג ההתנהגות המולקולרית במדינות הכהים והבהירים כאחד. המודל אקראי הליכה ואת המהירות של מולקולת כסף על פני כל יכול להיות מוערך. קשה להעריך אפילו בעת שימוש ממוצעים, פונקציות autocorrelation, וכן הדמיה SERS ברזולוציה-העל. בעתיד, כוח החוק ניתוחים לשלבו עם הדמיה ספקטרלי, כי מקורם של מהבהב לא יכול להיות מאושרות על ידי ניתוח פעולת שירות זו לבד.

Introduction

השטח משופרת ראמאן פיזור (SERS) היא רגישה מאוד ספקטרוסקופיית ראמאן ממשטח מתכת אצילה. מאז ספקטרום ראמאן מספק מידע מפורט על מבנה מולקולרי. המבוסס על העמדות שיא חדה, דרך הלטראלית של קבוצות פונקציונליות בהמולקולות, המידע של מולקולה בודדת על משטח מתכת יכול ייחקרו באמצעות SERS¹^,²^,³. מ nanoaggregate כסף עם adsorbate רמה מולקולה בודדת, איתות מהבהב נצפית¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^, ⁷ ^, ⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ ^, ¹⁶, ו הספקטרום תנודות¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^, ⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴. מהבהב יכולה להיגרם על ידי מולקולה בודדת שזז בצורה אקראית בין שדה (EM) אלקטרומגנטית משופרת-צומת nanoaggregate כסף בגודל ננומטר. לכן, מהבהב נחשבת ראיה פשוטה לגילוי מולקולה בודדת, לעומת טכניקה באמצעות התפלגות פואסון SERS עוצמות,³^,²^,דו-analyte¹⁷. עם זאת, המנגנון מפורט של הספקטרום מהבהב, המשתנות, אשר בתוקף תלויים ההתנהגות המולקולרית על פני Ag, הם עדיין שנוי במחלוקת.

במחקרים קודמים, מהבהב SERS נותחה באמצעות הפונקציה autocorrelation, אשר ניתן לחשב את מקדם דיפוזיה וריכוז של מולקולות נע פנימה והחוצה משופרת EM שדה¹²^,¹³^,¹⁴. יתר על כן, ציון מנורמל סטיית תקן, אשר מייצג את חוסר היציבות בעוצמה מוחלטת, יש כבר נגזר לפרופיל זמן של אות ה-¹⁵. עם זאת, גישות אנליטיות אלה עשויה להתבסס על ההתנהגות של מספר מולקולות. לעומת זאת, בתחום ההדמיה סופר רזולוציה של מהבהב SERS, מולקולה בודדת התנהגות בשדה EM משופרת יכול להיות מזוהה¹⁶. עם זאת, שיטות אלה ניתן לקבל פרמטרים כגון רק ב שדה EM משופרת. התנהגות אקראית של מולקולה בודדת בתוך מגוון רחב (למשל, ב מהבהב SERS) יכול להיות מיוצג חוק החשמל במקום ממוצע⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸ ^,⁹^,¹⁰^,¹¹, הדומה פלורסצנטיות מהבהב מ¹⁸^,¹⁹נקודה (QD) קוונטית בודדת מוליכים למחצה. על-ידי שימוש של כוח החוק ניתוח⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹, ההתנהגות המולקולרית יכול להיות משוער ב מדינת בהיר (בתחום EM משופרת) והן המדינה כהה¹⁰; כלומר, אופן הפעולה של המולקולה על פני השטח כולו כסף יכול להיות מוערך.

טכניקה זו, nanoaggregates colloidal כסף הם בשימוש⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹. Nanoaggregates אלה מראים להקות תהודה (LSPR) שונות המותאמות לשפות אחרות פלזמון משטח חזק להשפיע על שדות אלקטרו-מגנטיים משופרת כאשר הם מתרגשים באורכי גל מסוימים. לפיכך, פעיל SERS סילבר חלקיקים קיים צמיגי, חלק מהנתונים מיד ניתן להשיג. במקרה של nanostructures פשוט, שבו יש, ספציפית הסדרים, צורות וגדלים, התלות LSPR של SERS מהבהב יכול להסתיר אחרים dependences⁷; כלומר, אם ננו-מבנה טוב או רע כדי LSPR, הפרמטרים יהיה קבועים, dependences אחרים לכן יוסתרו. ניתוח החוק כוח שימש לגלות dependences שונים של SERS מהבהב כסף colloidal nanoaggregates⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^, ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת הדוגמא

הכנת כסף colloidal חלקיקי ²⁰
1. להמציא כסף colloidal חלקיקי, להמיס 0.030 g של חנקת הכסף ו- g 0.030 של ציטראט trisodium וגופרית והרכבו של 150 מ ל מים בבקבוקון התחתון עגול 200-mL.
2. משלבים את הבקבוק עם הקבל ריפלוקס (Dimroth).
3. מוסיפים את הפתרון הבקבוק עם פס מגנטי בחישה ומערבבים. לאחר מכן, מחממים את הפתרון מלהיב ב. הבקבוק באמבט שמן ב 150 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
  הערה: הפתרון תהפוך אפור צהוב, אז חלבי.
4. מגניב ההשעיה בטמפרטורת החדר, ואל המתלה הבקבוקון מכוסה ברדיד אלומיניום במקרר.
  הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות בשלב זה. השתמש colloidal חלקיקים, לאחר אחסון במקרר, בתוך חודש אחד.
הכנת דוגמת עבור צבעוני מהבהב פליטה ¹¹
1. להכין בשקופית מיקרוסקופ, לשטוף צלחת זכוכית עם סבון בעבודת יד, לשטוף אותו במים.
2. 0.1% פולי-L-ליזין תמיסה מימית להוסיף לוח הזכוכית, והסר את הפתרון עם מפוח.
3. להוסיף את המתלים colloidal כסף לוח הזכוכית, וכן להסיר את הבולם עם מפוח.
4. הקף את אזור שחרור בצלחת זכוכית עם עט חוסם נוזלי.
5. לשפוך מים מזוקקים על לוח הזכוכית, לכסות את זה עם עוד צלחת זכוכית כדי ליצור שקופית מיקרוסקופ ולמנוע המים מתאדים.
הכנת דוגמת עבור מונוטוני SERS מהבהבת בצבע ⁷ ^, ⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰
1. להכין בשקופית מיקרוסקופ, לשטוף צלחת זכוכית עם סבון בעבודת יד, לשטוף אותו במים.
2. מערבבים את המתלים colloidal כסף עם צבע thiacyanine או thiacarbocyanine (25 או 4 מיקרומטר, בהתאמה), תמיסה מימית של NaCl (10 מ מ)-יחס נפח של 2:1:1.
3. זרוק את המתלים מדגם על צלחת זכוכית, להסיר את הבולם עם מפוח.
4. הקף את אזור שחרור בצלחת זכוכית עם עט חוסם נוזלי.
5. ירידה של תמיסה מימית של NaCl (1 מ') על לוח הזכוכית כדי לשתק את סילבר חלקיקים, לכסות את זה עם עוד צלחת זכוכית כדי ליצור צלחת שקופיות מיקרוסקופ ולמנוע את הפתרון מתאדים.

2. התבוננות מהבהב סילבר חלקיקים

תאורה של מדגם
1. מקם את לוח הזכוכית מדגם שהוכנו באמצעות פרוטוקול 1.2 או 1.3 על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה.
2. יאיר לוח הזכוכית מדגם באמצעות אור לבן דרך שדה אפל מעבה, המוקד על כתמים צבעוניים שונים (כחול, ירוק, צהוב ואדום) על לוח הזכוכית באמצעות עדשת אובייקטיבי (60 X).
3. יאיר לוח הזכוכית מדגם באמצעות קרן הקלוש, שהועברו בזווית של 30 מעלות יחסית משטח הדגימה, שאוב מצב מוצק (DPSS) דיודת לייזר מכ (cw) דרך מסנן הפרעות.
4. כדי להשתמש תאורה לייזר כדי לבחון את nanoaggregates כסף כמו כתמים צבעוניים מונוטוני אותו בצבע של סביבה, להזיז את האזור תאורה לייזר למרכז התצוגה ולהתמקד הכתמים על לוח הזכוכית על-ידי התאמת השלב z-כיוון.
התבוננות מהבהב
1. להוסיף מסנן לעבור זמן רב לאחר העדשה אובייקטיבי, להאיר את לוח הזכוכית מדגם באמצעות קרן לייזר cw DPSS גאל בזווית של 30 מעלות ביחס השטח מדגם באמצעות מסנן הפרעות.
2. למצוא את המצמוץ יבחין כמוצג באיור 1 (ראה גם איור S1 בחומר משלים) על-ידי הזזת השלב ב x - ו y-ההוראות.
3. להקליט וידאו נקודות מהבהב עם המיקרוסקופ הפוכה, מצמידים מקורר דיגיטלי תשלום מצמידים מכשיר (CCD) מצלמה, בעל רזולוציה זמן של ms 61-120, כעשרים דקות.

3. ניתוח של מהבהב SERS

נגזרת של פרופיל זמן וידאו
1. בהתוכנה המפקחת על מצלמת CCD, פתח את קובץ הווידאו.
2. לבחירת נקודות מהבהב ואזור אפלים, גרור אזורים בנפרד לכסות אזורים עם או בלי נקודות של תמונת הוידיאו.
3. להפיק אותות בעוצמה זמן פרופילים מן כתמים מהבהב אזורים כהים וידאו, בחר ניתוח באונה בניתוחולאחר לחץ על חישוב בחלון ניתוח טמפורלית .
4. לשמור את הנתונים כקובץ טקסט.
ניתוח של הפרופיל זמן
1. לשטח תוכנית בסיסית של הפרופיל זמן על-ידי חיסור לפרופיל זמן אזור כהה ו/או התאמה עם פונקציה פולינום, כפי שמוצג דמויות 2A ו- 2B.
2. להעריך עוצמה בסיסית בממוצע שלא מורכב כ 2000 נקודות, אני_הבסיס, סטיית תקן של עוצמות בסיסית, σ, כפי שמוצג דמויות 2C ו- 2D.
3. להבדיל בהיר אירועים מאירועים כהה שימוש בעוצמות גדולות יותר מסף אני_בסיס + 3σ, והקלטה של משך הזמן של כל אירוע. איור 3, לדוגמה, להקליט את האירוע מ- 0 ל 3.5476 s כמו האירוע כהה (עם משך של t = 3.5476 s), ולתעד את האירוע מ 3.5476 כדי 4.0981 s כמו האירוע בהיר (עם משך של t = 0.5505 s). חזור על הליך כפי שמוצג בטבלה 1.
4. לספור את מספר אירועים הכהים והבהירים למשך כל, כפי שבאה לידי ביטוי הקווים הראשון והשני בטבלה 2.
5. לסכם מספר האירועים למשך כל, למעט אירועים קצרים יותר מאשר משך זמן t. כפי שבאה לידי ביטוי הקווים השני והשלישי של טבלה 2, לדוגמה, לסכם מספר האירועים למשך כל (מלבד האירועים עבור t = 0.0612 s) כמו 41 + 18 + 9 +...; התוצאה שווה. הסיכום עבור t = 0.1223 s, קרי 103.
6. מתחלק סיכומים של כל משך, לנרמל אותם. כפי שבאה לידי ביטוי בטבלה 2, לדוגמה, לחלק את הסיכום עבור משך זמן t = 0.0612 s על ידי ה-s משך 0.0612. התוצאה היא 3,351.5791. לאחר מכן, לחלק את התוצאה על ידי הכולל של התוצאות לשורה הרביעית בטבלה מס ' 2. התפלגות ההסתברות נגזר להיות 0.64494.
7. העלילה של התפלגויות ההסתברות עבור האירועים בהיר P_-(t) נגד שלהם משך t בגרף הלוגריתם-הלוגריתם, ובכושר יומן₁₀P_-(t) מאת יומן₁₀() להסיק את כוח החוק α המעריך_על ספציפי מהבהב ספוט. אם P_-(t) הוא מצויד ידי , קו מצויד סוטה מן החלקות על ערכים קטנים של P_-(t), כפי שמוצג על ידי הקו המקווקו באיור 4א.
8. העלילה של התפלגויות ההסתברות עבור אירועים כהה P_.(t) נגד שלהם משך t בגרף הלוגריתם-הלוגריתם, ובכושר יומן₁₀P_.(t) מאת יומן₁₀( להסיק את כוח החוק α המעריך_את , את חיתוך זמן τ מ המצמוץ באותה נקודה. אם P_.(t) הוא מצויד ידי , העקומה מצויד סוטה מן החלקות על ערכים קטנים של P_.(t).
9. חזור על 3.2.1 כדי 3.2.8 המקומות מהבהב אחרים וידאו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מ nanoaggregates כסף עם פולי-L-ליזין שהוכנו על ידי פרוטוקול 1.2, כתמים צבעוניים מהבהב SERS, זריחה משופרת משטח שנצפו, כפי שמוצג באיור 1¹¹. לעומת זאת, מונוטוני נקודות מהבהב צבעוניות מן SERS נצפו עבור nanoaggregates כסף מולקולות צבען שהוכנו על ידי פרוטוקול 1.3⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰. ישנם שני סוגים של תוצאות "שלילית": תוצאות רציף או תוצאות איפה SERS לא נצפית. התוצאות לשעבר ואת השנייה עלולה להיגרם על ידי ריכוזים גבוהים או נמוכים של מולקולות על פני השטח כסף colloidal, בהתאמה.

אותות nanoaggregate כסף יחיד הצג עוצמות שונות בזמנים שונים, כפי שמוצג באיור 2B. . זה שונה זריחה מהבהב של QD יחיד היסטוגרמות של עוצמת קרינה פלואורסצנטית הצג שתי הפסגות נפרדות, אשר מייצגים מדינות הכהים והבהירים¹⁸. הפרופיל זמן מעבר ארוך טווח דומה הרחבה שלו בטווח קצר, כמו באיור 3⁴. זה נקרא 'דמיון עצמי-' או 'פרקטל'; כלומר, התכונות של האובייקטים נחשבים דומים אם שלהם פיסיקליות מורחבים.

בגרף הלוגריתם-הלוגריתם, התפלגויות ההסתברות לאירועים הכהים והבהירים מותוות נגד את משכיהן כמו קו העקומה, בהתאמה, כפי שמוצג באיור 4 (בניגוד המצמוץ מ QD יחיד)¹⁹. בגרף, השיפוע של הקו מקביל המעריך חוק החשמל. לעומת זאת, הזמן קצר יותר לחיתוך הסיק מן העובדה כי החוק כוח עבור המדינה כהה ייחתך זנבות קצרים יותר. עבור האירוע SERS כהה, התפלגויות ההסתברות מצוידים לעתים על-ידי חוק החשמל במקום של פונקציה מעריכית. כלומר, חיתוך רב פעמים עם שגיאות גדולות הם לפעמים נגזר⁹^,¹⁰. עם זאת, אין תוצאה "שלילית" חוק החשמל עם פונקציה מעריכית אין אפשרות לשחזר את התפלגויות ההסתברות לאירוע SERS כהה.

כוח החוק המעריכים α_{הפעלה/כיבוי} , חיתוך פעמים τ להסיק סילבר חלקיקים בודדים הצג ערכים שונים, כפי שהוא מוצג באיור5. מתוך הרבה כוח החוק המעריכים, ממוצע עם שגיאה סטנדרטית נגזר, בהשוואה לערכים אחרים בתנאים שונים. במקרה של חיתוך פעמים, ממוצע חציון יותר-מאשר עשוי להיות מתאים עבור השוואה. למרבה המזל, שפע של נתונים יכול להיות שנאספו כמה קטעי וידאו של למצמץ, כי כתמים מהבהב בערך תריסר יכול להיות שנצפו בו זמנית את הוידאו.

איור 1: להחליפן בתמונות של SERS מהבהב. כתמים צבעוניים מהבהב שנצפו מ nanoaggregates כסף עם פולי-L-ליזין. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. זה נלקח עם מיקרוסקופ הפוכה מצמידים מצלמה צבע CCD דרך המעבר זמן לסנן (ראה את הסרט וידאו המקביל ב- S1 איור של חומר משלים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: (א) זמן נציג פרופיל בעוצמה אות מ מהבהב ספוט. (B) לפרופיל הזמן הבסיסית של מי יש נמחצו על ידי הפחתה לפרופיל זמן מהאזור החשוך ו/או מתאים וקל פונקציה פולינום. לשכפל, ברשות החברה המלכותית לכימיה⁸. (ג) הגדלה של מרובע (B), כלומר, הבסיס של הפרופיל זמן. (ד) צפיפות סכמטי של עוצמות של נקודות בסיס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: זמן נציג פרופיל של עוצמת האות מ המצמוץ ספוט, סף עבור ההגדרה של אירועים הכהים והבהירים (קו אופקי). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: התפלגויות ההסתברות נציג מהבהב נקודות לעומת משכים שלהם. (A) התפלגויות ההסתברות לאירועים בהיר להתוות נגד את משכיהן בגרף הלוגריתם-הלוגריתם. מוצק וקווים מנוקדים רבות תוצאות באמצעות משוואות כמו יומן₁₀P_-(t) = יומן₁₀( Equation 1 ), P_-(t) = , בהתאמה. (B) התפלגויות ההסתברות לאירועים כהה להתוות נגד את משכיהן בגרף הלוגריתם-הלוגריתם. הם יכול להיות מצויד כמו עיקול ניתנה על ידי חוק החשמל הפונקציה המעריכית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5: נציג היסטוגרמות של פרמטרים הנגזרים מהחוק כוח. היסטוגרמה (A) כוח החוק המעריכים לאירועים בהיר. היסטוגרמה (B) כוח החוק המעריכים לאירועים כהה. (C) היסטוגרמה של החיתוך פעמים בחוק החשמל הפונקציה המעריכית עבור האירועים כהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Supplemental Figure 1
S1 איור: נציג את הסרט של מהבהב SERS. כתמים צבעוניים מהבהב שנצפו מ nanoaggregates כסף עם פולי-L-ליזין. זה משתרע על שטח של 50 מיקרומטר × 40 µm, נלקח עם מיקרוסקופ הפוכה מצמידים מצלמה CCD צבע דרך מסנן פס ארוך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Supplemental Figure 2
S2 איור: נציג מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה תמונה של כסף nanoaggregate הנוצרת על-ידי תוספת של פולי-L-ליזין או NaCl. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Supplemental Figure 3
S3 איור: ספקטרום ראמאן קונבנציונליים עבור אבקת thiacarbocyanine, נציג טמפורלית במגזרים SERS ספקטרה מתוך יחיד nanoaggregate כסף עם thiacarbocyanine. לשכפל, ברשות החברה המלכותית לכימיה⁸. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

אירוע	זמן התחלה/s	סוף זמן/s	משך/s
כהה	0.0000	3.5476	3.5476
בהיר	3.5476	4.0981	0.5505
כהה	4.0981	5.8720	1.7738
בהיר	5.8720	5.9331	0.0612
כהה	5.9331	6.3613	0.4282
בהיר	6.3613	6.4836	0.1223
כהה	6.4836	6.6671	0.1835
בהיר	6.6671	6.7895	0.1223
כהה	6.7895	7.0341	0.2447
בהיר	7.0341	7.0953	0.0612
כהה	7.0953	8.3798	1.2845
בהיר	8.3798	8.4409	0.0612
כהה	8.4409	8.6856	0.2447
בהיר	8.6856	8.7468	0.0612
כהה	8.7468	9.6643	0.9175
בהיר	9.6643	9.9089	0.2447
כהה	9.9089	9.9701	0.0612
בהיר	9.9701	10.3371	0.3670
כהה	10.3371	10.3983	0.0612

טבלה 1: נציג עניינים כהה או בהיר אירוע, שעת התחלה אירוע, שעת סיום האירוע ומשך האירוע. אלה היו נגזר איור 3.

משך/s	לא. של אירוע	סיכום	(Summation)/(Duration)	התפלגות הסתברות/s^-1
0.0612	102	205	3351.5791	0.64494
0.1223	41	103	841.9821	0.16202
0.1835	18	62	337.8828	0.06502
0.2447	9	44	179.8408	0.03461
0.3058	4	35	114.4442	0.02202
0.3670	3	31	84.4707	0.01626
0.4282	3	28	65.3967	0.01258
0.4893	4	25	51.0911	0.00983
0.5505	1	21	38.1481	0.00734
0.6117	1	20	32.6983	0.00629
0.6728	5	19	28.2395	0.00543
0.7340	2	14	19.0740	0.00367
0.9786	1	12	12.2619	0.00236
1.0398	1	11	10.5789	0.00204
1.1621	2	10	8.6048	0.00166
1.3456	1	8	5.9452	0.00114
1.4068	1	7	4.9758	0.00096
1.9573	1	6	3.0655	0.00059
2.0796	1	5	2.4043	0.00046
2.2631	1	4	1.7675	0.00034
2.4466	1	3	1.2262	0.00024
2.8136	1	2	0.7108	0.00014
2.9359	1	1	0.3406	0.00007

טבלה 2: טבלת נציג של משך, מספר האירועים למשך כל, סיכום של מספר האירועים למשך זמן ארוך יותר, סיכומים מחולק כל ומשך שלהם התפלגויות ההסתברות מנורמל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מצומת nanoaggregate כסף, נפלטת SERS. לפיכך, עלינו להכין את nanoaggregates יותר מאשר colloidal חלקיקי, אשר מכוסים אניונים ציטראט. אגרגטים כסף נוצרות מן שיטת salting out האפקט שנוצר על-ידי התוספת של פולי-L-ליזין, אשר יש -NH₃⁺ , והוא המקור של SERS, או קטיונים Na⁺ של NaCl, כפי שמוצג באיור S2 של חומר משלים. יתר על כן, כדי להאיר את הנקודות רבים באזור רחב, קרן הלייזר לא ממוקד מועבר בזווית של 30 מעלות יחסית משטח הדגימה, דרך עדשה לא קשור המיקרוסקופ. קיימת אפשרות כי האזור תצפית לא מואר. אנו להתאים ולהעביר את האזור לייזר כדי להאיר את האזור התבוננות בהגדלה. לאחר מיטוב זה, נקודות צבעוניות מונוטוני גלויים באזור הסובב אותו בצבע. אלה הם שלבים קריטיים עבור מהבהב SERS תצפית.

כאן, נדונים נושאים הדורשים התייחסות לניתוח חוק החשמל. ראשית, הסף עבור ההגדרה של אירועים הכהים והבהירים השפעות הניתוח מהבהב. כאשר הסף הוא גדל, כוח החוק פרשניו לחיתוך פעמים נוטים להגדיל גם⁴^,⁵^,⁹. כאשר מעריכים (α_- ו α_.) ובשעות לחיתוך של התערוכה זרמים שונים, ניתן לגלות את התלות של SERS מהבהב. שנית, המעריך חוק כוח קטן יותר מייצג השיפוע תלול של הקו בהתחשב בחוק החשמל בגרף הלוגריתם-הלוגריתם, המייצג את ההסתברות התחתון של משך זמן עבור האירוע בהיר או כהה⁷. כי האירועים בהיר לא יכול להמשך המשכים ארוכים, פחות נקודות עבור האירועים בהיר מותוות בגרף מאשר עבור האירועים כהה. לאחר מכן, הערכים בα נוטים להיות קטנים יותר α_., ערכים⁷, בניגוד המצמוץ מ- QD יחיד (α_חופש = α_- =-1.5)¹⁸. שלישית, המעריכים רק להיות קצת יותר גדולים מ-1¹⁰, כי התפלגות ההסתברות ניתנת על ידי:

Equation 7 ,

של מי דרגות לטווח הביניים (נגזר מפרוטוקול 3.2.5; רואה השלישית בטבלה 2) נוטה להפחית ב המשכים ארוכים של t, כי אפילו מספר האירועים הכהים והבהירים עבור משכי זמן ארוכים יותר נוטה להיות ירד על ידי העובדה כי המולקולות להעביר באופן אקראי, יכול בקושי להישאר במצב הלא-emissive או emissive המדינה (צומת nanoaggregate) במשך תקופה ארוכה של זמן, כפי שבאה לידי ביטוי השורה השניה של טבלה 2. Α המעריך חוק החשמל =-1.5 או-1, יכול להיגזר מן העובדה כי המולקולה באקראי הולך על אחד משטח כסף - או two-dimensionally, בהתאמה⁴^,⁵^,¹⁸. לעומת זאת, הפעם לחיתוך מתקצר מהר מולקולרית אקראי הליכה ו/או מחסום אנרגיה גבוהה יותר מן הלא emissive המדינה emissive⁴^,⁵^,¹⁹. הוא ציין כי האחוזים של אירועים אשר התפלגות ניתן לשכפל ע פ חוק החשמל הפונקציה המעריכית הם נתונים חשובים⁹^,¹⁰, כי כשל רבייה מקורו של רב חיתוך פעמים.

הקודם מחקרים¹²^,¹³^,¹⁴, הפונקציה autocorrelation שימש גם עבור מהבהב SERS. הפונקציה autocorrelation, ששימשה ספקטרוסקופיה המתאם פלורסצנטיות, ייצג את דיפוזיה והקבוע ריכוזים של המולקולות פלורסנט בין מוקד אזור²¹^,²². עבור מהבהב SERS, עם זאת, אין פונקציה פשוטה יכול לשכפל את הפונקציה autocorrelation¹⁴. הדבר מצביע על תהליך מורכב עבור מהבהב SERS, כי תפקיד autocorrelation ניתן לזהות כמה תקופתיות. בניתוח כמותי אחר, תוצאה מנורמלת סטיית תקן היה נגזר פרופיל זמן של אות ה-¹⁵. ציון גדול הצביעו על חוסר יציבות בעוצמתם הכולל. גישות ניתוח אלה עשוי להיות מתאים את אופן הפעולה של מספר מולקולות, יותר מאשר ההתנהגות של מולקולה בודדת. יתר על כן, משך הזמן הממוצע עבור אירועים בהיר שימשו לניתוח של מהבהב SERS⁴^,¹⁴. אלה יכול לחשוף את אופן הפעולה של המולקולה ב שדה EM משופרת, הדומה ההדמיה סופר רזולוציה SERS¹⁶. עם זאת, הממוצעים לאירועים כהה יכול לא להיגזר; כלומר, משך הזמן הכולל של אירועים SERS כהה מכסף יחיד nanoaggregates ירדו מעלייה במספר אירועים⁴, בעוד שהמשך הכולל של אירועים SERS בהיר גדל. לכן, רק ההתנהגות המולקולרית של אירועים SERS בהיר יכול ייבדקו על ידי טכניקות אלה. באמצעות כוח החוק ניתוח, מצד שני, ההתנהגות המולקולרית של המדינה כהה (כלומר, על פני השטח כסף, מלבד צמתים של כסף nanoaggregates) יכול להיות מוערך במונחים כוח החוק α המעריך_את חיתוך וזמן¹⁰. זהו הבדל משמעותי של טכניקות הקודם.

כדי לוודא כי המצמוץ הנגרמת על ידי SERS, הספקטרום נמדד את nanoaggregate כסף במרכזו של נוף דרך הקדמוניות, כפי שמוצג באיור S3 בחומר משלים. עם זאת, הוא לא נמדד כל מהבהב כתמים⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹. פולי-L-ליזין¹¹, מהבהב באזור אורך גל ארוך מיוחסת לא SERS, אלא משופרת משטח פלורסצנטיות, שמקורה גם בשדות EM משופרות כמו SERS. יתר על כן, זה שנוי במחלוקת להתחבר ספקטרום fluctuated המצמוץ. זוהי מגבלה של הטכניקה הנוכחי.

בעתיד, מהבהב SERS צריך להיות מנותח מבחינת כל שיא. הניתוח חוק החשמל צריך להיות משולב עם הדמיה ספקטרלי. באמצעות bi-analyte טכניקה¹⁷, שבו ייחודי חתימות הרטט הם נצפו מ מעורב analytes, המקור של מולקולה בודדת SERS אומת. עם זאת, ההתנהגות המולקולרית לא משמעותית ייבדקו, בגלל הרזולוציה זמן. לאחרונה, התנהגות שונה של כל מקור זוהתה מבחינת הזמנים לחיתוך, על ידי התבוננות כל אחד המקומות מהבהב כל מסנן אופטי ואת ניתוח חוק החשמל¹¹.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחבר אין לחשוף.

Acknowledgments

המחבר תודה פרופסור י' וזאקי (אוניברסיטת Gakuin Kwansei), ד ר טי Itoh (הלאומי מכון מתקדם תעשייתי למדעים וטכנולוגיה) לצורך דיון פורה של עבודה זו. עבודה זו נתמכה על ידי KAKENHI (מענק הסיוע עבור C מחקר מדעי) של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע, והטכנולוגיה (מס 16K 05671).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver nitrate, 99.8%	Wako	194-00832
Trisodium citrate dihydrate, 99. %	Wako	191-01785
Poly-L-lysine aqueous solution, 0.1%	Sigma-Aldrich	P8920
3,3'-disulfopropylthiacyanine triethylamine	Hayashibara Biochemical Laboratories	NK-2703	a kind of thiacyanine dyes
3,3'-diethyl-5,5'-dichloro-9-methylthiacarbocyanine iodine salt	Hayashibara Biochemical Laboratories	SMP-9	a kind of thiacarobocyanine dyes
Sodium chloride, 99.5%	Wako	191-01665
Dimroth condenser	Iwaki	61-9722-22	perchased from AS ONE
Magnetic stirrer	Corning	DC-420D
Oil bath	Advantech	OS-220
Glass plate	Matsunami	S-1112	Microscope slide
Blower	Hozan	Z-288	Air duster
Liquid blocker pen	Daido Sangyo		LIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). Ready-to-use hydrophobic barrier pen designed for immunohistochemistry applications
Inverted microscope	Olympus	IX-70
Objective lens	Olympus	LCPlanFl 60×	NA 0.7
Dark field condenser	Olympus	U-DCD	NA 0.8–0.92
Cooled digital CCD camera	Hamamatsu	ORCA-AG	controlled by software Aqua Cosmos
Software for the cooled digital CCD camera	Hamamatsu	AquaCosmos	used for also derivation of the time-profiles from the blinking spots in the video
Color CCD camera	ELMO	TNC-C920	not used for analysis
DPSS laser	RGB laser system	NovaPro532-75	λ = 532 nm; 60 mW (corresponds to a power density of 600 W/cm2)
Interference filter	Semrock	LL01-532-12.5
Long pass filter	Semrock	BLP01-532R-25
Software for the distinguishment and counting of the bright/dark events	home-maid		programmed by C++
Software for the fitting by a power law	LightStone	Origin6.1