Summary
표면 강화 라만 점멸의 분석이이 프로토콜에 설명 합니다 전원 법을 사용 하 여 실버 표면에 단일 분자의 랜덤 워크 인 비 산.
Abstract
nanoaggregate 접속점에 단일 분자에서 관찰 표면 강화 된 라만 산란 (SERS) 점멸 합니다. 여기, 프로토콜 관련 활동을 준비 하는 방법에 선물 된다 nanoaggregate 실버, 미세한 이미지에서 특정 깜박이 명소의 비디오를 기록 하 고 깜박이 통계 분석. 이 분석에서 전원 법률 그들의 지속 시간에 상대적인 밝은 이벤트에 대 한 확률 분포를 재현합니다. 어두운 이벤트에 대 한 확률 분포는 지 수 함수 전원 법으로 적합 하다. 전원 법의 매개 변수는 모두 밝고 어두운 상태에서 분자 동작을 나타냅니다. 랜덤 워크 모델 및 전체 실버 표면에서 분자의 속도 추정 될 수 있습니다. 평균, 자기 상관 함수 및 슈퍼 해상도 관련 이미지를 사용 하는 경우에 추정 하는 것이 어렵습니다. 점멸의 기원만이 분석 방법에 의해 확인할 수 없습니다 때문에 미래에 전원 법 분석 스펙트럼 이미징, 함께 결합 되어야 합니다.
Introduction
표면 강화 라만 산란 (SERS) 고귀한 금속 표면에서 고감도 라만 분광학 이다. 금속 표면에 단일 분자의 정보를 조사 수 이후 기능적인 그룹 분자에서 진동 모드를 통해 날카로운 피크 위치에 따라 분자 구조에 대 한 자세한 정보를 제공 하는 라만 스펙트럼 관련1,2,3을 사용 하 여. 단일 분자 수준에서 흡착과 실버 nanoaggregate에서 깜박이 신호 관찰1,2,3,,45,6, 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16, 그리고 스펙트럼 변동1,2,3,,45,6,7,8, 9,10,11,12,,1314. 깜박임 무작위로 나노미터 크기의 nanoaggregate 접속점에 향상 된 전자기 (EM) 필드 밖으로 이동 하는 단일 분자에 의해 유도 될 수 있다. 따라서, 점멸 SERS 농도 및 bi 분석2,,317의 포아송 분포를 사용 하는 기술에 비해 단일 분자 검출에 대 한 간단한 증거를 간주 됩니다. 그러나, 강하게 Ag 표면에 분자 행동에 달려 있습니다, 깜박이 변동 스펙트럼의 상세한 메커니즘은 아직도 논란이 있습니다.
이전 학문에서는, 점멸 관련 분석 된 고 확산 계수는 향상 된 EM 필드12,13,14 밖으로 이동 하는 분자의 농도 계산할 수 있습니다 자기 상관 함수를 사용 하 여 . 또한, 불안정 총 강도 나타내는 정규화 된 표준 편차 점수는 신호15시간 프로필에서 파생 되었습니다. 그러나, 이러한 분석 방법 몇 가지 분자의 동작에 따라 수 있습니다. 반면, 깜박이 SER의 슈퍼 고해상도 이미징, 향상 된 EM 필드에 단일 분자 동작 확인 된16될 수 있습니다. 그러나, 이러한 기술은 향상 된 EM 필드에만 이러한 매개 변수를 얻을 수 있습니다. (예를 들어, 깜박이 SERS)에서 넓은 범위 내 단일 분자의 임의의 동작 전원 법 보다는 평균4,,56,7,8로 대표 될 수 있다 ,,910,11, 단일 반도체 양자 점 (QD)18,19의 점멸 형광 비슷합니다. 전원 법 분석4,5,6,7,,89,10,11, 분자 동작을 사용 하 여 (향상 된 EM 필드)에 밝은 상태와 어두운 상태10;에서 예상할 수 있는 즉, 전체 실버 표면 분자의 행동은 추정 될 수 있습니다.
이 기술에 대 한 실버 콜 로이드 nanoaggregates는 사용된4,5,6,7,,89,,1011. 이러한 nanoaggregates 그들은 특정 한 파장에 흥분 하는 때 강력 하 게 향상 된 전자기 필드를 영향을 미칠 다양 한 지역화 된 표면 플라스몬 공명 (LSPR) 밴드를 표시 합니다. 따라서, 관련 액티브 실버 나노 콜 로이드 서 스 펜 션, 그리고 일부 데이터에 존재 하는 즉시 얻을 수 있습니다. 특정 크기, 모양, 그리고 준비는 간단한 nanostructures의 경우 SER 점멸의 LSPR 의존 다른 의존7;을 숨길 수 있는 즉, LSPR에 좋은 소식이 나 나쁜 nanostructure 사용 하는 경우 매개 변수 상수, 되며 다른 의존 따라서 숨겨져 있을 것 이다. 전원 법 분석 실버 콜 로이드 nanoaggregates4,,56,7,8, 에서 깜박이 관련의 다양 한 종속성을 발견 하는 데 사용 되었습니다. 9 , 10 , 11.
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Protocol
1. 샘플 준비
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실버 콜 로이드 나노 입자의 준비 20
- 조작 실버 콜 로이드 나노 입자, 실버 질산염의 그리고 150 mL 200 mL 둥근 바닥 플라스 크에 물이 수화물 trisodium 시트르산의 0.030 g 0.030 g을 분해.
- 플라스 크를 결합 하 여 환류 (Dimroth) 콘덴서와 함께.
- 마그네틱 교 반기 및 저 어 바와 플라스 크에 솔루션을 저 어. 그런 다음 60 분 동안 150 ° C에 기름 목욕에서 플라스 크에서 감동적인 솔루션 열.
참고: 솔루션은 노란색, 다음은 하 회색을 돌 것 이다. - 서 스 펜 션, 실내 온도에 냉각 하 고 냉장고에 알루미늄 호 일로 덮여 플라스 크에 정지를 유지.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지이 시점에서. 콜 로이드 나노 입자를 사용 하 여 1 개월 이내는 냉장고에 저장 후.
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다중 색에 대 한 샘플의 준비 점멸 방출 11
- 현미경 슬라이드를 준비, 유리 접시 비누를 손으로 세척 하 고 물으로 씻어.
- 유리 접시에 0.1% 폴 리-L-리 신 수성 솔루션을 추가 하 고 솔루션을 제거 하는 송풍기와.
- 유리 접시에 실버 콜 로이드 현 탁 액을 추가 하 고 송풍기와 현 탁 액을 제거.
- 액체 차단 펜으로 유리 접시에 드롭 영역을 묶습니다.
- 유리 접시에 증류수를 삭제 하 고 다른 유리 접시 현미경 슬라이드를 만들고 증발에서 물을 방지 하기를 다룹니다.
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단조로운 색된 점멸 관련에 대 한 샘플의 준비 7 , 8 , 9 , 10
- 현미경 슬라이드를 준비, 유리 접시 비누를 손으로 세척 하 고 물으로 씻어.
- Thiacyanine 또는 thiacarbocyanine 염료와 실버 콜 로이드 현 탁 액을 혼합 (25 또는 4 µ M, 각각)와 2의 볼륨 비율로 NaCl (10mm) 용액: 1:1.
- 유리 접시에 샘플 중지를 삭제 하 고 송풍기와 현 탁 액을 제거.
- 액체 차단 펜으로 유리 접시에 드롭 영역을 묶습니다.
- 나노 입자를 고정을 유리 접시에 NaCl (1 M)의 수성 해결책을 삭제 하 고 다른 유리 접시 현미경 슬라이드 플레이트를 만들고 솔루션에서 증발 방지를 커버.
2입니다. 점멸은 나노 입자의 관찰
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샘플의 조명
- 1.2 또는 1.3 프로토콜을 사용 하 여 거꾸로 현미경의 스테이지 준비 샘플 유리 접시를 놓습니다.
- 목표 렌즈 (60 X)를 사용 하 여 유리 접시에 다양 한 색된 반점 (, 녹색, 노란색, 파란색과 빨간색)에 어두운 필드 콘덴서와 통해 하얀 빛을 사용 하 여 샘플 유리 접시 켜.
- 밝게 샘플 표면에 상대적으로 30 °의 각도 다이오드 펌프 고체 (DPSS) 연속파 (cw) 레이저 간섭 필터를 통해 전달 감쇠 광속을 사용 하 여 샘플 유리 접시.
- 사용 하 여 레이저 조명 같은 색 주변에 단조로운 색된 반점으로 실버 nanoaggregates 관찰, 보기의 센터에 레이저 조명 영역을 이동 하 고 z-방향으로 단계를 조정 하 여 유리 접시에 반점에 초점.
-
점멸의 관찰
- 목표 렌즈 후 긴-패스 필터를 삽입 하 고 간섭 필터를 통해 샘플 표면에 상대적으로 30 °의 각도에서 전달 DPSS cw 레이저 광선을 사용 하 여 샘플 유리 접시를 조명.
- 그림 1 에서 보듯이 명소 점멸 찾기 (참고 그림 S1 보충 자료에서) 무대에는 x-및 y-방향으로 이동 하 여.
- 거꾸로 현미경, 냉각된 디지털 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라, 61-120 ms의 시간 분해능이 20 분에 대 한 결합으로 깜박이 명소의 기록 영상.
3입니다. 깜박이 SER의 분석
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비디오에서 시간 프로필의 유래
- CCD 카메라를 제어 하는 소프트웨어에서 비디오 파일을 엽니다.
- 깜박이 관광 명소 및 어두운 영역을 선택 하려면 별도로 지역 명소 비디오 이미지 없이 커버 하는 영역을 드래그 합니다.
- 깜박이 관광 명소와 비디오에서 어두운 영역에서 신호 강도 시간 프로필 파생, 분석, 임시 분석 을 선택 하 고 임시 분석 창에서 계산 을 클릭 합니다.
- 텍스트 파일로 데이터를 저장.
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시간 프로 파일의 분석
- 어두운 영역 또는 그림 2A 와 2B와 같이 다항식 함수과 시간 프로필을 빼서 시간 프로필의 기준선을 평평.
- 약 2000 포인트, 난기본, 그리고 초기 농도의 표준 편차 σ, 그림 2C 및 2D에서 같이 구성 된 평균된 초기 강도 평가 합니다.
- 내가기본 + 3σ의 임계값 보다 큰 농도 사용 하 여 어두운 이벤트에서 밝은 이벤트를 구별 하 고 각 이벤트의 기간을 기록 합니다. 그림 3에서 예를 들어 0에서 3.5476 이벤트 기록 어두운 이벤트로 s ( t 기간 = 3.5476 s), 4.0981 3.5476에서 이벤트를 기록 하 고 밝은 이벤트로 s (기간 t = 0.5505 s). 표 1에 표시 된 것 처럼 절차를 반복 합니다.
- 표 2의 첫 번째 및 두 번째 라인에 표현 각 기간에 대 한 밝고 어두운 이벤트 수를 계산.
- 이벤트 기간 t보다 짧은 제외한 각 기간에 대 한 이벤트 수를 합계 하십시오. 표 2의 두 번째 및 세 번째 라인에 표현, 예를 들어 각 기간에 대 한 이벤트 수를 합계 ( t 에 대 한 이벤트를 제외 하 고 0.0612 = s) 41 + 18 + 9 +...; 결과 t 에 대 한 합계 = 0.1223 s, 즉, 103.
- 각 기간별로 합계를 분할 하 고 그들을 정상화. 표 2에 표현, 예를 들면, 기간 t 에 대 한 변론 분할 0.0612 = s 기간 0.0612 s. 결과 3,351.5791입니다. 그런 다음 표 2에 네 번째 줄에서 결과의 총 결과 나눕니다. 확률 분포는 0.64494 것 파생 됩니다.
- 밝은 이벤트 P(t)에 대 한 그들의 기간 t 로그-로그 그래프에 대 한 확률 분포를 플롯 및 로그10P에(t) 로그10에 의해 (
)는 전원 법 지 수 α에에 깜박이 자리 특정 추론할. P에(t)는으로 장착 하는 경우 , 그림 4A에 점선으로 표시 된 것 처럼 장착된 라인 P(t)의 값이 작은 플롯에서 일탈. - 어두운 이벤트 P오프(t) 로그-로그 그래프에 그들의 시간 t 에 대 한 확률 분포를 플롯 및 로그10(로그10P오프(t) 맞는
는 전원 법 지 수 α오프 와는 잘림 시간 τ 동일한 점멸에서 자리를 추론할. P오프(t)는으로 장착 하는 경우 , 맞춤된 곡선 P오프(t)의 값이 작은 플롯에서 성적이 상자. - 3.2.1 3.2.8 비디오에서 다른 깜박이 관광 명소에 대 한 반복 합니다.
는 전원 법 지 수 α오프 와는 잘림 시간 τ 동일한 점멸에서 자리를 추론할. P오프(t)는으로 장착 하는 경우 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
그림 111에서 같이 폴 리-L-리 신 1.2 프로토콜에 의해 준비와 함께 실버 nanoaggregates에서 관련 및 표면 강화 된 형광 색된 점멸 명소 관찰 된다. 반면에, SERS에서 단조로운 색된 점멸 명소 프로토콜 1.37,8,,910에 의해 준비 된 염료 분자와 실버 nanoaggregates에 대 한 관찰 되었다. "부정적인" 결과의 두 가지 유형이 있다: 지속적인 결과, 또는 아무 관련은 관찰 결과. 전 고 후자의 결과 각각 콜 로이드 실버 표면에 분자의 높은 또는 낮은 농도 의해 발생할 수 있습니다.
단일은 nanoaggregate에서 신호는 그림 2B와 같이 다양 한 시간에 다양 한 농도 보여줍니다. 이것은 단일 QD의 점멸 형광에서 다른입니다. 형광 강도의 히스토그램 표시 밝고 어두운 상태18를 대표 하는 두 가지 봉우리. 긴 범위 시간 프로필 그림 34처럼 짧은 범위에 그것의 확장와 비슷합니다. 이 라고 ' 자기 유사성 ' 또는 '프랙탈'; 즉, 개체의 특징은 그들의 길이 스케일 확장 되 면 비슷한 간주 됩니다.
로그-로그 그래프에서 밝고 어두운 이벤트에 대 한 확률 분포가 그려집니다 그들의 기간에 대 한 선 및 곡선, 각각, 그림 4 (단일 QD에서 깜박이) 반대19참조. 그래프에서 선의 기울기는 전원 법 지 수에 해당합니다. 반면, 짧은 자르기 시간 짧은 꼬리에 어두운 상태에 대 한 전원 법 잘린다는 사실에서 추론 이다. 어두운 관련 이벤트에 대 한 확률 분포는 때때로 전원 법 보다는 지 수 함수에 의해 적합 하다. 즉, 큰 오류가 매우 긴 잘림 번은 파생된9,10. 그러나, 그건 "부정적인" 결과 지 수 함수 전원 법 어두운 관련 이벤트에 대 한 확률 분포를 재현할 수 없습니다.
전원 법 지 수 α온/오프 및 잘림 시간 τ 그림 5에 표시 된 대로 개별 실버 나노 쇼에서 다양 한 값을 추론. 많은 전원 법 지 수에서 표준 오차와 평균 파생 이며 다양 한 조건에서 다른 값과 비교 합니다. 자르기 번의 경우 평균 보다는 중앙값 비교에 적합 수 있습니다. 다행히도, 약 12 깜박이 관광 명소 비디오에서 동시에 관찰 될 수 있기 때문에 데이터의 과다 점멸의 여러 동영상에서 얻을 수 있습니다.
그림 1: 깜박이 SERS의 대표 이미지. 여러 가지 빛깔된 깜박이 명소와 폴 리-L-리 신 실버 nanoaggregates에서 관찰 된다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이것은 긴 패스를 통해 컬러 CCD 카메라 결합 거꾸로 현미경으로 찍은 필터 (보충 자료의 그림 S1 에서 해당 비디오 동영상 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 신호 강도에서 깜박이 자리. 의 (A) 대표 시간 프로필 (B) 그 기준선은 빼서 어두운 영역에서 시간 프로필 및/또는 다항식 함수를 통해 피팅 평평 하 게 되어 시간 프로필. 화학의 왕 사회8에서 허가로 재현. (C) 확대의 광장 (B), 즉, 시간 프로필의 기준선. (D) 기준 포인트의 농도의 도식 밀도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 자리에서 점멸 신호 강도 및 밝고 어두운 이벤트 (수평 라인)의 정의 대 한 임계값의 대표적인 시간 프로필. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 깜박이 반점 그들의 기간에 대 한 플롯에 대 한 대표적인 확률 분포. (A) 밝은 이벤트에 대 한 확률 분포는 로그-로그 그래프에 그들의 기간에 대 한 플롯. 견고 하 고 점선 라인 로그10P(t)으로 방정식을 사용 하 여 결과 적합 = 로그10(
)와 P에(t) = , 각각. (B) 어두운 이벤트에 대 한 확률 분포는 로그-로그 그래프에 그들의 기간에 대 한 플롯. 그들은 지 수 함수 전원 법률에 의해 주어진 곡선으로 장착 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 전원 법에서 파생 된 매개 변수의 대표적인 히스토그램. (A) 히스토그램 밝은 이벤트에 대 한 전원 법 지 수. 어두운 이벤트에 대 한 전원 법 지 수 (B) 히스토그램. (C) 자르기의 히스토그램 어두운 이벤트에 대 한 전력 지 수 함수 법 회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 S1: 깜박이 SER의 대표적인 영화. 여러 가지 빛깔된 깜박이 명소와 폴 리-L-리 신 실버 nanoaggregates에서 관찰 된다. 이 50 µ m × 40 µ m의 영역을 커버 하 고 긴 패스 필터를 통해 컬러 CCD 카메라 결합 거꾸로 현미경으로 찍은. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
그림 S2: 폴 리-L-리 신 또는 NaCl의 추가 의해 형성 된은 nanoaggregate의 대표 스캐닝 전자 현미경 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 S3: thiacarbocyanine 분말에 대 한 기존의 라만 스펙트럼 및 thiacarbocyanine와 단일 실버 nanoaggregate에서 대표 임시 요동 SERS 스펙트럼. 화학의 왕 사회8에서 허가로 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 이벤트 | 시작 시간/s | 끝 시간/s | 기간/s |
| 어두운 | 0.0000 | 3.5476 | 3.5476 |
| 밝은 | 3.5476 | 4.0981 | 0.5505 |
| 어두운 | 4.0981 | 5.8720 | 1.7738 |
| 밝은 | 5.8720 | 5.9331 | 0.0612 |
| 어두운 | 5.9331 | 6.3613 | 0.4282 |
| 밝은 | 6.3613 | 6.4836 | 0.1223 |
| 어두운 | 6.4836 | 6.6671 | 0.1835 |
| 밝은 | 6.6671 | 6.7895 | 0.1223 |
| 어두운 | 6.7895 | 7.0341 | 0.2447 |
| 밝은 | 7.0341 | 7.0953 | 0.0612 |
| 어두운 | 7.0953 | 8.3798 | 1.2845 |
| 밝은 | 8.3798 | 8.4409 | 0.0612 |
| 어두운 | 8.4409 | 8.6856 | 0.2447 |
| 밝은 | 8.6856 | 8.7468 | 0.0612 |
| 어두운 | 8.7468 | 9.6643 | 0.9175 |
| 밝은 | 9.6643 | 9.9089 | 0.2447 |
| 어두운 | 9.9089 | 9.9701 | 0.0612 |
| 밝은 | 9.9701 | 10.3371 | 0.3670 |
| 어두운 | 10.3371 | 10.3983 | 0.0612 |
표 1: 어둡거나 밝은 이벤트, 이벤트 시작 시간, 종료 시간 이벤트 및 이벤트 기간 대표 테이블. 이 그림 3에서 파생 되었다.
| 기간/s | 롤 이벤트의 | 합계 | (Summation)/(Duration) | 확률 분포/s-1 |
| 0.0612 | 102 | 205 | 3351.5791 | 0.64494 |
| 0.1223 | 41 | 103 | 841.9821 | 0.16202 |
| 0.1835 | 18 | 62 | 337.8828 | 0.06502 |
| 0.2447 | 9 | 44 | 179.8408 | 0.03461 |
| 0.3058 | 4 | 35 | 114.4442 | 0.02202 |
| 0.3670 | 3 | 31 | 84.4707 | 0.01626 |
| 0.4282 | 3 | 28 | 65.3967 | 0.01258 |
| 0.4893 | 4 | 25 | 51.0911 | 0.00983 |
| 0.5505 | 1 | 21 | 38.1481 | 0.00734 |
| 0.6117 | 1 | 20 | 32.6983 | 0.00629 |
| 0.6728 | 5 | 19 | 28.2395 | 0.00543 |
| 0.7340 | 2 | 14 | 19.0740 | 0.00367 |
| 0.9786 | 1 | 12 | 12.2619 | 0.00236 |
| 1.0398 | 1 | 11 | 10.5789 | 0.00204 |
| 1.1621 | 2 | 10 | 8.6048 | 0.00166 |
| 1.3456 | 1 | 8 | 5.9452 | 0.00114 |
| 1.4068 | 1 | 7 | 4.9758 | 0.00096 |
| 1.9573 | 1 | 6 | 3.0655 | 0.00059 |
| 2.0796 | 1 | 5 | 2.4043 | 0.00046 |
| 2.2631 | 1 | 4 | 1.7675 | 0.00034 |
| 2.4466 | 1 | 3 | 1.2262 | 0.00024 |
| 2.8136 | 1 | 2 | 0.7108 | 0.00014 |
| 2.9359 | 1 | 1 | 0.3406 | 0.00007 |
표 2: 기간, 이벤트 각 기간, 긴 기간에 대 한 이벤트의 수의 합계에 대 한 합계를 각 기간 및 그들의 표준화 된 확률 분포를 나눈 수의 대표적인 테이블.
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Discussion
실버 nanoaggregate 접합에서 SER는 발생 합니다. 따라서, 우리는 시트르산 음이온으로 덮여 있다 콜 로이드 나노 입자, 보다는 오히려 nanoaggregates를 준비 해야 합니다. 실버 집계 효과 폴 리-L-리 신,-NH3+ 이며는 SER의 기원의 추가 의해 만들어진 소금에서 형성 된다 또는 NaCl, 보충 자료의 그림 s 2 와 같이에서 Na+ 양이온. 또한, 넓은 지역에 많은 관광 명소를 밝히는, 산만된 레이저 빔 현미경에 부착 되지 않은 렌즈를 통해 샘플 표면에 상대적으로 30 °의 각도에서 전달 된다. 관측 영역 조명 하지 가능성이 있다. 우리는 조정 하 고 높은 확대와 함께 관찰 영역을 밝게 하려면 레이저 영역 이동. 이 최적화 후 단조로운 색된 반점 같은 색 주변에서 볼 수 있습니다. 이들은 관련 관찰을 깜박이 위한 중요 한 단계입니다.
여기, 전력 법 분석에 대 한 관심을 필요로 하는 문제는 설명 합니다. 첫째, 밝고 어두운 이벤트의 정의 대 한 임계값 깜박이 분석 영향. 임계값을 증가 하는 경우 전원 법 지 수 및 잘림 시간 또한4,,59증가 경향이 있습니다. 지 수 (에 α와 α에서) 시간과 자르기 전시 다른 동향 때 깜박이 SERS의 의존을 검색 수 있습니다. 둘째, 더 작은 전원 법 지 수7밝은 또는 어두운 이벤트 대 한 오랜 기간 낮은 확률을 나타내는 로그-로그 그래프에 힘 법률에 의해 주어진 선의 가파른 기울기를 나타냅니다. 밝은 이벤트는 긴 기간에 대 한 계속할 수 없습니다, 때문에 어두운 이벤트 보다 적은 포인트 밝은 이벤트에 대 한 그래프에 플롯 됩니다. 다음, α 값에 α에서떨어져, 값7, 단일 QD에서 깜박이 달리 보다 작아야 하는 경향이 있다 (α에서 α에에 = =-1.5)18. 셋째, 지 수만-110보다 약간 더 큰 때문에 될 확률 분포에 의해 주어진 다:
,
중간 기간에 그 분자 (프로토콜 3.2.5에서에서 파생 된; 표 2의 세 번째 줄을 참조 하십시오) 더 긴 기간에 대 한 밝고 어두운 이벤트 수가는 사실에 의해 감소 될 경향이 있기 때문에 t 의 더 긴 기간에 감소 하는 경향이 있다 그 분자 임의로 이동 하 고 머물 수 있는 거의 비 브 주 또는 브 상태는 (nanoaggregate 접속점)에서 오랜 기간에 대 한 표 2의 두 번째 줄에 표현. 전원 법 지 수 α =-1.5 또는-1, 그는 분자 임의로 산책에 은색 표면 1-또는 2 차원적으로, 각각4,,518사실에서 파생 될 수 있다. 반면, 자르기 시간은 빨리 분자 랜덤 워크 및 브 상태4,,519비 브에서 더 높은 에너지 장벽에 의해 단축 됩니다. 그것은 지적 비율의 확률 분포는 지 수 함수 전원 법으로 복제할 수 없습니다 이벤트의 중요 한 데이터9,10, 복제 실패 아주 오랫동안에서 유래 하기 때문에 자르기 번입니다.
이전 연구12,,1314, 자기 상관 함수 또한 관련 점멸 사용 되었다. 형광 상관 분광학에 대 한 사용 된, 자기 상관 함수는 확산 계수와 초점 영역21,22에 밖으로 이동 하는 형광 분자의 농도 표현. 그러나 깜박임 관련, 대 한, 간단한 기능 상관 함수14재현할 수 있습니다. 자기 상관 함수는 어떤 주기를 확인할 수 있기 때문에이 관련, 깜박임에 대 한 복잡 한 과정을 제안 합니다. 또 다른 분석의 정량, 정규화 된 표준 편차 점수 신호15시간 프로필에서 파생 되었다. 큰 점수 총 강도에 불안정을 표시. 이러한 분석 방법 몇 가지 분자의 행동 보다는 단일 분자의 행동에 대 한 적합 한 수 있습니다. 또한, 밝은 이벤트에 대 한 평균 기간 관련4,14점멸의 분석을 위해 사용 되었다. 이러한 향상 된 EM 필드, SERS16의 슈퍼 해상도 이미지와 비슷한 분자의 동작을 공개 수 있습니다. 그러나, 어두운 이벤트에 대 한 평균 파생 되지 않을 수 있습니다; 즉, 단일에서 어두운 관련 이벤트의 총 기간 nanoaggregates 했다 감소4이벤트 증가 밝은 관련 이벤트의 전체 지속 시간 증가. 따라서, 밝은 관련 이벤트의 분자 행동은 이러한 기술에 의해 조사 될 수 있습니다. 전원 법 분석을, 다른 한편으로, 어두운 상태에 대 한 분자 동작을 사용 하 여 (즉, 실버 nanoaggregates의 교차점 제외은 표면에)는 전원 법 지 수 α오프 및 잘림 시간10 예상할 수 있는 . 이 이전 기술에서 상당한 차이가 있습니다.
확인 하 고는 관련에 의해 유발 됩니다 점멸, 스펙트럼 에서처럼 그림 S3 보충 자료에는 작은 구멍을 통해 보기의 센터에서 실버 nanoaggregate에서 측정 됩니다. 그러나, 그것은 모든 깜박이 명소7,,89,,1011에서 측정 된다. 폴 리-L-리 신11, 긴 파장 영역에서 점멸 SERS, 하지만 표면 강화 된 형광, 또한 향상 된 EM 분야 관련 유래를 기인한 다. 또한, 그것은 점멸 렸된 스펙트럼 연결 논란입니다. 이것은 현재 기술의 한계 이다.
미래에, SERS 깜박이 각 피크의 점에서 분석 되어야 합니다. 즉, 전력 법률 분석 스펙트럼 영상과 결합 되어야 합니다. Bi-분석 기술17, 고유 진동 서명 혼합된 analytes에서 관찰 된다를 사용 하 여 단일 분자 관련 원산지 확인 되었습니다. 그러나, 분자 행동 수 없습니다 크게 조사, 시간 해상도 때문에. 최근, 각 근원의 다른 동작 각 광학 필터 및 전원 법 분석11를 통해 깜박이 반점의 각각을 관찰 하 여 자르기 시간 측면에서 검색 되었습니다.
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Disclosures
저자는 공개 상관이 있다.
Acknowledgments
저자는이 작품의 그들의 유익한 토론에 대 한 교수부터 Y. 오자키 (간사이 학원 대학) 및 박사 T. 이토 (국립 연구소의 첨단 산업 과학 및 기술)을 감사합니다. 이 작품의 교육부, 문화, 스포츠, 과학, 및 기술 (No. 16 K 05671)에서 KAKENHI (선진적인 과학 연구 c)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver nitrate, 99.8% | Wako | 194-00832 | |
| Trisodium citrate dihydrate, 99. % | Wako | 191-01785 | |
| Poly-L-lysine aqueous solution, 0.1% | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3,3'-disulfopropylthiacyanine triethylamine | Hayashibara Biochemical Laboratories | NK-2703 | a kind of thiacyanine dyes |
| 3,3'-diethyl-5,5'-dichloro-9-methylthiacarbocyanine iodine salt | Hayashibara Biochemical Laboratories | SMP-9 | a kind of thiacarobocyanine dyes |
| Sodium chloride, 99.5% | Wako | 191-01665 | |
| Dimroth condenser | Iwaki | 61-9722-22 | perchased from AS ONE |
| Magnetic stirrer | Corning | DC-420D | |
| Oil bath | Advantech | OS-220 | |
| Glass plate | Matsunami | S-1112 | Microscope slide |
| Blower | Hozan | Z-288 | Air duster |
| Liquid blocker pen | Daido Sangyo | LIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). Ready-to-use hydrophobic barrier pen designed for immunohistochemistry applications | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Objective lens | Olympus | LCPlanFl 60× | NA 0.7 |
| Dark field condenser | Olympus | U-DCD | NA 0.8–0.92 |
| Cooled digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-AG | controlled by software Aqua Cosmos |
| Software for the cooled digital CCD camera | Hamamatsu | AquaCosmos | used for also derivation of the time-profiles from the blinking spots in the video |
| Color CCD camera | ELMO | TNC-C920 | not used for analysis |
| DPSS laser | RGB laser system | NovaPro532-75 | λ = 532 nm; 60 mW (corresponds to a power density of 600 W/cm2) |
| Interference filter | Semrock | LL01-532-12.5 | |
| Long pass filter | Semrock | BLP01-532R-25 | |
| Software for the distinguishment and counting of the bright/dark events | home-maid | programmed by C++ | |
| Software for the fitting by a power law | LightStone | Origin6.1 |
References
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