Summary
Denne protokollen beskriver analyse av blinkende overflaten forbedret Raman spredning på grunn av random walk av et eneste molekyl på en sølv overflate med makt lover.
Abstract
Fra et eneste molekyl på en sølv nanoaggregate junction, er blinker overflaten forbedret Raman spredning (SERS) observert. Her, en protokoll presenteres deg de SERS-aktive sølv nanoaggregate, spille inn en video av visse blinker i mikroskopiske bildet og analysere blinkende statistikken. I denne analysen var gjengir en strøm lov sannsynlighetsfordelinger for lyse hendelser i forhold til varigheten. Sannsynlighetsfordelinger for mørk begivenheter er utstyrt med en strøm lov med en eksponentiell funksjon. Parameterne for power loven representerer molekylær atferd i både lyse og mørke stater. Tilfeldig spasertur modellen og hastigheten på molekylet over hele sølv overflaten kan estimeres. Det er vanskelig å anslå selv når gjennomsnitt, autokorrelasjon funksjoner og super-oppløsning SERS bildebehandling. I fremtiden, bør power loven analyser kombineres med spektral imaging fordi opprinnelsen til blinker ikke bekreftes av denne analysemetode alene.
Introduction
Overflaten forbedret Raman spredning (SERS) er svært følsom Raman spektroskopi fra en noble metall-overflate. Siden Raman spekteret gir detaljert informasjon om molekylære struktur basert på de skarpe peak stillingene, gjennom vibrasjonsmedisin moduser av funksjonelle grupper i molekylene, kan informasjon om et enkel molekyl på metall undersøkes bruke SERS1,2,3. Fra en sølv nanoaggregate med en adsorbate på enkelt-molekylet nivå, er en blinkende signal observert1,2,3,4,5,6, 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16og spekteret svinger1,2,3,4,5,6,7,8, 9,,10,,11,,12,,13,,14. Blinker kan være forårsaket av et eneste molekyl som tilfeldig flytter inn og ut av en forbedret elektromagnetiske (EM)-feltet på en nanometer størrelse sølv nanoaggregate junction. Derfor anses blinker enkel bevis for single-molekylet oppdagelsen, sammenlignet med en teknikken bruker en Poisson-fordelingen av SERS intensitet og en bi-analytt2,3,17. Detaljert mekanismer for blinkende og varierende spekteret, kan sterkt avhengig molekylær atferd på Ag overflaten, er imidlertid fortsatt kontroversielt.
I tidligere studier er blinker SERS analysert ved hjelp av funksjonen autokorrelasjon, som kan beregne diffusjon koeffisient og konsentrasjonen av molekyler flytting av en forbedret EM feltet12,13,14 . Videre er en normalisert standardavvik score, som representerer ustabilitet i totale intensiteten, avledet fra tid profilen av signal15. Men kan disse analytiske tilnærminger være basert på oppførselen til noen molekyler. Derimot i en super-oppløsning avbildning av blinkende SERS, kan enkelt-molekylet situasjonen i et forbedret EM-felt være identifisert16. Disse teknikkene kan imidlertid få slike parametre i en forbedret EM-feltet. Tilfeldig virkemåten til et enkel molekyl innenfor (for eksempel i blinker SERS) kan representeres som en strøm lov i stedet for en gjennomsnittlig4,5,6,7,8 ,9,10,11, ligner blinkende fluorescens fra en enkelt semiconductor quantum dot (QD)18,19. Ved hjelp av en strøm lov analyse4,5,6,7,8,9,10,11, molekylær atferd kan anslås i både lyse tilstand (i feltet for forbedret EM) og mørk staten10; dvs kan virkemåten til molekylet over hele sølv overflaten estimeres.
Denne teknikken, sølv kolloidalt nanoaggregates er brukt4,5,6,,7,,8,,9,,10,,11. Disse nanoaggregates viser forskjellige lokaliserte overflaten plasmon resonans (LSPR) band som sterkt påvirker forbedret elektromagnetiske felt når de er spent på visse bølgelengder. Dermed kan umiddelbart SERS aktive silver nanopartikler finnes i kolloidalt suspensjon, og noen data hentes. Ved enkle nanostrukturer, som har bestemte utskriftsstørrelser, figurer og ordninger, kan LSPR avhengigheten av SERS blinker skjule andre avhengigheter7; nemlig, hvis det bra eller dårlig nanostructure til LSPR, parameterne er konstant, og de andre avhengigheter vil derfor være skjult. Power loven analyse er brukt til å oppdage ulike avhengigheter av den blinkende SERS sølv kolloidalt nanoaggregates4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sample forberedelse
-
Utarbeidelse av sølv kolloidalt nanopartikler 20
- For å utvikle silver kolloidalt nanopartikler, løses 0.030 g av sølv nitrat og 0.030 g trisodium citrate dihydrate i 150 mL vann i en 200-mL runde bunnen kolbe.
- Kombiner flasken med en reflux (Dimroth) kondensator.
- Rør løsningen i flasken med en magnetisk rørestang og rør. Deretter varme den gripende løsningen i flasken i et bad av olje på 150 ° C for 60 min.
Merk: Løsningen vil slå gul, deretter melkeaktig grå. - Cool suspensjon i romtemperatur, og holde suspensjon i flasken dekket med aluminiumsfolie i kjøleskap.
Merk: Protokollen kan pauses på dette punktet. Bruk kolloidalt nanopartikler, når i kjøleskap, innen en måned.
-
Utarbeidelse av utvalg for multi-farget blinker utslipp 11
- Klar en microscope skyve, vaske en glassplate med såpe for hånd og skyll den med vann.
- Legge til 0,1% vannoppløsning poly-L-lysine glassplaten og fjerne løsningen med en vifte.
- Legge til sølv kolloidalt suspensjon på glassplaten, og fjerne suspensjon med en vifte.
- Sett et slippområde på glassplaten med en flytende blokkering.
- Slipp destillert vann på glassplaten, og dekke det med en annen glassplate opprette en microscope skyve og hindrer vannet fordamper.
-
Utarbeidelse av prøven for ensformig farget blinkende RUKERE 7 , 8 , 9 , 10
- Klar en microscope skyve, vaske en glassplate med såpe for hånd og skyll den med vann.
- Bland sølv kolloidalt suspensjon med thiacyanine eller thiacarbocyanine fargestoff (25 eller 4 µM, henholdsvis) og NaCl (10 mM) vandig løsning i Volumforholdet 2:1:1.
- Slipp eksempel suspensjon på glassplaten, og fjerne suspensjon med en vifte.
- Sett et slippområde på glassplaten med en flytende blokkering.
- Slipp en vandig løsning av NaCl (1 M) på glassplaten til nakkens silver nanopartikler, og dekke det med en annen glassplate opprette et mikroskop lysbildet plate og hindre løsningen fordamper.
2. observasjon av blinkende Silver nanopartikler
-
Belysning av prøven
- Plass prøven glassplaten tilberedt med protokollen 1.2 eller 1.3 på scenen av en invertert mikroskop.
- Belyse eksempel glassplaten med hvitt lys gjennom en mørke felt kondensatoren og fokus på ulike fargede flekker (blå, grønn, gul og rød) på glassplaten med en linsen (60 X).
- Belyse eksempel glassplaten bruker en dempes stråle, levert i en vinkel på 30° i forhold til prøven overflaten, fra en diode-pumpet solid state (laser PEKER) continuous-wave (cw) laser gjennom en filter.
- Du bruker laser lys til å observere den sølv nanoaggregates som monotont flekker i samme farge omgivelser, flytte laser belysning området til midten av visningen og fokusere på flekker på glassplaten ved å justere scenen i z-retningen.
-
Observasjon av blinker
- Sette inn en lang-pass filter etter linsen og belyse eksempel glassplaten benytter en DPSS cw-laser stråle leveres i en vinkel på 30° i forhold til prøven overflaten gjennom en filter.
- Finn blinkingen flekker som vist i figur 1 (se også Figur S1 i supplerende materiale) ved å flytte scenen i x - og y-retningene.
- Spille inn video av de blinkende stedene med invertert mikroskopet, koblet til en avkjølt digital kostnad - sammen enhet (CCD) kameraet, som har en gang oppløsning på 61-120 ms, for 20 min.
3. analyse av blinkende RUKERE
-
Avledning av tid profilen fra video
- I programvaren som styrer CCD kameraet, åpne videofilen.
- For å velge blinkende flekker og mørkt område, kan du dra områder som separat dekker områder med og uten flekker i videobildet.
- For å utlede signal intensitet tidsprofiler fra blinkende flekker og mørke områder i videoen, velg Timelige analyse i analysen, og klikk Beregn i vinduet Timelige analyse .
- Lagre data som en tekstfil.
-
Analyse av tid profilen
- Slå sammen en plan for tiden profilen ved å trekke tid profilen fra den mørke området og/eller montering med en polynom funksjon, som vist i tall 2A og 2B.
- Evaluere en gjennomsnitt planlagte intensitet som består av ca 2000 poeng, jegbase, og standardavvik av planlagte intensitet, σ, som vist i tall 2C og 2D.
- Skille mellom lyse hendelser fra mørk hendelser ved hjelp av større intensitet enn en terskel jegbase + 3σ og registrerer varigheten av hver event. I Figur 3, for eksempel registrere hendelsen fra 0 3.5476 s som hendelsen mørke (med en varighet på t = 3.5476 s), og registrere hendelsen fra 3.5476 4.0981 s som hendelsen lys (med en varighet på t = 0.5505 s). Gjenta som vist i tabell 1.
- Telle antall lyse og mørke hendelser for hver varighet, som uttrykt i de første og andre tekstlinjen i tabell 2.
- Summere antall hendelser for hver varighet, unntatt hendelser kortere enn varighet t. Som uttrykt i andre og tredje Tabell2, for eksempel summere antall hendelser for hver varighet (unntatt hendelsene for t = 0.0612 s) som 41 + 18 + 9 +...; Resultatet er lik summering t = 0.1223 s, dvs 103.
- Dele summasjoner hver varighet og normalisere dem. Som uttrykt i tabell 2, for eksempel dele summering varighet t = 0.0612 s av varighet 0.0612 s. Resultatet er 3,351.5791. Deretter dele resultatet summen av resultatene i den fjerde linjen i tabell 2. Sannsynlighetsfordelingen hentes skal 0.64494.
- Plot sannsynlighetsfordelinger for den lyse hendelser Ppå(t) mot deres varighet t i en logaritmen-logaritmen graf, og passer Logg10Ppå(t) av stokk10 (
) til å utlede på power loven eksponent αpå for en bestemt blinker spot. Hvis Ppå(t) er utstyrt med , montert linjen avviker fra tomter på små verdier av Ppå(t), som vist av den stiplede linjen i Figur 4A. - Plot sannsynlighetsfordelinger for mørk begivenheter Pav(t) mot deres varighet t i en logaritmen-logaritmen graf, og passer Logg10Pav(t) av Logg10(
til å utlede den makt lov eksponent αav og den trunkering tid τ fra samme blinkingen spot. Hvis Pav(t) er utstyrt med , montert kurven avviker fra tomter på små verdier av Pav(t). - Gjenta 3.2.1 til 3.2.8 for andre blinkende flekker i videoen.
til å utlede den makt lov eksponent αav og den trunkering tid τ fra samme blinkingen spot. Hvis Pav(t) er utstyrt med Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fra den sølv nanoaggregates med poly-L-lysine utarbeidet av protokollen 1.2, er flerfargede blinkende flekker fra SERS og overflaten forbedret fluorescens observert, som vist i figur 111. Derimot ble monotont blinkende flekker fra SERS observert i sølv nanoaggregates med fargestoff molekyler utarbeidet av protokollen 1.37,8,9,10. Det finnes to typer "negative" resultater: kontinuerlig resultater eller resultatet der ingen SERS er observert. Tidligere og sistnevnte resultatene kan være forårsaket av høye eller lave konsentrasjoner av molekyler på kolloidalt sølv overflaten, henholdsvis.
Signalene fra en enkelt sølv nanoaggregate viser forskjellige intensiteter i ulike tider, som vist i figur 2B. Dette er forskjellig fra den blinkende fluorescensen av en enkelt QD. Histogrammer fluorescens intensitet viser to atskilte topper, som representerer lyse og mørke stater18. Tid profilen over en lang rekke ligner sin ekspansjon i en kort rekkevidde, som i Figur 34. Dette omtales som "self-similarity" eller "fraktal"; nemlig anses objektenes funksjoner lignende hvis deres lengde skalaer er utvidet.
I et logaritmen-logaritmen diagram plottes sannsynlighetsfordelinger for lyse og mørke hendelser mot varigheter som linje og kurve, henholdsvis, som vist i Figur 4 (i motsetning til den blinker fra en enkelt QD)19. I grafen tilsvarer stigningstallet for linjen power loven eksponenten. Derimot er kortere trunkering tiden utledet fra det faktum at makt loven for mørke staten er avkortet på kortere haler. For mørke SERS hendelsen, er sannsynlighetsfordelinger noen ganger utstyrt av en strøm lov i stedet en eksponentiell funksjon. Det er er svært lang trunkering ganger med stor feil noen ganger avledede9,10. Det er imidlertid ikke et "negative" resultat at en strøm lov med en eksponentiell funksjon ikke kan reprodusere sannsynlighetsfordelinger for mørke SERS arrangement.
På power loven eksponenterα/på og trunkeringstegn ganger τ utledet fra personlige silver nanopartikler viser ulike verdier, som vist i figur 5. Fra de mange makt loven eksponentene, er gjennomsnittlig med en standard feil avledet og sammenlignet med andre verdier i ulike forhold. Ved trunkering ganger, kan på median i stedet for gjennomsnitt være egnet for sammenligning. Heldigvis kan en mengde data samles fra flere videoer av blinker, fordi ca et dusin blinkende flekker kan observeres samtidig i videoen.
Figur 1: representant bilder av den blinkende SERS. Flerfargede blinkende flekker er observert fra sølv nanoaggregates med poly-L-lysine. Skala bar = 10 µm. Dette er tatt med en invertert mikroskop koplet til en farge CCD kamera gjennom en lang pass filter (se tilsvarende video filmen i Figur S1 av supplerende materiale). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: (A) representant tid profil av signal blinker spot. (B) tid profilen som opprinnelig har vært flatet trekke tid profilen fra mørke området og/eller passende via en polynom funksjon. Gjengitt med tillatelse fra Royal Society of Chemistry8. (C) utvidelsen av square i (B), nemlig grunnlinjen for tiden profilen. (D) skjematisk tettheten av intensiteten av planlagte poeng. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant tid profil av signal intensiteten fra blinkingen spot og terskelen for definisjonen av lyse og mørke hendelser (vannrette linjen). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representant sannsynlighetsfordelinger for blinkende flekker plottet mot varigheter. (A) sannsynlighetsfordelinger for lyse hendelser plottet mot varighetene i en logaritmen-logaritmen graf. Solid og stiplede linjer er montering resultater ved hjelp av formler som Logg10Ppå(t) = Logg10(
) og Ppå(t) = henholdsvis. (B) sannsynlighetsfordelinger for mørk begivenheter plottet mot varighetene i en logaritmen-logaritmen graf. De kan monteres som en kurve gitt av en strøm lov med en eksponentiell funksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representant histogrammer parametere fra power loven. (A) histogrammet på power loven eksponenter for lyse hendelser. (B) histogrammet på power loven eksponenter for mørk begivenheter. ()C) Histogram av trunkering ganger i strøm loven med en eksponentiell funksjon for mørke hendelser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur S1: representant film av blinkende SERS. Flerfargede blinkende flekker er observert fra sølv nanoaggregates med poly-L-lysine. Dette dekker et område på 50 µm × 40 µm og ble tatt med en invertert mikroskop koplet til en farge CCD kamera gjennom en lang pass filter. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Figur S2: representant scanning elektron mikroskop-bilde av en nanoaggregate dannet av tillegg poly-L-lysine eller NaCl. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur S3: konvensjonelle Raman spektrum for thiacarbocyanine pulver og representant timelige svingt SERS spectra fra en enkelt sølv nanoaggregate med thiacarbocyanine. Gjengitt med tillatelse fra Royal Society of Chemistry8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Hendelse | Start tid/s | Slutten tid/s | Varighet/s |
| mørk | 0.0000 | 3.5476 | 3.5476 |
| lyse | 3.5476 | 4.0981 | 0.5505 |
| mørk | 4.0981 | 5.8720 | 1.7738 |
| lyse | 5.8720 | 5.9331 | 0.0612 |
| mørk | 5.9331 | 6.3613 | 0.4282 |
| lyse | 6.3613 | 6.4836 | 0.1223 |
| mørk | 6.4836 | 6.6671 | 0.1835 |
| lyse | 6.6671 | 6.7895 | 0.1223 |
| mørk | 6.7895 | 7.0341 | 0.2447 |
| lyse | 7.0341 | 7.0953 | 0.0612 |
| mørk | 7.0953 | 8.3798 | 1.2845 |
| lyse | 8.3798 | 8.4409 | 0.0612 |
| mørk | 8.4409 | 8.6856 | 0.2447 |
| lyse | 8.6856 | 8.7468 | 0.0612 |
| mørk | 8.7468 | 9.6643 | 0.9175 |
| lyse | 9.6643 | 9.9089 | 0.2447 |
| mørk | 9.9089 | 9.9701 | 0.0612 |
| lyse | 9.9701 | 10.3371 | 0.3670 |
| mørk | 10.3371 | 10.3983 | 0.0612 |
Tabell 1: representant tabell med mørke eller lyse, hendelsen Starttidspunkt, sluttidspunkt for arrangementet og hendelsen varighet. Dette var avledet fra Figur 3.
| Varighet/s | nei. hendelse | Summering | (Summation)/(Duration) | Sannsynlighetsfordeling/s-1 |
| 0.0612 | 102 | 205 | 3351.5791 | 0.64494 |
| 0.1223 | 41 | 103 | 841.9821 | 0.16202 |
| 0.1835 | 18 | 62 | 337.8828 | 0.06502 |
| 0.2447 | 9 | 44 | 179.8408 | 0.03461 |
| 0.3058 | 4 | 35 | 114.4442 | 0.02202 |
| 0.3670 | 3 | 31 | 84.4707 | 0.01626 |
| 0.4282 | 3 | 28 | 65.3967 | 0.01258 |
| 0.4893 | 4 | 25 | 51.0911 | 0.00983 |
| 0.5505 | 1 | 21 | 38.1481 | 0.00734 |
| 0.6117 | 1 | 20 | 32.6983 | 0.00629 |
| 0.6728 | 5 | 19 | 28.2395 | 0.00543 |
| 0.7340 | 2 | 14 | 19.0740 | 0.00367 |
| 0.9786 | 1 | 12 | 12.2619 | 0.00236 |
| 1.0398 | 1 | 11 | 10.5789 | 0.00204 |
| 1.1621 | 2 | 10 | 8.6048 | 0.00166 |
| 1.3456 | 1 | 8 | 5.9452 | 0.00114 |
| 1.4068 | 1 | 7 | 4.9758 | 0.00096 |
| 1.9573 | 1 | 6 | 3.0655 | 0.00059 |
| 2.0796 | 1 | 5 | 2.4043 | 0.00046 |
| 2.2631 | 1 | 4 | 1.7675 | 0.00034 |
| 2.4466 | 1 | 3 | 1.2262 | 0.00024 |
| 2.8136 | 1 | 2 | 0.7108 | 0.00014 |
| 2.9359 | 1 | 1 | 0.3406 | 0.00007 |
Tabell 2: Representant tabell for varighet, antall hendelser for hver varighet, summering av antall hendelser for lengre varighet, summasjoner delt på hver varighet, og deres normalisert sannsynlighetsfordelinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fra en nanoaggregate veikryss slippes SERS. Derfor trenger vi å forberede nanoaggregates i stedet for kolloidalt nanopartikler, som er dekket med citrate anioner. Sølv aggregater er dannet av salting ut effekten skapt av tillegg av poly-L-lysin, som har -NH3+ og er opphavet til SERS, eller Na+ kasjoner fra NaCl, som vist i Figur S2 av supplerende materiale. Videre for å belyse de mange stedene i området bredt, leveres ufokusert laserstrålen i en vinkel på 30° i forhold til prøven overflaten, gjennom en linse som ikke er knyttet til mikroskopet. Det er en mulighet at observasjonen området ikke lyser. Vi justere og flytte laser området å belyse observasjonen området med høy forstørrelse. Etter dette optimalisering er monotont flekker synlige i samme farge omgivelser. Dette er viktige skritt for blinkende SERS observasjon.
Her drøftes saker som trenger oppmerksomhet for power loven analyse. Først påvirker terskelen for definisjonen av lyse og mørke hendelser blinkende analysen. Når terskelen er økt, pleier power loven eksponenter og trunkering ganger å øke samt4,5,9. Når eksponenter (αpå og αav) og trunkering ganger viser ulike trender, kan avhengigheten av den blinkende SERS oppdages. Andre, mindre strøm loven eksponenten representerer brattere stigningstallet for linjen gitt ved power loven logaritmen-logaritmen grafen, som representerer lavere sannsynligheten for en lang varighet for lyse eller mørke7. Fordi lyse hendelsene ikke kan fortsette for lang varighet, tegnes færre poeng for lyse hendelsene i grafen enn de er for mørk hendelser. Deretter αpå verdiene pleier å være mindre enn den αav, verdier7, i motsetning til blinkingen fra en enkelt QD (αav = αpå =-1.5)18. Tredje bli eksponentene bare litt større enn-110, fordi sannsynlighetsfordelingen er gitt av:
,
Hvis telleren i midten sikt (utledet fra protokollen 3.2.5, se tredje linje av tabell 2) tendens til å redusere ved lengre varighet for t, fordi selv antall lyse og mørke hendelser for lengre varighet tendens til å reduseres ved at molekylene flytte tilfeldig og kan neppe bo i en ikke-emissive stat eller emissive tilstand (krysset nanoaggregate) i lang tid, som uttrykt i den andre linjen i tabell 2. Power loven eksponent α =-1.5 eller -1, kan være avledet fra det faktum at molekylet tilfeldig går på den sølv overflate ett - eller two-dimensionally, henholdsvis4,5,18. Derimot forkortet trunkering tiden av en raskere molekylær tilfeldig spasertur og/eller høyere energi barriere fra en ikke-emissive til emissive staten4,5,19. Det bemerkes at prosentandelene av hendelser som fordelingen ikke kan reproduseres av en makt-lov med en eksponentiell funksjon er viktige data9,10, fordi reproduksjon feil kommer fra svært lang trunkering ganger.
I tidligere studier12,13,14, ble funksjonen autokorrelasjon også brukt for blinkende SERS. Funksjonen autokorrelasjon, som ble brukt til fluorescens korrelasjon spektroskopi, representerte diffusjon koeffisienter og konsentrasjoner av fluorescerende molekyler flytting av et satsningsområde21,22. For blinker SERS, men kan ingen enkel funksjon reprodusere autokorrelasjon funksjonen14. Dette antyder en kompleks prosess for blinkende SERS, fordi en autokorrelasjon funksjon kan identifisere noen periodisitet. I en annen kvantitativ analyse, ble en normalisert standardavvik score avledet fra en tid profil av signal15. En stor score angitt ustabilitet i totale intensitet. Disse analyse tilnærminger kan være egnet for virkemåten til noen molekyler, snarere enn et enkel molekyl atferd. Dessuten, den gjennomsnittlige varigheten for lyse hendelser ble brukt for analyse av blinkende SERS4,14. Dette kunne avsløre virkemåten til molekylet i et forbedret EM felt, ligner på super-oppløsning avbilding SERS16. Men kan gjennomsnittene for mørk begivenheter ikke hentes; nemlig, total varighet av mørke SERS hendelser fra én sølv nanoaggregates ble redusert med en økning i antall hendelser4, mens den totale varigheten av lyse SERS hendelser økte. Derfor kan bare molekylær virkemåten til lyse SERS hendelser bli undersøkt av disse teknikkene. Ved hjelp av en strøm lov analyse, derimot, molekylær virkemåten for mørke staten (dvs på sølv overflaten, unntatt knutepunkter i sølv nanoaggregates) kan beregnes i power loven eksponent αav og trunkering tiden10 . Dette er en betydelig forskjell fra forrige teknikker.
For å bekrefte at blinkingen er indusert av SERS, måles spekteret fra den sølv nanoaggregate midt i et syn gjennom et pinhole, som vist i Figur S3 i supplerende materiale. Men er det ikke målt fra alle blinkende flekker7,8,9,10,11. For poly-L-lysine11tilskrives blinker i et lang bølgelengde ikke SERS, men å overflaten forbedret fluorescens, som også kommer fra forbedret EM felt som SERS. Videre er det kontroversielle koble til variert spectra med blinkingen. Dette er en begrensning av nåværende teknikken.
I fremtiden, bør blinker SERS bli analysert i hver topp. Dvs bør power loven analysen kombineres med spektral bildebehandling. Ved hjelp av en bi-analytt teknikk17, der unike vibrasjonsmedisin signaturer er observert fra blandet analytter, er opprinnelsen til single-molekylet SERS bekreftet. Imidlertid undersøkes molekylær atferd ikke betydelig, på grunn av tid oppløsningen. Nylig har den ulike atferden til hver opprinnelse blitt oppdaget i trunkering tiden, ved å observere hver av de blinkende stedene gjennom hvert optisk filter og på power loven analyse11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatteren Takk Prof Y. Ozaki (Kwansei Gakuin University) og Dr. T. Itoh (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) for deres fruktbar diskusjon av dette arbeidet. Dette arbeidet ble støttet av KAKENHI (Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning C) fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi (nr. 16K 05671).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver nitrate, 99.8% | Wako | 194-00832 | |
| Trisodium citrate dihydrate, 99. % | Wako | 191-01785 | |
| Poly-L-lysine aqueous solution, 0.1% | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3,3'-disulfopropylthiacyanine triethylamine | Hayashibara Biochemical Laboratories | NK-2703 | a kind of thiacyanine dyes |
| 3,3'-diethyl-5,5'-dichloro-9-methylthiacarbocyanine iodine salt | Hayashibara Biochemical Laboratories | SMP-9 | a kind of thiacarobocyanine dyes |
| Sodium chloride, 99.5% | Wako | 191-01665 | |
| Dimroth condenser | Iwaki | 61-9722-22 | perchased from AS ONE |
| Magnetic stirrer | Corning | DC-420D | |
| Oil bath | Advantech | OS-220 | |
| Glass plate | Matsunami | S-1112 | Microscope slide |
| Blower | Hozan | Z-288 | Air duster |
| Liquid blocker pen | Daido Sangyo | LIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). Ready-to-use hydrophobic barrier pen designed for immunohistochemistry applications | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Objective lens | Olympus | LCPlanFl 60× | NA 0.7 |
| Dark field condenser | Olympus | U-DCD | NA 0.8–0.92 |
| Cooled digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-AG | controlled by software Aqua Cosmos |
| Software for the cooled digital CCD camera | Hamamatsu | AquaCosmos | used for also derivation of the time-profiles from the blinking spots in the video |
| Color CCD camera | ELMO | TNC-C920 | not used for analysis |
| DPSS laser | RGB laser system | NovaPro532-75 | λ = 532 nm; 60 mW (corresponds to a power density of 600 W/cm2) |
| Interference filter | Semrock | LL01-532-12.5 | |
| Long pass filter | Semrock | BLP01-532R-25 | |
| Software for the distinguishment and counting of the bright/dark events | home-maid | programmed by C++ | |
| Software for the fitting by a power law | LightStone | Origin6.1 |
References
- Qian, X. M., Nie, S. M. Single-molecule and single-nanoparticle SERS: from fundamental mechanisms to biomedical applications. Chem. Soc. Rev. 37, 912-920 (2008).
- Pieczonka, N. P. W., Aroca, R. F. Single molecule analysis by surfaced-enhanced Raman scattering. Chem. Soc. Rev. 37, 946-954 (2008).
- Kneipp, J., Kneipp, H., Kneipp, K. SERS -a single-molecule and nanoscale tool for bioanalytics. Chem. Soc. Rev. 37, 1052-1060 (2008).
- Kitahama, Y., Ozaki, Y. Analysis of blinking SERS by a power law with an exponential function. Frontiers of Surface-Enhanced Raman Scattering: Single-Nanoparticles and Single Cells. , Wiley. Chichester. Chapter 6 (2014).
- Kitahama, Y. Truncated Power Law Analysis of Blinking SERS. Frontiers of Plasmon Enhanced Spectroscopy Volume 1 (ACS Symposium series Vol. 1245). , American Chemical Society. Washington DC. Chapter 4 (2016).
- Bizzarri, A. R., Cannistraro, S. Lévy Statistics of Vibrational Mode Fluctuations of Single Molecules from Surface-Enhanced Raman Scattering. Phys. Rev. Lett. 94, 068303 (2005).
- Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Power-law analysis of surface-plasmon-enhanced electromagnetic field dependence of blinking SERS of thiacyanine or thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates. Phys. Chem. Chem. Phys. 13, 7439-7448 (2011).
- Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Analysis of excitation laser intensity dependence of blinking SERRS of thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates by using a power law with an exponential function. Chem. Commun. 47, 3888-3890 (2011).
- Kitahama, Y., Enogaki, A., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Truncated power law analysis of blinking SERS of thiacyanine molecules adsorbed on single silver nanoaggregates by excitation at various wavelengths. J. Phys. Chem. C. 117, 9397-9403 (2013).
- Kitahama, Y., Araki, D., Yamamoto, Y. S., Itoh, T., Ozaki, Y. Different behaviour of molecules in dark SERS state on colloidal Ag nanoparticles estimated by truncated power law analysis of blinking SERS. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 21204-21210 (2015).
- Kitahama, Y., Nagahiro, T., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Analysis of blinking from multicoloured SERS-active Ag colloidal nanoaggregates with poly-L-lysine via truncated power law. J. Raman. Spectrosc. 48, 570-577 (2017).
- Habuchi, S., et al. Single-Molecule Surface Enhanced Resonance Raman Spectroscopy of the Enhanced Green Fluorescent Protein. J. Am. Chem. Soc. 125, 8446-8447 (2003).
- Weiss, A., Haran, G. Time-Dependent Single-Molecule Raman Scattering as a Probe of Surface Dynamics. J. Phys. Chem. B. 105, 12348-12354 (2001).
- Emory, S. R., Jensen, R. A., Wenda, T., Han, M., Nie, S. Re-examining the origins of spectral blinking in single-molecule and single-nanoparticle SERS. Faraday Discuss. 132, 249-259 (2006).
- Itoh, T., Iga, M., Tamaru, H., Yoshida, K., Biju, V., Ishikawa, M. Quantitative evaluation of blinking in surface enhanced resonance Raman scattering and fluorescence by electromagnetic mechanism. J. Chem. Phys. 136, 024703 (2012).
- Willets, K. A. Super-resolution imaging of SERS hot spots. Chem. Soc. Rev. 43, 3854-3864 (2014).
- Dieringer, J. A., Lettan, R. B., Scheidt, K. A., Van Duyne, R. P. A Frequency Domain Existence Proof of Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 129, 16249-16256 (2007).
- Cichos, F., von Borczyskowski, C., Orrit, M. Power-law intermittency of single emitters. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 12, 272-284 (2007).
- Tang, J., Marcus, R. A. Mechanisms of fluorescence blinking in semiconductor nanocrystal quantum dots. J. Chem. Phys. 123, 054704 (2005).
- Lee, P. C., Meisel, D. Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols. J. Phys. Chem. 86, 3391-3395 (1982).
- Krichevsky, O., Bonnet, G. Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications. Rep. Prog. Phys. 65, 251-297 (2002).
- Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and Chemical Applications of Fluorescence Correlation Spectroscopy: A Review. Biochemistry. 41, 697-705 (2002).
