Summary
Este protocolo describe el análisis de parpadear Raman de superficie mejorada dispersión debido a la caminata al azar de una sola molécula sobre una superficie de plata usando leyes de la energía.
Abstract
De una sola molécula en una ensambladura de plata nanoaggregate, parpadear superficie-realzada Raman (SERS) de dispersión se observa. Aquí, se presenta un protocolo de cómo preparar el SERS-activo nanoaggregate de plata, grabar un vídeo de ciertos puntos parpadeantes en la imagen microscópica y analizar las estadísticas intermitentes. En este análisis, una ley de potencia reproduce las distribuciones de probabilidad para eventos brillantes en relación a su duración. Las distribuciones de probabilidad para los eventos oscuros están equipadas por una ley de potencia con una función exponencial. Los parámetros de la ley de energía representan el comportamiento molecular en Estados luminosos y oscuros. Se pueden estimar el modelo de paseo aleatorio y la velocidad de la molécula a través de toda la superficie de plata. Es difícil estimar aun cuando estén usando promedios, las funciones de autocorrelación y proyección de imagen de súper-resolución SERS. En el futuro, análisis de ley de energía se deben combinar con la proyección de imagen espectral, porque los orígenes de parpadear no se puede confirmar por este método de análisis solo.
Introduction
Superficie-realzada Raman (SERS) de dispersión es altamente sensible Espectroscopía Raman de superficie de un metal noble. Puesto que el espectro de Raman provee información detallada sobre la estructura molecular basado en las posiciones de pico agudo, a través de los modos vibracionales de grupos funcionales en las moléculas, se puede investigar la información de una sola molécula sobre una superficie de metal usando SERS1,2,3. De un nanoaggregate de plata con un adsorbato en el nivel de una sola molécula, una señal intermitente se observa1,2,3,4,5,6, 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16y el espectro oscila1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13,14. Intermitente puede ser inducida por una sola molécula que se mueve al azar dentro y fuera de un campo electromagnético mejorado de (EM) en un cruce de nanoaggregate de plata de nanómetro de tamaño. Por lo tanto, parpadeando se consideran pruebas simples para la detección de una sola molécula, en comparación con una técnica usando una distribución de Poisson de intensidades SERS y un bi-analito2,3,17. Sin embargo, los mecanismos detallados del espectro intermitente y fluctuante, que puede depender fuertemente de comportamiento molecular en la superficie del Ag, son todavía controvertidos.
En estudios previos, parpadeando SERS ha sido analizado utilizando la función de autocorrelación, que puede calcular el coeficiente de difusión y concentración de moléculas en movimiento dentro y fuera de un mejorado EM campo12,13,14 . Por otra parte, una puntuación de desviación estándar normalizada, que representa la inestabilidad de la intensidad total, se ha derivado por el perfil de tiempo de la señal15. Sin embargo, estos enfoques analíticos pueden basarse en el comportamiento de algunas moléculas. En cambio, en una imagen de súper-resolución de parpadear SERS, comportamiento de una sola molécula en un campo mayor de la EM puede ser identificados16. Sin embargo, estas técnicas pueden obtener estos parámetros solamente en un campo EM mejorado. El comportamiento aleatorio de una sola molécula en un amplio rango (por ejemplo, en parpadear SERS) puede ser representado como una ley de potencia en lugar de un promedio de4,5,6,7,8 ,9,10,11, similar a la intermitente de la fluorescencia de un semiconductor único quantum dot (QD)18,19. Mediante el uso de una energía ley análisis4,5,6,7,8,9,10,11, el comportamiento molecular puede estimarse en el brillante estado (en el campo EM mayor) y estado oscuro10; es decir, se puede estimar el comportamiento de la molécula sobre toda la superficie de plata.
Para esta técnica, plata coloidales nanoaggregates son usadas4,5,6,7,8,9,10,11. Estos nanoaggregates muestran varias bandas de resonancia (LSPR) plasmones localizados que afectan fuertemente mejoradas electromagnéticas cuando son excitados en ciertas longitudes de onda. Así, inmediatamente se puede obtener plata SERS-activo existen nanopartículas en suspensión coloidal y algunos datos. En el caso de nanoestructuras simple, que tienen acuerdos, formas y tamaños específicos, la dependencia LSPR de SERS parpadear puede ocultar otras dependencias7; es decir, si se utiliza la nanoestructura a LSPR buena o mala, los parámetros será constante, y por lo tanto, se ocultarán las otras dependencias. Análisis de ley de energía se ha utilizado para descubrir varias dependencias de lo SERS intermitente de plata coloidal nanoaggregates4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11.
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Protocol
1. preparación de la muestra
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Preparación de nanopartículas coloidales de plata 20
- Para fabricar plata coloidales nanopartículas, disolver 0,030 g de nitrato de plata y 0,030 g de citrato trisódico dihidrato en 150 mL de agua en un matraz de fondo redondo de 200 mL.
- Combinar el matraz con un condensador de reflujo (Dimroth).
- Agitar la solución en el matraz con una barra magnética de agitador y agitar. Luego, calentar la solución de agitación en el matraz en baño de aceite a 150 ° C durante 60 min.
Nota: La solución convertirá luego lechoso, amarillo gris. - Enfríe la suspensión a temperatura ambiente y mantener la suspensión en el frasco cubierto con papel de aluminio en el refrigerador.
Nota: El protocolo puede ser una pausa en este punto. Uso de las nanopartículas coloidales, después de guardar en el refrigerador, dentro de un mes.
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Preparación de muestra para varios colores parpadeando emisión 11
- Listo el portaobjetos de un microscopio, una placa de cristal con jabón de lavado a mano y enjuagar con agua.
- Añadir 0.1% soluciones acuosas del poly-L-lisina a la placa de cristal y retirar la solución con un soplador.
- Añadir la suspensión coloidal de plata a la placa de cristal y quitar la suspensión con un soplador.
- Incluya una zona de gota en el plato de cristal con un lápiz líquido bloqueador.
- Colocar agua destilada en el plato de cristal y cubrir con otra placa de vidrio para crear una diapositiva del microscopio y evitar que el agua se evapora.
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Preparación de muestra para SERS intermitente color monótono 7 , 8 , 9 , 10
- Listo el portaobjetos de un microscopio, una placa de cristal con jabón de lavado a mano y enjuagar con agua.
- La plata coloidal suspensión la mezcla con el tinte thiacyanine o thiacarbocyanine (μm 25 ó 4, respectivamente) y una solución acuosa de NaCl (10 mM) en una proporción de volumen de 2:1:1.
- La suspensión de la muestra sobre la placa de vidrio de la gota y quitar la suspensión con un soplador.
- Incluya una zona de gota en el plato de cristal con un lápiz líquido bloqueador.
- La gota de una solución acuosa de NaCl (1 M) en la placa de vidrio para inmovilizar las nanopartículas de plata y cubrir con otra placa de vidrio para crear una placa portaobjetos de microscopio e impedir la evaporación de la solución.
2. observación de centelleo nanopartículas de plata
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Iluminación de la muestra
- Coloque la placa de cristal de la muestra preparada con protocolo 1.2 o 1.3 en el escenario de un microscopio invertido.
- Iluminan la placa de vidrio la muestra utilizando luz blanca a través de un condensador de campo oscuro y un enfoque en varios puntos de color (azul, verdes, amarillos y rojos) en la placa de vidrio utilizando una lente de objetivo (60 X).
- Iluminan la placa de cristal de la muestra utilizando un haz atenuado, entregado en un ángulo de 30° con respecto a la superficie de la muestra, de un láser de onda continua (cw) bombeados de estado sólido (DPSS) de diodo a través de un filtro de interferencia.
- Para utilizar iluminación láser para observar la plata nanoaggregates como manchas de color monótonos en un mismo color, mueva el área de iluminación láser hacia el centro de la vista y centrarse en los puntos de la placa de vidrio mediante el ajuste de la etapa en la dirección z.
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Observación de centelleo
- Inserte un filtro de paso de largo después de la lente del objetivo y se ilumina la placa de cristal de la muestra con un rayo de cw-láser DPSS entregado en un ángulo de 30° con respecto a la superficie de la muestra a través de un filtro de interferencia.
- Encontrar el parpadeo puntos como se muestra en la figura 1 (véase también Figura S1 en el material suplementario) moviendo el escenario en las direcciones x y y.
- Grabar el video de los puntos parpadeantes con el microscopio invertido, acoplado a una cámara de refrigerado digital dispositivo de carga acoplada (CCD), que tiene una resolución de tiempo de 120 61 ms, durante 20 minutos.
3. Análisis de parpadear SERS
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Derivación de Perfil de tiempo de vídeo
- En el software que controla la cámara, abra el archivo de vídeo.
- Para seleccionar los puntos parpadeantes y zona oscura, arrastre las áreas que cubren por separado las regiones con y sin manchas en la imagen de vídeo.
- Para obtener perfiles de tiempo de intensidad de señal del intermitentes manchas y áreas oscuras en el video, seleccione Análisis Temporal en el análisisy haga clic en el cálculo en la ventana de Análisis Temporal .
- Guardar los datos como un archivo de texto.
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Análisis del perfil de tiempo
- Acoplar una línea de base del perfil tiempo restando el perfil de tiempo de la zona oscura o ajuste con una función polinómica, como se muestra en la figuras 2A y 2B.
- Evaluar una intensidad promedio de la línea de base que consiste en aproximadamente 2.000 puntos, basey una desviación estándar de las intensidades de línea de base, σ, como se muestra en las figuras 2 y 2D.
- Distinguir eventos brillantes oscuros eventos con intensidades mayores a un umbral de base + 3σ y registrar la duración de cada evento. En la figura 3, por ejemplo, grabar el evento de 0 a 3.5476 s como el evento oscuro (con una duración de t = 3.5476 s) y grabar el evento de 3.5476 a 4.0981 s como el evento brillante (con una duración de t = 0.5505 s). Repita el procedimiento como se muestra en la tabla 1.
- Contar el número de acontecimientos brillantes y oscuras para cada duración, expresada en la primera y segunda línea del cuadro 2.
- Suma el número de eventos para cada duración, excepto para eventos de menos duración t. Como expresa en la segunda y tercera línea del cuadro 2, por ejemplo, suma el número de eventos para cada duración (excepto para los eventos de t = 0.0612 s) 41 + 18 + 9 +...; el resultado es igual a la sumatoria de t = 0.1223 s, es decir, 103.
- Divida las sumatorias por cada duración y normalizarlos. Tal como se expresa en la tabla 2, por ejemplo, dividir la suma de duración t = 0.0612 s por la s de duración 0.0612. El resultado es 3,351.5791. Luego, divida el resultado por el total de los resultados en la cuarta línea en la tabla 2. La distribución de probabilidad se deriva para ser 0.64494.
- Parcela las distribuciones de probabilidad para los eventos brillantes Pen(t) contra su duración t en un gráfico de logaritmo logaritmo y ajuste Log10Pa(t) por registro10 (
) para deducir la ley exponente αen para un específico parpadeo punto. Si Pa(t) está ubicado por , la línea integral se desvía de las parcelas en pequeños valores de Pen(t), como se muestra por la línea punteada en la figura 4A. - Parcela las distribuciones de probabilidad para eventos oscuro Poff(t) contra su duración t en un gráfico de logaritmo logaritmo y ajuste Log10Pde(t) por (10) registro
deducir la energía ley α exponenteoff y el truncamiento tiempo τ de la intermitencia del mismo punto. Si Poff(t) está equipado por , la curva cabida se desvía de las parcelas en pequeños valores de Pde(t). - Repita 3.2.1 a 3.2.8 para los otros puntos parpadeantes en el video.
deducir la energía ley α exponenteoff y el truncamiento tiempo τ de la intermitencia del mismo punto. Si Poff(t) está equipado por Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De la plata nanoaggregates con poli-l-lisina preparado por protocolo 1.2, se observan manchas multicoloras parpadeantes de SERS y superficie-realzada de la fluorescencia, tal como se muestra en la figura 111. En cambio, puntos parpadeando color monótonos de SERS fueron observados para la nanoaggregates de plata con las moléculas de tinte preparadas por protocolo 1.37,8,9,10. Hay dos tipos de resultados "negativos": resultados continuadas, o donde no se observa SERS. Los resultados anteriores y esta última pueden ser causados por altas o bajas concentraciones de moléculas en la superficie de plata coloidal, respectivamente.
Las señales de un nanoaggregate de plata solo muestran diferentes intensidades en varios momentos, como se muestra en la figura 2B. Esto es diferente a la fluorescencia intermitente de un QD sola. Histogramas de la intensidad de fluorescencia muestran dos picos distintos, que representan los Estados luminoso y oscuro18. El perfil de tiempo sobre una larga distancia es similar a su expansión en un corto alcance, como en la figura 34. Esto se conoce como 'uno mismo-semejanza' o 'fractal'; es decir, características de los objetos se consideran similares si se amplían sus escalas de longitud.
En un gráfico de logaritmo logaritmo, las distribuciones de probabilidad para eventos brillantes y oscuras se trazan contra sus duraciones como una línea curva, respectivamente, como se muestra en la figura 4 (en contraposición con el parpadeo de un QD sola)19. En el gráfico, la pendiente de la recta corresponde al exponente de la ley de energía. Por el contrario, el tiempo más corto de truncamiento se deduce del hecho de que la ley de energía para el estado oscuro se trunca en colas más cortas. Para el oscuro caso de SERS, las distribuciones de probabilidad están equipadas de vez en cuando por una ley de potencia en lugar de una función exponencial. Es decir, truncamiento mucho tiempos con grandes errores son a veces derivados9,10. Sin embargo, no es un resultado "negativo" que una ley de potencia con una función exponencial no puede reproducir las distribuciones de probabilidad para un oscuro caso de SERS.
La energía ley exponentes αencendido y truncamiento tiempos τ deduce de nanopartículas de plata individuales Mostrar varios valores, como se muestra en la figura 5. De los muchos exponentes de ley de potencia, una media con un error estándar se deriva y en comparación con otros valores en diferentes condiciones. En el caso de tiempos de truncamiento, la mediana en lugar de media puede ser adecuada para la comparación. Afortunadamente, una gran cantidad de datos se desprende de varios videos de parpadeo, porque aproximadamente una docena de puntos parpadeantes pueden observarse simultáneamente en el video.
Figura 1: imágenes representativas de lo SERS intermitente. Se observan puntos parpadeantes multicoloras de plata nanoaggregates con poli-l-lisina. Barra de escala = 10 μm. Esto es tomado con un microscopio invertido juntado a una cámara de color CCD a través de un pase largo del filtro (ver la correspondiente película vídeo Figura S1 del material complementario). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Perfil de tiempo representativo (A) de la intensidad de la señal de parpadeo punto. (B) el perfil de tiempo cuya base ha sido aplanada por restar el perfil de tiempo de la zona oscura o conexión mediante una función polinómica. Reproducido con permiso de la Real Sociedad de química8. (C) Ampliación de la plaza en (B), es decir, la línea de base del perfil del tiempo. (D) densidad esquemático de las intensidades de los puntos de referencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Perfil de tiempo representativo de la intensidad de la señal del parpadeo punto y el umbral para la definición de eventos brillantes y oscuras (línea horizontal). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: distribuciones de probabilidad representante para puntos parpadeantes conspiraron contra sus duraciones. (A) las distribuciones de probabilidad para eventos brillantes trazan contra sus duraciones en un gráfico de logaritmo logaritmo. Las líneas sólidas y punteadas son montaje resultados usando ecuaciones como Log10Pa(t) = Log10(
) y Pa(t) = , respectivamente. (B) distribuciones de probabilidad para los eventos oscuros conspiraron contra sus duraciones en un gráfico de logaritmo logaritmo. Se puede colocar como una curva dada por una ley de potencia con una función exponencial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: histogramas representativos de los parámetros derivados de la ley de energía. (A) histograma de exponentes de ley de alimentación para eventos brillantes. (B) histograma de exponentes de ley de alimentación para eventos oscuros. ()C) histograma de truncamiento veces en ley de potencia con una función exponencial para los acontecimientos oscuros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura S1: película representativa de parpadear SERS. Se observan puntos parpadeantes multicoloras de plata nanoaggregates con poli-l-lisina. Esto cubre un área de 50 μm × 40 μm y fue tomada con un microscopio invertido juntado a una cámara CCD a color a través de un filtro de paso largo. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Figura S2: imagen representativa microscopio de nanoaggregate plata formada por adición de poly-L-lisina o NaCl. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura S3: espectro de Raman convencionales para thiacarbocyanine polvo, representante temporal fluctuó SERS espectros y un solo nanoaggregate de plata con thiacarbocyanine. Reproducido con permiso de la Real Sociedad de química8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Evento | Tiempo de inicio, s | Final hora/s | Duración/s |
| oscuro | 0.0000 | 3.5476 | 3.5476 |
| brillante | 3.5476 | 4.0981 | 0.5505 |
| oscuro | 4.0981 | 5.8720 | 1.7738 |
| brillante | 5.8720 | 5.9331 | 0.0612 |
| oscuro | 5.9331 | 6.3613 | 0.4282 |
| brillante | 6.3613 | 6.4836 | 0.1223 |
| oscuro | 6.4836 | 6.6671 | 0.1835 |
| brillante | 6.6671 | 6.7895 | 0.1223 |
| oscuro | 6.7895 | 7.0341 | 0.2447 |
| brillante | 7.0341 | 7.0953 | 0.0612 |
| oscuro | 7.0953 | 8.3798 | 1.2845 |
| brillante | 8.3798 | 8.4409 | 0.0612 |
| oscuro | 8.4409 | 8.6856 | 0.2447 |
| brillante | 8.6856 | 8.7468 | 0.0612 |
| oscuro | 8.7468 | 9.6643 | 0.9175 |
| brillante | 9.6643 | 9.9089 | 0.2447 |
| oscuro | 9.9089 | 9.9701 | 0.0612 |
| brillante | 9.9701 | 10.3371 | 0.3670 |
| oscuro | 10.3371 | 10.3983 | 0.0612 |
Tabla 1: tabla representativa del evento oscuro o brillante, hora de inicio del evento, hora de finalización del evento y duración del evento. Estos se derivaron de la figura 3.
| Duración/s | Jajaja de evento | Suma | (Summation)/(Duration) | Distribución de probabilidad/s-1 |
| 0.0612 | 102 | 205 | 3351.5791 | 0.64494 |
| 0.1223 | 41 | 103 | 841.9821 | 0.16202 |
| 0.1835 | 18 | 62 | 337.8828 | 0.06502 |
| 0.2447 | 9 | 44 | 179.8408 | 0.03461 |
| 0.3058 | 4 | 35 | 114.4442 | 0.02202 |
| 0.3670 | 3 | 31 | 84.4707 | 0.01626 |
| 0.4282 | 3 | 28 | 65.3967 | 0.01258 |
| 0.4893 | 4 | 25 | 51.0911 | 0.00983 |
| 0.5505 | 1 | 21 | 38.1481 | 0.00734 |
| 0.6117 | 1 | 20 | 32.6983 | 0.00629 |
| 0.6728 | 5 | 19 | 28.2395 | 0.00543 |
| 0.7340 | 2 | 14 | 19.0740 | 0.00367 |
| 0.9786 | 1 | 12 | 12.2619 | 0.00236 |
| 1.0398 | 1 | 11 | 10.5789 | 0.00204 |
| 1.1621 | 2 | 10 | 8.6048 | 0.00166 |
| 1.3456 | 1 | 8 | 5.9452 | 0.00114 |
| 1.4068 | 1 | 7 | 4.9758 | 0.00096 |
| 1.9573 | 1 | 6 | 3.0655 | 0.00059 |
| 2.0796 | 1 | 5 | 2.4043 | 0.00046 |
| 2.2631 | 1 | 4 | 1.7675 | 0.00034 |
| 2.4466 | 1 | 3 | 1.2262 | 0.00024 |
| 2.8136 | 1 | 2 | 0.7108 | 0.00014 |
| 2.9359 | 1 | 1 | 0.3406 | 0.00007 |
Tabla 2: Tabla representativa de la duración, número de eventos para cada duración, suma del número de eventos de mayor duración, sumatorias divididas por cada duración y sus distribuciones de probabilidad normalizadas.
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Discussion
Desde el cruce de nanoaggregate plata, SERS se emite. Así, tenemos que preparar nanoaggregates en lugar de nanopartículas coloidales, que se cubren con aniones citrato. Agregados de plata se forman a partir de la salazón efecto creado por la adición de poly-L-lisina, NH -3+ y es el origen del SERS, o cationes de Na+ de NaCl, como se muestra en la Figura S2 del material complementario. Por otra parte, para iluminar los lugares en la zona amplia, el rayo láser desenfocado se entrega en un ángulo de 30° con respecto a la superficie de la muestra, a través de una lente que no está conectada al microscopio. Hay una posibilidad que no se ilumina la zona de observación. Ajustar y mover el área de láser para iluminar la zona de observación con alta magnificación. Después de esta optimización, manchas de color monótonos son visibles en los alrededores del mismo color. Estos son pasos críticos para parpadear observación SERS.
Aquí se discuten asuntos que requieren atención para el análisis de la ley de energía. En primer lugar, el umbral para la definición de eventos brillantes y oscuras influencias el análisis intermitente. Cuando el umbral se incrementa, los exponentes de ley de potencia y los tiempos de truncamiento tienden a aumentar como4,5,9. Cuando los exponentes (αa y αapagado) y truncamiento veces exhibición las diferentes tendencias, puede descubrir la dependencia de lo SERS intermitente. En segundo lugar, el menor exponente de ley de energía representa la cuesta más escarpada de la línea dada por la ley de energía en la gráfica de logaritmo logaritmo, que representa la probabilidad más baja de larga duración para el evento brillante u oscuro7. Porque no pueden seguir los eventos brillantes de larga duración, menos puntos de los eventos brillantes se trazan en el gráfico de lo que son para los acontecimientos oscuros. Entonces, el αen valores tienden a ser más pequeño que el αde, valores7, a diferencia de la intermitencia de un QD sola (αapagado = αa = -1.5)18. En tercer lugar, los exponentes sólo se convierten en algo mayores que-110, porque la distribución de probabilidad está dada por:
,
cuyo numerador a medio plazo (derivado de protocolo 3.2.5; vea la tercera línea del cuadro 2) tiende a disminuir en duraciones más largas de t, ya que incluso el número de acontecimientos brillantes y oscuras para duraciones más largas tiende a ser disminuida por el hecho de que las moléculas moverse al azar y no pueden permanecer en un estado no emisión o emisión (el cruce de la nanoaggregate) durante un largo periodo de tiempo, expresada en la segunda línea del cuadro 2. La ley de potencia exponente α = -1.5 o -1, puede ser derivado del hecho de que la molécula al azar camina en la plata una superficie, o representan, respectivamente,4,5,18. Por el contrario, el tiempo de truncamiento se acorta por un más rápido molecular paseo aleatorio o barrera de energía mayor de no emisión a emisión estado4,5,19. Se observa que los porcentajes de eventos cuya distribución de probabilidad no puede ser reproducido por una ley de potencia con una función exponencial son datos importantes9,10, porque falta de reproducción origina mucho tiempos de truncamiento.
En anteriores estudios12,13,14, la función de autocorrelación también fue utilizada para parpadear SERS. La función de autocorrelación, que fue utilizada para la espectroscopia de correlación de fluorescencia, había representado los coeficientes de difusión y las concentraciones de moléculas fluorescentes moverse dentro y fuera de un área focal de21,22. Para centelleo SERS, sin embargo, ninguna función simple puede reproducir la función de autocorrelación14. Esto sugiere un proceso complejo para parpadear SERS, porque una función de autocorrelación puede identificar cierta periodicidad. En otro análisis cuantitativo, una puntuación de desviación estándar normalizada se deriva de un perfil de tiempo de la señal15. Una gran puntuación indica inestabilidad en intensidad total. Estos métodos de análisis pueden ser adecuados para el comportamiento de unas pocas moléculas, en lugar de comportamiento de una sola molécula. Además, las duraciones promedio para los eventos brillantes fueron utilizadas para el análisis de parpadear SERS4,14. Estos podrían revelar el comportamiento de la molécula en un campo de EM mayor, similar a la proyección de imagen de súper-resolución de SERS16. Sin embargo, no se podrían derivar los promedios para eventos oscuros; es decir, la duración total de eventos SERS oscuros de plata solo nanoaggregates fueron disminuidos por un aumento en el número de los eventos4, mientras que aumentó la duración total de acontecimientos brillantes de SERS. Por lo tanto, sólo el comportamiento molecular de brillantes eventos SERS podría ser investigado por estas técnicas. Mediante el uso de un ley análisis de energía, por el contrario, el comportamiento molecular del Estado oscuro (es decir, en la superficie de plata, excepto en cruces de plata nanoaggregates) puede ser estimado en términos de la energía ley α exponenteoff y truncamiento tiempo10 . Se trata de una diferencia significativa de las técnicas anteriores.
Para confirmar que el parpadeo sea inducido por SERS, el espectro se mide desde la plata nanoaggregate en el centro de una vista a través de un agujero de alfiler, como se muestra en la Figura S3 en el material complementario. Sin embargo, no se mide de los parpadeantes puntos7,8,9,10,11. Poly-L-lisina11, parpadeando en una zona de longitud de onda larga se atribuye no SERS, sino superficie-realzado de la fluorescencia, que se origina también en campos de EM mayor como SERS. Por otra parte, es polémico para conectar los espectros fluctuantes con el parpadeo. Esto es una limitación de la técnica actual.
En el futuro, parpadeando SERS debe ser analizada en términos de cada pico. Es decir, el análisis de la ley de energía se debe combinar con la proyección de imagen espectral. Mediante el uso de un bi-analito técnica17, en el cual se observa firma vibratoria única de analitos mixtos, se ha confirmado el origen de una sola molécula SERS. Sin embargo, comportamiento molecular no puede ser significativamente investigado, debido a la resolución de tiempo. Recientemente, se ha detectado el comportamiento diferente de cada origen en cuanto a los tiempos de truncamiento, observando cada uno de los puntos parpadeantes a través de cada filtro óptico y el poder de análisis ley11.
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Disclosures
El autor no tiene nada que revelar.
Acknowledgments
El autor agradece su fructífera discusión de este trabajo Prof. Y. Ozaki (Universidad de Kwansei Gakuin) y Dr. T. Itoh (nacional del Instituto de Ciencia Industrial avanzada y tecnología). Este trabajo fue apoyado por KAKENHI (subvenciones para investigación científica) desde el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología (no. 16K 05671).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver nitrate, 99.8% | Wako | 194-00832 | |
| Trisodium citrate dihydrate, 99. % | Wako | 191-01785 | |
| Poly-L-lysine aqueous solution, 0.1% | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3,3'-disulfopropylthiacyanine triethylamine | Hayashibara Biochemical Laboratories | NK-2703 | a kind of thiacyanine dyes |
| 3,3'-diethyl-5,5'-dichloro-9-methylthiacarbocyanine iodine salt | Hayashibara Biochemical Laboratories | SMP-9 | a kind of thiacarobocyanine dyes |
| Sodium chloride, 99.5% | Wako | 191-01665 | |
| Dimroth condenser | Iwaki | 61-9722-22 | perchased from AS ONE |
| Magnetic stirrer | Corning | DC-420D | |
| Oil bath | Advantech | OS-220 | |
| Glass plate | Matsunami | S-1112 | Microscope slide |
| Blower | Hozan | Z-288 | Air duster |
| Liquid blocker pen | Daido Sangyo | LIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). Ready-to-use hydrophobic barrier pen designed for immunohistochemistry applications | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Objective lens | Olympus | LCPlanFl 60× | NA 0.7 |
| Dark field condenser | Olympus | U-DCD | NA 0.8–0.92 |
| Cooled digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-AG | controlled by software Aqua Cosmos |
| Software for the cooled digital CCD camera | Hamamatsu | AquaCosmos | used for also derivation of the time-profiles from the blinking spots in the video |
| Color CCD camera | ELMO | TNC-C920 | not used for analysis |
| DPSS laser | RGB laser system | NovaPro532-75 | λ = 532 nm; 60 mW (corresponds to a power density of 600 W/cm2) |
| Interference filter | Semrock | LL01-532-12.5 | |
| Long pass filter | Semrock | BLP01-532R-25 | |
| Software for the distinguishment and counting of the bright/dark events | home-maid | programmed by C++ | |
| Software for the fitting by a power law | LightStone | Origin6.1 |
References
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