Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å oppnå stabil integrering av en genet av interesse i det menneskelige genomet av transcriptionally regulert Sleeping Beauty systemet. Utarbeidelse av integrering av defekte lentiviral vektorer i vitro Albin på menneskelige celler og molekylære analysen på transduced celler rapporteres.
Abstract
Sleeping Beauty (SB) transposon er en ikke-viral integrere med påvist effekt for genoverføring og funksjonell genomforskning. For å optimalisere SB transposon maskiner, er en transcriptionally regulert hyperaktiv transposase (SB100X) og T2-baserte transposon ansatt. Vanligvis, transposase og transposon tilbys transiently av plasmider transfection og SB100X uttrykk er drevet av en konstituerende promoter. Her beskriver vi en effektiv metode for å levere SB komponentene til menneskelige celler som er motstandsdyktig mot flere fysiske og kjemiske transfection metoder, til å kontrollere SB100X uttrykk og stabilt integrere en genet av interesse (GOI) gjennom en "klippe og lime" SB mekanisme. Uttrykk for hyperaktiv transposase er strengt kontrollert av Tet-på systemet, mye brukt til å kontrollere genuttrykk siden 1992. Genet av interesse er flankert av invertert gjentar (IR) av T2 transposon. Begge SB komponentene pakkes i integrering defekt lentiviral vektorer transiently produsert i HEK293T celler. Menneskelige celler, linjer eller primære celler fra menneskelig vev, er i vitro transiently transduced med viral vektorer. Ved tillegg av doxycycline (dox, tetracycline analog) til kultur medium, en finjustering av transposase uttrykk måles og resulterer i en varige integrasjon av genet av interesse i genomet av behandlet cellene. Denne metoden er effektiv og celle linje (f.eks HeLa celler) og primære keratinocytter (f.eks menneskelige primære), og dermed representerer et verdifullt verktøy for genteknologi og terapeutiske genoverføring.
Introduction
Den hyperaktiv SB100X transposase koblet til T2-baserte transposon er allerede brukt i preklinisk gene terapi programmer1,2,3genom endringene4,5, og indusert pluripotent stilk cellen (iPSC) omprogrammering6,7. Vanligvis SB komponentene leveres transiently av plasmider transfection og en sterk konstituerende promoter stasjoner uttrykk for transposase. Men til tross for forbedret nye metoder for hva, levering av to-komponent er fortsatt en utfordring for mange programmer. Dermed har utviklingen av en ny levering protokoll økende interesse. Foruten transfection metoder for plasmider8 og mRNA9, viral levering basert på adenoviral10,11, adeno-assosiert virus (AAV)12, Baculovirus13, gammaretroviral14 og lentiviral vektorer15 har blitt foreslått i fortiden. Spesielt, må system av valget garantere en forbigående levering av SB komponenter uten integrering av viral vektoren. Likevel øker grunnleggende uttrykk for transposase sikkerheten bekymringer på grunn av risken ukontrollerbare rehopping av transposon.
Derfor er transcriptional regulering av SB100X av raffinerte Tet-ON den første utfordringen. En modifisert Tet-responsive promoter, ved å erstatte opprinnelige utviklet minimal cytomegalovirus (CMV) selskapet med minimal arrangøren (-81) av Timidine Kinase (TK) genet Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1)16, er klonet over den SB100X cDNA (pTetOTKSB100X). Den muterte omvendt-tetracycline-transactivator rtTA2s-M217 uttrykkes under kontroll av sterk konstituerende selskapet (phosphoglycerate promoter, PGK) klonet i en annen plasmider (pCCL-PGKrtTA2S-M2). Når lagt til kultur medium, dox binder rtTA2s-M2 modulator og tethers Tet arrangøren komplekse eller, resulterer i strengt regulert induksjon av SB100X uttrykk18.
Den andre store utfordringen oppstår fra den ineffektive transfection av menneskelige primære celler av flere fysiske og kjemiske metoder. Effektivt levere transposase i menneskeceller motstandsdyktig mot transfection, SB100X og rtTA2s-M2 uttrykk kassetter er pakket inn i to integrasjon defekt lentiviral vektorer (IDLVs)19: IDLVTKSB og IDLVrtTA2s- M2. Viral vektorer produseres transiently som tredje generasjon vektorer i HEK293T celler20 og pseudotyped med glykoprotein G av Vescicular stomatitt viruset (VSV-G), som gir et bredt spekter av infeksjon. Vector partikler er konsentrert av ultracentrifugation og titreres med HIV-1 kneble p24 immunocapture. For å transduce linjer og primære celler, vektor partikler er kompleksbundet med polybrene og er ruges med målcellene i tilstedeværelse eller fravær av dox. Narkotikaavhengige aktivering av SB100X uttrykk i transduced celler er målt ved kvantitative RT PCR (qRT-PCR)18.
Når Tet regulert SB100X uttrykk er bevist, følger transponering av GOI (f.eks grønt fluorescerende protein, GFP) i målet cellen genomet molekylære hendelsene tydelig schematized av Bak og Mikkelsen21. En tredje IDLV vektor bærer et uttrykk kassett for GOI klonet mellom T2-transposon IRs (IDLVT2) har bygget og pakket som nevnt ovenfor. Endelig, tre IDLV vektorer kan brukes til å effektivt transduce menneskelige celler (f.eks primære keratinocytter) i vitro og integrere GOI i nærvær av doxycycline18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plasmider ansatt
Merk: Plasmider pCCL-PGKrtTA2S-M2 ble vennlig levert av Prof Zappavigna (Universitetet i Modena og Reggio Emilia, Italia). Den pCMVSB100X plasmider frakter koding sekvensen av hyperaktiv transposase og pT2/BH transposon plasmider fotograferingen av Prof Z. Ivics (Paul Ehrlich Institute, Langen, Tyskland) og Prof Z. Izvak (Max Delbruck senter for molekylær medisin, Berlin, Tyskland).
- For alle kloning i Escherichia Coli (E. coli), følg kloning strategi valg og begrensning enzym prosedyre eller PCR forsterkning av fragment å være klonet.
Merk: Tabell 1 oppsummerer alle plasmider ansatt i denne protokollen. En beskrivelse og referanser for hver plasmider tilbys.
2. viral vektor produksjon
Merk: Alle viral vektorer er produsert i en biohazard hette på BSL2 biosikkerhet containment nivå, institusjonelle reglene og forskriftene.
- Kultur tilhenger HEK293T celler i Dulbeccos endret Eagle Medium supplert med 10% HyClone serum, 100 U/mL penicillin-streptomycin og 2 mM glutamin.
- Dag 0: Forberede fem 15 cm plater/viral forberedelse og frø 5.5x106 celler i 30 mL av mediet.
- Dag 1: hva
- Før du starter transfection, forberede 100 mL 2 x HEPES buffer saltvann (HBS):
NaCl (5 M) 5.6 mL
HEPES (1 M) 10,0 mL
Na2HPO4 (0,5 M) 0,3 mL
Sterilt vann 84.1 mL
Justere pH 7.1 med 37% HCl.
Merk: 2 x HBS kan lagres på 4 ° C. En nøyaktig pH er svært viktig for effektiv transfection. Optimal pH er 7.10 til 7.12. - Fjern middels og legge 22,5 mL/tallerken med fersk middels 4 h før transfection.
- Transfect HEK293T celler med overføring plasmider, pMD.Lg/pRRE.D64VInt emballasje plasmider, pMD2.G konvolutt-koding plasmider og pRSV-Rev (tabell 1) etter følgende beløp/platen:
overføre plasmider 25.00 µg
pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16.25 µg
pMD2.G 8,75 µg
pRSV-Rev 6.25 µg
Merk: Plasmider DNAs er utarbeidet i henhold til CsCl protokollen beskrevet ved Maniatis22 eller en endotoxin-fri plasmider rensing kit.- Resuspend 56.25 µg DNA (blanding av 4 plasmider) i 1.125 mL sterilt vann og tilsett 125 µL av 2.5 M CaCl2 (løsning A).
- Legge til 1.250 mL av 2 x HBS i et sterilt 15 mL konisk sentrifuge rør (løsning B).
- Legge løsningen en (1.250 mL) b (1.250 mL) dropwise mens bobler med en 1 eller 2 mL pipette (transfection løsning, totalt volum 2.500 mL).
- Inkuber for 20 min ved romtemperatur (RT).
- Bruker P1000 brønnene, distribuere alle hva løsningen (2.500 mL) cellen monolayer dropwise.
- Ruge over natten i en celle kultur inkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
- Før du starter transfection, forberede 100 mL 2 x HEPES buffer saltvann (HBS):
- Dag 2: Fjerne mediet og legge til 15 mL av fersk medium (se trinn 2.1).
- Dag 3: Samle og konsentrere lentiviral partikkel inneholder nedbryting.
- Samle nedbryting (~ 70 mL) fra alle (n = 5) transfekterte celle plater, filtrere gjennom en 0,45 µm PESS filter og fylle 2 polyallomer rør (1 tommer x 3,5 tommer) / viral forberedelse.
- Konsentrere vektor partikler av ultracentrifugation 106 000 x g for 2,5 h, på 15 ° C med brems.
- Umiddelbart etter avsluttet ultracentrifugation (for å unngå rørets av pellets i røret), forsiktig hell nedbryting i en beholder som inneholder 10% blekemiddel og avbryte 2 knapt synlig pellets 100 µL av 1 x PBS (1% BSA). Dette er normalt pellet er klar og svært liten. Bruke konsentrert vektoren nylagde eller aliquot og lagre viral forberedelser på-80 ° C.
Forsiktig: Nedbryting inneholder lentiviral partikler som må være bleket grundig før forkaster i farlig biologisk avfall.
- For å sjarmere viral vektor utarbeidelse, bruke en HIV-1 kneble p24 immunocapture kit i henhold til produsentens protokollen.
Merk: For å standardisere viral vektor produksjon, liposomer-baserte reagenser kan brukes. Likevel er viral vektor titer svært avhengig av hva effektivitet og renhet av plasmider DNA.
3. Albin på humane cellelinjer (f.eks HeLa celler)
Merk: HeLa celler er kultivert i Dulbeccos endret Eagle's medium med 10% fosterets kalv serum og 100 U/mL penicillin-streptomycin 2 mM glutamin. Tabell 1 oppsummerer alle vektorer i denne protokollen. En beskrivelse av hver vektor tilbys. Signaltransduksjon HeLa celler kan verifisering av transcriptional regulering av SB transposase i den beste dose kombinasjonen av to IDLV vektorer. Variant av IDLV doser kan være relatert til vektor partikkel titrering og celle måltype.
- Dag 0: Frø 2 x 105 cellene i 3 mL medium for hver brønn av en 6-vel plate. Forberede 4 brønner.
- Dag 1: Signaltransduksjon HeLa celler.
- For hver tilstand, fortynne lentiviral vektorer til et endelig antall 1 mL medium (se merknad ovenfor) i nærvær av 10 μL polybrene (siste konsentrasjon 8 μg/mL):
Fortynning for godt #1: håne transduced celler (negativ kontroll).
Fortynning godt # 2: IDLVTKSB vektor (2600 ng av p24).
Fortynning brønner #3 #4: IDLVTKSB vektor (2600 ng av p24) + IDLVrtTA2s-M2 vektor (9,600 ng av p24). - Fjerner mediet fra hver brønn hvor HeLa celler var belagt på dag 0 og legge lentiviral vektor fortynninger til tilsvarende godt.
- Spinoculate 6-vel platen 754 x g for 45 min 20-25 ° C, og deretter overføre 6-vel platen til en celle kultur inkubator på 37 ° C og 5% CO2.
- Etter 6 h og erstatte middels inneholder vektorer med fersk medium i alle brønnene og legger doxycycline 1 μM i godt #4. Sett platen i en celle kultur inkubator på 37 ° C for 48 timer.
- For hver tilstand, fortynne lentiviral vektorer til et endelig antall 1 mL medium (se merknad ovenfor) i nærvær av 10 μL polybrene (siste konsentrasjon 8 μg/mL):
- Dag 3: Utarbeidelse av cellen pellet for RNA utvinning.
- Før du fjerner celler, kan du forberede en trypsin fungerende løsning (1 x):
2,5% trypsin (10 x) 5.0 mL
500 mM EDTA (siste konsentrasjon = 5 mM) 0,5 mL
1 x PBS 44,5 mL - Varm trypsin fungerende løsning på 37 ° C før bruk. Lagre trypsin fungerende løsning på 4 ° C.
- Fjerne medium og vask celler med 1 x PBS. Legg til 0,5 mL forvarmes 37 ° C trypsin fungerende løsning i hver brønn og ruge på 37 ° C i 7 min (i en celle kultur inkubator).
- Etter inkubasjon, Legg til 0,5 mL serum inneholder middels hver brønn å deaktivere trypsin og samle celler i en sentrifuge rør. Skyll godt når med 3 mL 1 x PBS og sentrifuge celle suspensjon i 5 min 240 x g.
- Vask celler med 5 mL 1 x PBS, sentrifuge for 5 min 240 x g og forkaste nedbryting. Bruke fersk samlet celle pellets eller lagrer på-80 ° C. Totalt RNA ekstraktet pellets utføre semi kvantitative RT PCR (se trinn 6).
- Før du fjerner celler, kan du forberede en trypsin fungerende løsning (1 x):
4. Albin på menneskets primære keratinocytter (f.eks)
Merk: Human primære keratinocytter er seeded på drepende bestrålt 3T3-J2 celler (mater lag)23, en slags gave fra Yan Barrandon (EPFL, Lausanne, Sveits).
- Vokse sveitsiske musen 3T3-J2 celler i Dulbeccos endret Eagle Medium med 10% donor bovin serum og 50 U/mL penicillin-streptomycin 4 mM glutamin (3T3 medium).
- Vokse keratinocytter belagt på drepende bestrålt 3T3-J2 celler i ordningen medium, en Dulbecco endret Eagle Medium og Ham F12 media blanding (3:1) som inneholder fosterets bovin serum (10%), penicillin-streptomycin (1%), glutamin (2%), insulin (5 µg/mL), adenine ( 0,18 mM), hydrocortisone (0,4 µg/mL), kolera gift (0,1 nM), og triiodotyronin (2 nM).
- Dag 0: Frø 3 x 105 drepende bestrålt 3T3-J2 celler, tidligere fortynnet i 3T3 medium til en siste konsentrasjon av 1 X 105 celler/mL, i hver brønn av 6-vel plate. Forberede 9 brønner.
- Dag 1: Albin på primære keratinocytter
Merk: Albin på keratinocytter lar kvantifisering av transcriptional regulering av SB transposase i beste dose kombinasjonen av to IDLV vektorer (ved qRT PCR) og kontrollere integrering av GOI (GFP) i målcellene (ved cytofluorimetric analyse).- Før du fjerner celler, forberede trypsin fungerende løsning:
0,5% trypsin-EDTA (10 x) 5.0 mL
500mM EDTA (siste konsentrasjon = 5 mM) 0,5 mL
1 x PBS 44,5 mL - Varm trypsin fungerende løsning på 37 ° C før bruk. Lagre trypsin fungerende løsning på 4 ° C.
- Hvis du vil koble subconfluent keratinocytter i kultur, fjerne medium, vaske celler med 1 x PBS og legger 1 mL av forvarmes trypsin fungerende løsning i hver brønn. Ruge på 37 ° C i 15 min i celle kultur inkubator.
- Etter inkubasjon, resuspend cellene i en grundig og overføre celle suspensjon slik sentrifuge med 2 mL serum inneholder medium (Hvis mange celler er fremdeles knyttet, Inkuber for en ekstra minutter på 37 ° C). Skyll godt når med 3 mL 1 x PBS eller frisk middels og legge skylling løsning til sentrifuge røret med cellen suspensjon.
- Sentrifuge for 5 min 580 x g og kast nedbryting.
- Vask celler med 5 mL 1 x PBS, sentrifuge for 5 min 580 x g og forkaste nedbryting.
- Fortynn 1.6x105 keratinocytter i 1 mL av ordningen medium, en fortynning for hvert vilkår i et 15-mL polypropylen rør.
- Fortynn lentiviral vektorer i 1 mL av ordningen medium i nærvær av 20 μL polybrene (siste konsentrasjon av 8 µg/mL med siste volum 2 ml):
Fortynninger brønner #1, #2 #3: håne transduced celler (negativ kontroll uten vektorer).
Fortynninger brønner #4, #5: IDLVTKSB vektor (13.000 ng av p24) + IDLVrtTA2s-M2 vektor (48,000 ng av p24).
Fortynninger brønner #6, #7, #8, #9: IDLVTKSB vektor (13.000 ng av p24) + IDLVrtTA2s-M2 vektor (48,000 ng av p24) + IDLVT2 vektor (9,160 ng av p24). - Transduce celler i suspensjon ved å legge til hver lentiviral vektor fortynning (1 mL) til tilsvarende keratinocyte suspensjon (1.6x105 keratinocytter i 1 mL).
- Fjerne mediet fra drepende bestrålt 3T3-J2 celler seeded dag 0 og plate transduced keratinocytter (1.6x105 keratinocytter i 2 mL) på dem. Etter transducing et godt fortsette med neste.
- Inkuber ved 25 ° C i 30 minutter, og deretter overføre cellene til 37 ° C i celle kultur inkubator 6 h.
Merk: Gjør ikke spinoculate primære keratinocytter, levedyktighet og spredning vil bli sterkt berørt. - Etter 6 h og Legg 1 mL av ordningen medium i hver brønn. Legg 1 μM doxycycline (siste konsentrasjon) i brønner #5, #8 og #9. Returnere celler til 37 ° C.
- Før du fjerner celler, forberede trypsin fungerende løsning:
- Dag 2: Erstatt ordningen medium med 3 mL KC medium med 10 ng/mL EGF.
- Dag 3: Trypsinize og vask celler fra brønner #1 og #4 #5 som beskrevet før (se 4.4.1 til 4.4.6). Fryse celle pellets ved-80 ° C trekke ut totalt RNA for qRT PCR analyse (se trinn 7).
- Trypsinize celler fra godt #2 #6 og #8 som beskrevet i trinnene 4.4.1 til 4.4.5 og utføre cytofluorimetric analyser for GFP uttrykk (se trinn 5).
- Holde kulturen fra brønner #3 #7 og #9 for minst 3-4 doublings, tilstrekkelig å fortynne un-integrerte IDLVT2 vektor (5 dager for menneskelig primære keratinocytter belagt på mater lag).
- Dag 6: Ca 5 dager post signaltransduksjon, trypsinize celler (se trinnene 4.4.1 til 4.4.5) fra brønner #3 #7 og #9 utføre cytofluorimetric analyse GFP uttrykk (se trinn 5).
Merk: Eksperiment timing og signaltransduksjon effektivitet er inspirert av primære celle type og variasjon av innsamlede eksemplene.
5. Cytofluorimetric analyse på transduced primære keratinocytter
Merk: En flyt cytometer konfigurert med en blå laser (488 nm), en rød laser (633 nm) og filtre for oppdagelsen av GFP og APC fluorescens er ansatt (se Materialer tabell).
- For å diskriminere keratinocytter fra 3T3-J2 mater lag, etiketten transduced keratinocytter frittliggende dag 3 og dag 6 (se trinn 4.7 og 4,9) med musen monoklonale APC-konjugert anti-materen antistoff.
- Forbered 4 mL farging bufferen for hvert utvalg:
5% FBS 200 ΜL
500 mM EDTA (siste konsentrasjon = 2,5) 20 μL
PBS 1 x 3780 μL - Vask frittliggende celler med 1 mL av flekker buffer. Sentrifuge for 5 min 580 x g og kast nedbryting.
- I et rør for flyt cytometri oppkjøp, resuspend 5 x 104 celler i 100 μL flekker bufferen og legge 2 μL anti-materen antistoff (1:50). Bland godt og ruge i 30 min på isen i mørket.
- 30 min, vaskes med 2 mL flekker buffer. Sentrifuge for 5 min 580 x g og kast nedbryting. Resuspend i 200 μL av flekker buffer.
- Erverve APC og GFP signaler av cytofluorimetric analyse18. GFP+ celle brøkdel av befolkningen APC- -cellen angir transduced keratinocytter.
Merk: Hvis ønskelig, fikse farget prøven før flowcytometri med 2% paraformaldehyde i PBS 1 x og butikk på 4 ° C i mørket før kjøringen.
- Forbered 4 mL farging bufferen for hvert utvalg:
- Analysere flyt cytometri data ved å plotte forholdet mellom andelen GFP+cellene på sluttpunktet (5 dager) og andelen av GFP+celler 2 dager legge transduction, normalisert gjenværende nivå av IDLVT2-transduced celler.
6. semi-kvantitative RT PCR
Merk: Bruk en PCR termisk cycler.
- Pakk ut totalt RNA fra transduced eller kontrollere celler ved hjelp av et RNA rensing kit, ifølge produsentens protokollen.
Merk: Total RNA kan lagres på-80 ° C. - Syntetisere cDNA i en 20 µL reaksjon med 100 ng totale RNA og en revers transkriptase kit, ifølge produsentens protokollen.
Merk: cDNA kan lagres på 20 ° C. - Design primere spesifikke for SB100X, rtTA2s-M2 og GAPDH (en housekeeping gen).
Foreslåtte design:
SB videresende primer: 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3 "
SB reversere primer: 5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3 "
rtTAM2 videresende primer: 5'- GACGACAAGGAAACTCGCTC-3 "
rtTAM2 omvendt primer: 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3 "
GAPDH videresende primer: 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3 "
GAPDH omvendt primer: 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3 - Utføre PCR i et siste reaksjon volum på 50 µL. Spesielt montere i hver PCR tube følgende reaksjon:
cDNA (1:5 fortynning) (fra trinn 6.2) 1.00 µL
Videresende primer (10 µM stock) 1.00 µL
Omvendt primer (10 µM stock) 1.00 µL
dNTPs (10 µM stock) 1.00 µL
Buffer (+ MgCl2) (10 x stock) 5,00 µL
Taq utvalg (5 U/µL stock) 0,25 µL
Sterilt vann 40.75 µL - Bruk følgende program av termisk cycler: 1 syklus ved 95 ° C for 5 min deretter fortsette med 95 ° C for 30 s, 58 ° C for 30 s og 72 ° C for 30 s for 34 sykluser for SB100X, 32 sykluser for rtTA2s-M2 , og 25 sykluser for GAPDH.
- Forberede 1% agarose gel. Oppløse 1 g agarose i 100 mL TBE 1 x (10 x lager fortynnet i sterilt vann), i et beaker eller kolbe. Smelte i mikrobølgeovn, virvlende hvert minutt til agarose er fullstendig oppløst. Cool smeltet agarose til den når ca 50 ° C, og deretter legge 5 µL av ethidium bromide (10 mg/mL stock). Helle smeltet agarose i en samlet gel brett med en kam, av gel casting.
- Last prøver (10 µL hver) på agarose gel og utføre geleelektroforese.
- Eventuelt skaffe gel bilde og utføre densitometric analyse på PCR bandene.
7. kvantitativ RT PCR (qRT-PCR)
Merk: En kommersiell sekvens Detection System er ansatt. PCR primer og 6-carboxyfluorescein (FAM) undersøke for glyceraldehyde 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) er kjøpt kommersielt.
- Hvis retro-transkripsjon, se trinn 6.2.
- Bruk programvare å utforme primere og sonde spesifikke for SB100X.
Foreslåtte design:
SB.2 videresende primer: 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3',
SB.2 omvendt primer: 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3 "
undersøke SB FAM: 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3 " - Utføre sanntid PCR i 96-brønnen plater med et PCR Master Mix og primere + sonde bland, i et siste reaksjon volum på 25 µL. Spesielt kan du vurdere følgende reaksjon for hver brønn:
cDNA (1:10 fortynning i sterilt vann) 1.00 µL
2 x Master Mix 12,50 µL
Primere + 20 x sonde blande 1,25 µL
Sterilt vann 10.25 µL
Merk: Utfør alle reaksjoner i tre eksemplarer. For å hindre pipettering feil, forberede en blanding minst n + 3 reaksjoner (uten cDNA). Aliquot bruker en flerkanals pipette. - Kjøre sanntid PCR bruker følgende program: 1 syklus ved 95 ° C for 10 min da 40 sykluser av 95 ° C for 15 s og 60 ° C i 1 min og hold på 4 ° C.
- Analysere qRT PCR data ved å normalisere den relative uttrykket (RQ verdi) for SB100X til nivået av GAPDH på samme cDNA utvalget av 2-ΔΔCT kvantifiseringen, med typisk dataanalyse programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruke fremgangsmåten presenteres her, tre IDLV vektorer bærer regulert SB komponentene (SB100X, rtTA2S-M2 og T2-GFP transposon) var pakket og brukes til å effektivt levere og tett regulere SB systemet i menneskeceller. Figur 1A viser en plan for i vitro signaltransduksjon HeLa celler, som ble utført for å evaluere transcriptional regulering av SB transposase med beste dose kombinasjon av to IDLV vektorer (rapportert i tabell 2). Transcriptional regulering av SB100X ble målt ved qRT PCR (figur 1B) og plottet som en relativ antallet (RQ) verdi forhold til av-staten (IDLVTKSB alene RQ = 1). I transduced HeLa celler, ble en 8-fold Aktivisering (+ dox) SB100X uttrykk over bakgrunnen (IDLVTKSB) oppnådd. Spesielt cotransduced HeLa celler i fravær av dox viste transposase uttrykk sammenlignes med de av landene, som indikerer en stram kontroll over TetTK promoter av rtTA2s-M2 modulator.
Figur 1: Signaltransduksjon Hela celler for uttrykket av transcriptionally regulert SB transposase gjennomført av IDLV vektorer. (A) en plan for i vitro signaltransduksjon HeLa celler med IDLVs for uttrykk for transposase. (B) qRT PCR analyse av HeLa celler transduced med IDLVTKSB (2600 ng av p24) i nærvær (+) eller fravær (-) av IDLVrtTA2S-M2 (9,600 ng av p24) og 1 µM doxycycline (dox). Den stiplede linjen kobles eksempler viser betydelig forskjellige verdier (*** P < 0.005). Eksperimentet ble gjennomført i tre eksemplarer. Mener S.E.M vises som feilfelt. (Figur endret fra Cocchiarella, F. et al., 201618). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Som et eksempel, figur 2 viser dosen alt eksperimentoppsett nå optimale transcriptional regulering av transposase. HeLa celler ble transduced med økende doser (130 og 260 2600 ng av p24) av IDLVTKSB i kombinasjon med IDLVrtTA2s-M2 (960 og 9.600 ng av p24), i tilstedeværelse eller fravær av dox. Semi kvantitative RT PCR analyse viser tydelig at høye doser av begge IDLVs måtte sterkt induserer SB100X uttrykk. Ulike celle type og variasjoner i viral vektor titrering kan medføre sup optimal SB uttrykk, og vi anbefaler derfor utføre dosering innstillingen eksperimenter.
Figur 2: IDLV dose innstillingen eksperimentet i HeLa celler å definere optimale dosen kombinasjonen av de to IDLVs. Semi kvantitative RT PCR analyse på HeLa celler co transduced med forskjellige doser av IDLVTKSB vektor (130 og 260 2600 ng av p24) i fravær eller tilstedeværelse av IDLVrtTA2s-M2 vektor (960 og 9.600 ng av p24) og dox. GAPDH ble forsterket som en standard. SB100X transposase og rtTA2s-M2 uttrykk er rapportert i alle testede forhold; NC = negativ kontroll. (Figur endret fra Cocchiarella, F. et al., 201618). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Transcriptional regulert SB systemet kan også brukes i primære celler, spesielt i disse cellene motstandsdyktig mot flere transfection metoder, som menneskelige primære keratinocytter. Figur 3 viser en plan for Albin på primære keratinocytter dyrket på drepende bestrålt 3T3-J2 mater lag, med IDLV vektorer bærer regulert SB komponentene i tilstedeværelse eller fravær av dox å indusere SB100X uttrykk.
Figur 3: signaltransduksjon i suspensjon av menneskelig primære keratinocytter med IDLV vektorer for uttrykket av transcriptionally regulert SB transposase og transposon. En plan for i vitro Albin på menneskets primære keratinocytter med IDLVs å uttrykke transcriptionally regulert SB transposase og transposon, med tilstedeværelse eller fravær av 1 µM dox. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
QRT PCR analyse i figur 4A viser at beste dose kombinasjon av transposase og modulator vektorer, rapportert i tabell 2, resulterte i 15-fold aktivering av SB uttrykk over av-staten (-dox). Transponering eksperimentet ble utført i keratinocytter transduced med tre IDLV vektorer (IDLVTKSB, IDLVrtTA2s-M2 og IDLVT2) i tilstedeværelse eller fravær av dox. Uttrykket av den GOI (GFP) beared av T2-transposon, i APC- -rommet ble målt ved flyt cytometer analyse 2 dager etter signaltransduksjon (dpt) og endopoint kultur (5 dager for menneskelig primære keratinocytter). Sluttpunktet er nådd når unintegrated T2-GFP transposon falt til et knapt påvisbare nivå (gjennomsnitt 0,6%) på grunn av celledeling avhengig av fortynning. Figur 4B viser forholdet mellom andelen GFP+ celler i APC- -skuffen på sluttpunktet og 2 dager legge transduction, normalisert til gjenværende nivå av transposon alene. Angir prosentandelen av celler hosting minst 1 eksemplar av den uttrykte GOI stabilt integrert i sine genom, vurdert på 12 prosent for menneskelig primære keratinocytter.
Figur 4: analyse av uttrykk for transposase og GFP i transduced menneskelige primære keratinocytter. (A) qRT PCR analysen på primære keratinocytter transduced med IDLVTKSB og IDLVrtTA2S-M2 i tilstedeværelse eller fravær av 1 µM dox. (B) co Albin på primære keratinocytter med IDLVT2 transposon og IDLVs for transposase uttrykk i tilstedeværelse eller fravær av dox. På y-aksen, % GFP+ celler 5dpt / % GFP+ celler 2 dpt * 100 (mener ± SEM to eksperimenter). ** viser signifikant forskjellige verdier (P < 0,05). (Figur endret fra Cocchiarella, F. et al., 201618). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Plasmider | Beskrivelse | Referanser |
| pCCL-TetOTKSB | Overføre plasmider brukes til å generere IDLVTKSB vektor. Denne plasmider avledet fra pTetOTKSB, etter kloning TetOTKSB i pCCL lentiviral ryggraden. | 18, 20 |
| pCCL-PGKrtTA2S-M2 | Overføre plasmider brukes til å generere IDLVrtTA2s-M2 vektor. | som Prof V. Zappavigna |
| pCCL-T2GFP | Overføre plasmider brukes til å generere IDLVT2 vektor. Denne plasmider avledet fra pT2GFP, etter kloning GFP mellom T2-transposon skattemyndighetene i pCCL lentiviral ryggraden. | 18, 20 |
| pMD.Lg/pRRE.D64VInt | Emballasje plasmider generere IDLV vektor. | 19 |
| pMD2.G | Plasmider koding for VSV-G konvolutt for å generere lentiviral vektor. | 20 |
| pRSV-Rev | Rev plasmider generere lentiviral vektor. | 20 |
| Vector | Beskrivelse | |
| IDLVTKSB | Integrering defekt vektor lentiviral for uttrykket av SB100X under kontroll av Tet-responsive TK promoter. | |
| IDLVrtTA2s-M2 | Integrering defekt lentiviral vektor for uttrykket av rtTA2s-M2 modulator under kontroll PGK formidler. | |
| IDLVT2 | Integrering defekt lentiviral vektor for uttrykket av GOI klonet mellom T2-transposon skattemyndighetene. | |
Tabell 1: plasmider og vektorer ansatt i denne protokollen. Beskrivelser og referanser tilbys.
| Vektorer | HeLa (2 x 105 celler) | Keratinocytter (1.6x105 celler) |
| IDLVTKSB | 2600 ng p24 | 13000 ng p24 |
| IDLVrtTA2s-M2 | 9.600 ng p24 | 48000 ng p24 |
| IDLVT2 | 9,160 ng p24 |
Tabell 2: Optimalisert vektor doser for signaltransduksjon HeLa celler og menneskelige primære keratinocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en allment tilgjengelig metode å integrere stabilt en GOI genomet av målcellene av Tornerose-mediert transponering. Selv om den SB-systemet ble utviklet for å gi en nonviral metode for genomet redigering, er effektiv levering av integrasjon maskiner (transposase og T2 transposon) obligatorisk. Derfor for å bruke SB-systemet på knapt transfectable primære celler, ble en viral levering av SB komponenter forfulgt i årene10,12,15. Men adressert ingen av viral vektorer ansatt til nå spørsmålet om grunnleggende uttrykk for transposase som kan medføre risiko for ukontrollerbare rehopping av transposon.
For å regulere transcriptionally transposase uttrykk, tok vi fordel av en modifisert Tet-ON system16. Minimal TK arrangøren smeltet på Tejo elementet, ved binding til rtTA2s-M2 modulator i nærvær av dox, gitt en finjustering av transposase aktivisering over bakgrunnen (av-stat, i fravær av dox). Regulatoriske ytelsen avhenger av de aktuelle IDLVs (IDLVTKSB og IDLVrtTA2s-M2) vektor dose kombinasjon og celletyper (f.eks HeLa celler og menneskelige primære keratinocytter). Uavhengig av målcellene, vector-dose må sikre høyeste Albin på målet celler uten å påvirke celle levedyktighet, dermed en økende dose-kombinasjon eksperimenter i HeLa celler (eller andre linjer) til å definere optimale doser, ved semi kvantitative RT PCR, anbefales sterkt.
Transposisjon av GOI ble vurdert i primære celler. Menneskets primære keratinocytter seeded på drepende bestrålt 3T3-J2 mater lag var transduced med 3 IDLVs (IDLVTKSB, IDLVrtTA2s-M2 og IDLVT2) på eksperimentelt definerte doser. En klar dox-avhengige aktivering av transposase ble demonstrert av qRT PCR. Videre ble stabil integrering av GOI demonstrert av cytofluorimetric analyse av GFP uttrykk i celler transduced i tilstedeværelse eller fravær av dox, antyder muligheten for å ansette IDLV plattformen bilen transcriptionally regulert SB komponenter til primære cellene og vellykket integrering av en GOI i genomet av målcellene.
De avgjørende skritt i protokollen er IDLV vektor produksjon og Albin på målcellene optimal effektivitet og vektor dose kombinasjon. Lav transfection effektiviteten av HEK293T celler kan føre lav vektor avkastning. Definisjonen av doser av IDLVTKSB og IDLVrtTA2s-M2 er nødvendig for å unngå en ubalanse av Tet-ON-komponenter som kan føre til høy leakiness i fravær av modulator eller lav fold induksjon av TetOTK selskapet på dox behandling. Disse avgjørende skritt kan tas opp av små endringer. For eksempel kan hva protokollen være standardisert med kommersielle transfection reagenser. Signaltransduksjon protokollen bør tilpasses etter celle type interesse, spesielt vurderer om spinoculation øker signaltransduksjon effektivitet uten å påvirke celle levedyktighet. Vektorer og polybrene kan legges til kultur medium for målcellene og erstattet med friske medium etter 6 h eller over natten inkubasjon. Det er også verdt å merke seg at andelen GFP+ celler 5 dager etter at signaltransduksjon kan bli påvirket av bakgrunnen integrering av IDLVs.
En mindre begrensning av denne metoden er at IDLV vektorer er produsert transiently av hva HEK293T celler. Avhengig av vektoren gjentatte doser skal brukes, vektor produksjoner kreves. En andre begrensning knyttet til lengden på GOI, lastekapasitet på IDLV vektoren er ca 8 kb.
I konklusjonen, tillater denne metoden her integrering av en GOI gjennom transcriptionally regulert SB komponenter pakket inn i IDLV vektorer, som, blant de eksisterende metodene for å levere SB, viser et bredt spekter av tropism og høy signaltransduksjon effektivitet. Videre tillater den modifiserte Tet-ON-systemet en transcriptional regulering av SB100X uttrykk, et relevant problem i risikoen for transposon re hopper eller flere serielle transponering hendelser hvis de nødvendige. Mulige anvendelser av denne metoden inkluderer genomet prosjektering av linjer (f.eks HeLa celler, HEK293 celler) å etablere stabil emballasje celler for viral vektorer og integrering av terapeutiske gener i klinisk relevante primære celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Prof Zappavigna, Universitetet i Modena og Reggio Emilia, Italia for å gi oss på pCCL-PGKrtTA2S-M2 plasmider. Vi erkjenner også Prof Z. Ivics (Paul Ehlrich Institute, Langen, Tyskland) og Prof Z. Izvak (Max Delbruck senter for molekylær medisin, Berlin, Tyskland) for pCMVSB100X og pT2/BH plasmider. Dette arbeidet ble støttet av DEBRA internasjonale og italienske Forsvarsdepartementet og forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine | Lonza | BE12-614F | Cell culture medium. |
| HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production. |
| Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml | Lonza | DE17-602E | Reagents for cell culture medium. |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | Reagent for cell culture medium. |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Reagent for HBS 2X preparation. |
| HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline | Lonza | BE17-737E | Reagent for HBS 2X preparation. |
| Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5% | Merck | 106580 | Reagent for HBS 2X preparation. |
| Hydrochloric acid - ACS reagent 37% (HCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | Reagent for HBS 2X preparation. |
| Sterile water for injection | Fresenius Kabi | - | Reagent for HBS 2X preparation. |
| 0.45 µm PESS filter | Whatman | 10462100 | Filters used to remove cell debris from viral supernatant. |
| Polyallomer Beckman tubes | Beckman Coulter | 326823 | Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation. |
| PBS-1X w/o Ca, Mg | Lonza | BE17-516F | Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | (Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension. |
| HIV-1 Gag p24 immunocapture kit | Perkin Elmer | NEK50001KT | Kit for IDLV particle titration. |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | 107689 | Reagent to enhance transduction efficiency. |
| Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg | GIBCO | BE17-160E | Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted). |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | 100938B | AnalaR BDH | Reagent for trypsin working solution preparation. |
| 0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X) | GIBCO | 15400-054 | Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted). |
| Donor Bovine Serum, New Zealand Origin | GIBCO | 16030-074 | Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer). |
| Ham’s F12 media | GIBCO | 21765 | Medium for keratinocytes. |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | Serum for HeLa cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin | GIBCO | 10099-141 | Serum for human primary keratinocyte culture medium. |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Adenine | VWR | 1152-25 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Hydrocortisone | VWR | 3867-1 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T5516 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Human EGF | Austral Biological | GF-010-9 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody | Miltenyi Biotech | 130-096-099 | To label feeder layer. |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | RNA purification kit. |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18080051 | Reverse transcriptase kit. |
| Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP) | Sigma-Aldrich | D7295 | Reagent for semi-quantitative PCR. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | (any) | - | Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR. |
| GoTaq G2 Hot Start Polymerase | Promega | M740B | Taq polymerase. |
| Agarose, for molecular biology | Sigma-Aldrich | A9539 | Reagent for agarose gel electrophoresis. |
| UltraPure TBE Buffer, 10X | Invitrogen | 15581028 | Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O. |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | Reagent for agarose gel electrophoresis. |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D-9891 | drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4304437 | TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe. |
| 15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon Corning | 352096 | Tubes for cell collection and vector dilution preparation. |
| 150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile | Falcon Corning | 353025 | Cell culture dish for viral production. |
| 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile | Falcon Corning | 353046 | Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction. |
| Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 | Tubes for dilution preparation. |
| Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL | Eppendorf | 0030 120.094 | Tubes for dilution preparation. |
| 0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free | (any) | - | Tubes for semi-quantitative PCR. |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystem | 4346906 | 96-well for qRT-PCR. |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap | BD Falcon | 352052 | Tubes for flow cytometry acquisition. |
| Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes) | (any) | - | Pipettes for sterile tissue culture applications. |
| Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes) | (any) | - | Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications. |
| pH meter | (any) | - | Equipment for measurement of HBS 2X pH. |
| PCR Thermal cycler | (any) | - | Equipment for semi-quantitative PCR. |
| Agarose gel electrophoresis equipment | (any) | - | Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR. |
| BD FACS Canto II 2LSR 4/2 | BD | - | Flow cytometer. |
| 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 7900HT | Equipment for qRT-PCR. |
| Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets. | (any) | - | Centrifuge for cell culture processing and spinoculation. |
| Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor | Beckman Coulter | - | Ultracentrifuge for lentiviral particle production. |
| Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid). | |||
| Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction. |
References
- Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
- Maiti, S. N., et al. Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications. J Immunother. 36 (2), 112-123 (2013).
- Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (8), 4787-4796 (2012).
- Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
- Belay, E., et al. Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation. Stem Cells. 28 (10), 1760-1771 (2010).
- Grabundzija, I., et al. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1829-1847 (2013).
- Kues, W. A., et al. Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 124-135 (2013).
- Turchiano, G., et al. Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells. PLoS One. 9 (11), e112712 (2014).
- Jin, Z., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18 (9), 849-856 (2011).
- Latella, M. C., et al. Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes. J Invest Dermatol. 137 (4), 836-844 (2017).
- Zhang, W., et al. Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration. PLoS One. 8 (10), e75344 (2013).
- Zhang, W., et al. Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells. PLoS One. 8 (10), e76771 (2013).
- Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye. J Gene Med. 16 (1-2), 40-53 (2014).
- Galla, M., et al. Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7147-7160 (2011).
- Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Mol Ther. 19 (8), 1499-1510 (2011).
- Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors. Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).
- Urlinger, S., et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (14), 7963-7968 (2000).
- Cocchiarella, F., et al. Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038 (2016).
- Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med. 12 (3), 348-353 (2006).
- Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors. Mob Genet Elements. 1 (2), 139-144 (2011).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A laboratory Manual. , 4th edition, (2012).
- Dellambra, E., et al. Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa. Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).
