Summary
Apresentamos um método combinando dois fotões de imagem para gravar transientes de Ca2 + em dendritos neuronais em fatias cerebral aguda e gravações de células inteiras remendo-braçadeira.
Abstract
Imagem de cálcio (Ca2 +) é uma poderosa ferramenta para investigar a dinâmica spatiotemporal de Ca2 + sinais intracelulares em dendritos neuronais. Flutuações de CA2 + podem ocorrer através de uma variedade de mecanismos intracelulares e membrana e desempenham um papel crucial na indução de plasticidade sináptica e regulação da excitabilidade dendrítica. Portanto, a capacidade de gravar diferentes tipos de Ca2 + sinais em ramificações dendríticas é valiosa para grupos estudando como dendrites integram informações. O advento da microscopia de dois fotões tenha facilitado tais estudos significativamente, resolvendo os problemas inerentes à imagem latente no tecido vivo, tais como a dispersão da luz e Fotodano. Além disso, através da combinação de técnicas eletrofisiológicas convencionais com dois fotões Ca2 + imagem, é possível investigar o local Ca2 + flutuações nos dendritos neuronais em paralelo com as gravações de atividade sináptica em soma. Aqui, descrevemos como usar esse método para estudar a dinâmica do locais transientes de Ca2 + (gatos) em dendritos de interneurônios inibitórios gabaérgica. O método pode ser aplicado também ao estudo dendríticas Ca2 + sinalização em diferentes tipos neuronais em fatias cerebral aguda.
Introduction
A contribuição de um neurônio para atividade da rede é largamente determinada pela natureza dinâmica das entradas sinápticas que recebe. Tradicionalmente, o método predominante de caracterizar a atividade sináptica nos neurônios baseou-se em gravações somática célula inteira remendo-braçadeira de correntes pós-sinápticas evocadas pela estimulação elétrica de axônios de passagem. No entanto, única atividade de sinapses proximalmente localizadas com sinceridade é relatada neste caso1. Além disso, para avaliar os mecanismos específicos de sinapse, gravações de pares de neurônios e de dendrites num local específico têm sido utilizadas para atingir as sinapses de interesse e os mecanismos de integração dendrítica, respectivamente. Um grande avanço no campo da fisiologia sináptica foi alcançado através de um casamento de técnicas ópticas e eletrofisiológicos. Laser de excitação de dois fotões microscopia (2PLSM) em combinação com a imagem latente de Ca2 + e optogenetic ferramentas pode revelar detalhes tremenda da organização dinâmica da atividade sináptica em conexões neuronais específicas em fatias de cérebro em Vitro e na vivo.
Diversas vantagens feitas 2PLSM destacam-se a excitação convencional, um fóton microscopia2: (1) devido a uma natureza não-linear de dois fotões de excitação, a fluorescência é gerada apenas no volume focal, e todos os fótons emitidos representam sinais úteis (sem necessidade de pinhole); (2) comprimentos de onda, usados em 2PLSM, penetram o tecido de dispersão mais eficientemente; Além disso, dispersos fótons são demasiado diluídos para produzir a excitação de dois fotões e fluorescência de fundo; (3) Fotodano e fototoxicidade também são limitados ao plano focal. Portanto, apesar do alto custo dos sistemas 2-fóton em comparação com microscópios confocal convencionais, o 2PLSM continua a ser um método de escolha para investigação de alta resolução da estrutura neuronal e função em tecidos grossos.
A primeira aplicação de 2PLSM em tecido de dispersão foi a imagem da estrutura e função das espinhas dendríticas3. 2PLSM em combinação com Ca2 + imagem latente revelou essa função de espinhos como compartimentos isolados de bioquímicos. Uma vez que em muitos tipos de neurônios, há uma correspondência exacta entre espinhos e sinapses individuais4, dois fotões Ca2 + imagem logo tornou-se uma ferramenta útil, relatando a atividade de sinapses individuais em tecido intacto5, 6,7,8. Além disso, baseada em 2PLSM Ca2 + imagem foi usada com sucesso para monitorar a atividade de canais de cálcio único e as interações não-lineares entre os conductances intrínsecos e sinápticas, bem como para avaliar o estado e atividade-dependente Regulamento de Ca2 + sinalização neuronal dendrites5,6,7,8,9,10,11.
O cálcio é um onipresente segundo mensageiro intracelular, e sua organização spatiotemporal subcellular determina a direção de reações fisiológicas, alterações na força sináptica para a regulação do íon de canais, crescimento dos dentritos e espinha, como bem como morte celular e sobrevivência. Dendríticas Ca2 + elevações ocorrem através da ativação de várias vias. Potenciais de ação (APs), backpropagating para os dendritos, abrir canais de cálcio dependentes de voltagem12 e produzir relativamente globais transientes de Ca2 + (gatos) em dendritos e espinhos13. Transmissão sináptica é associada com a ativação de pós-sináptica Ca2 +-permeáveis receptores (NMDA, Ca2 +-permeável Leandro e agonista), desencadeando sináptica gatos6,14,15. Finalmente, supralinear Ca2 + eventos podem ser gerados em dendritos sob certas condições,11,12,13,16.
Emprega dois fotões Ca2 + imagem em combinação com gravações eletrofisiológicos remendo-braçadeira sintético Ca2 +-sensíveis indicadores fluorescentes, que normalmente são entregues através do eletrodo de remendo durante as gravações de células inteiras . Um método padrão para a quantificação da dinâmica de Ca2 + baseia-se o método de duplo indicador17,18. Ele usa dois fluorophores com espectros de emissão bem separados (por exemplo, uma combinação de um vermelho Ca2 +-tintura insensível com verde Ca2 + indicadores, tais como o Oregon Green BAPTA-1 ou Fluo-4) e tem várias vantagens quando comparado com o método do indicador único. Primeiro, uma Ca2 +-tintura insensível é usado para localizar pequenas estruturas de interesse (ramificações dendríticas e espinhos) onde Ca2 + imagem latente será executada. Em segundo lugar, a relação entre a mudança na fluorescência verde e vermelha (ΔG/R) é calculada como uma medida de [Ca2 +], que é em grande parte insensível às mudanças na fluorescência de base devido a flutuações no [Ca2 +]017 , 18. Além disso, as alterações de fluorescência podem ser calibradas em termos de absoluta Ca2 + concentrações.19.
Uma preocupação geral quando executando dois fotões Ca2 + imagem experimentos em fatias agudas é celular saúde e estabilidade da aquisição imagem devido ao poder do laser alta normalmente usado. Adicionalmente, em Ca2 + imagem as experiências, há preocupação com a perturbação e substancial superestimação da subcellular Ca2 + dinâmica devido ao fato de que indicadores de Ca2 + atuam como altamente móvel exógena Ca2 + buffers. Assim, a escolha do indicador de Ca2 + e sua concentração depende do tipo neuronal, a amplitude prevista de gatos e a questão experimental.
Adaptamos o método de dois fotões Ca2 + imagem para investigação de Ca2 + flutuações de dendrites de gabaérgica interneurônios9,10,11,20,21 , 22. enquanto a maior parte do Ca2 + imagem estudos iniciais foram feitos em neurônios principais, interneurônios inibitórios mostrar uma grande variedade de funcional Ca2 + mecanismos que são distintos daqueles em células piramidais20 , 23 , 24. estes mecanismos específicos de interneurônio (por exemplo, Ca2 + permeável Leandro receptores) podem desempenhar funções específicas na regulação da atividade das células. Enquanto dendríticas Ca2 + sinalização em interneurônios é um alvo tentador para maiores investigações, dois fotões Ca2 + imagem em dendritos dessas células apresenta desafios adicionais, de um diâmetro mais fino de dendrites e falta de espinhos para uma particularmente elevado Ca2 + ligação capacidade endógena. Como nossa pesquisa interessa foco no estudo dos interneurônios hippocampal, o seguinte protocolo, embora aplicáveis a diferentes populações neuronais, foi adaptado para lidar com esses desafios.
Este protocolo foi executado com um microscópio confocal comercial dois fotões, que foi equipado com dois detectores externos, não-descanned (NDDs), electro-ópticos modulador (Moe) e um Dodt digitalização contraste gradiente (SGC) e instalado em uma mesa de óptica. O microscópio foi acoplado com uma Ti:Sapphire do laser do multiphoton modo bloqueado a 800 nm (> 3 W, 140 pulsos fs, taxa de repetência de 80 Hz). O sistema da imagem latente foi equipado com uma plataforma padrão de eletrofisiologia, incluindo uma câmara de perfusão com controle de temperatura, uma plataforma de tradução com dois Micromanipuladores, um amplificador de microeletrodos controlado por computador, um digitador, um estímulo unidade e software de aquisição de dados.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes de bem-estar dos animais do Comitê de proteção Animal de Université Laval e o Conselho canadense no cuidado Animal.
1. preliminar preparação (opcional: Prepare-se 1 dia de antecedência)
- Prepare três tipos de solução artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF) (Normal, sacarose e soluções de recuperação, 1L cada; ver tabela 1). Ajustar a pressão osmótica das soluções para 300 ± 10 mOsm25 e esfriar a ACSF-sacarose até um ponto perto de congelamento (0-4 ° C).
Nota: O uso de uma solução de corte baixo teor de sódio (ACSF-sacarose) ajuda a preservar a viabilidade dos neurônios nas camadas superficiais de fatias aguda26. - Preparar 0,75 mL de remendo-solução contendo um fluoróforo vermelho (por exemplo, Alexa-594) e um indicador de cálcio sintético verde (por exemplo, Oregon Green BAPTA-1; consulte a tabela 1). Incluem biocytin (ver tabela 1) na solução de patch se post hoc identificação morfológica das células gravadas é necessária.
- Ajuste a pressão osmótica da solução de 280 mOsm ± 5 e pH 7,35 ± 0,5. Manter a solução na geladeira ou no gelo em todos os momentos.
Nota: A escolha do indicador de cálcio deve ser baseada na sua gama dinâmica e sobre a natureza dos eventos Ca2 + investigadas. - Usando um extrator de micropipeta, preparar pipetas de remendo de capilares de vidro de borosilicato (ver Tabela de materiais) com uma ponta de 2 µm ≈ (pipeta resistência de MΩ 3-5) e pipetas de estimulação dos capilares de theta-vidro borosilicato (ver tabela de de Materiais) com uma ponta de µm de 2-5.
Nota: As configurações de extrator para pipetas de um determinado diâmetro e forma de fazer serão determinadas pelo tipo de filamento de extrator e os resultados do teste de rampa para um determinado tipo de vidro.
2. hippocampal fatia preparação
- Anestesiar o mouse (P13-20; a tensão e o sexo do rato é determinada pela pergunta experimental a ser tratada) com 1 mL de isoflurano colocado sobre uma toalha de papel dentro de uma câmara de narcose por inalação. Quando o animal é anestesiado profundamente, como evidenciado pela falta de movimento e respiração lenta, removê-lo da câmara de narcose e decapitar usando uma guilhotina.
- Expor o crânio cortando a pele com uma pequena tesoura na parte de trás do crânio ao nariz. Use um pequeno par de osso mini ruginas para fazer um furo no nível do bregma. Em seguida, use a tesoura para fazer um corte de caudal e rostral ao longo da sutura sagital. Com as ruginas Segure a parte de trás de cada crânio e o elevador para cima e para fora para remover o crânio, cobrindo cada hemisfério.
- Depois que o cérebro está completamente exposto, minar os nervos ópticos com uma espátula pequena. Remover o cérebro do crânio e colocá-lo em uma placa de Petri contendo continuamente oxigenado, frio ACSF-sacarose (ver tabela 1 para a concentração de sacarose).
- Se o tecido de ratos mais velhos é necessário, realize uma perfusão intracardíaca usando uma seringa (25G) preenchida com 20 mL de ACSF-sacarose gelada antes da extração do cérebro para obter fatias de boa qualidade.
- Prepare fatias hippocampal do cérebro animal extraído.
- Deixe o frio do cérebro de cerca de 2 min. Coloque um pedaço de papel de filtro em um prato de Petri cheia de gelo, transferir o cérebro para o papel de filtro. Disse os dois hemisférios.
- Cole os hemisférios dissecados (a orientação é determinada pelo objetivo experimental para obter fatias de coronal, horizontal ou transversal) em uma mesa de vibratome e mergulhá-lo na bandeja de vibratome preenchida com gelada oxigenado ACSF-sacarose. Fazer 300 µm fatias grossas a uma temperatura de cerca de 1 ° C, usando um vibratome refrigerador ou colocando o gelo ao redor da bandeja de vibratome.
- Usando um pincel de pintura lisa, acumular as fatias contendo o hipocampo (até 6 fatias por hemisfério) em um banho contendo oxigenado ACSF-recuperação aquecido a 37 ° C.
- Deixe as fatias no banho ACSF-recuperação pelo menos 45 min.
3. células inteiras Patch-clamp gravações
- Definir uma fatia hippocampal no lugar num banho posicionado no âmbito do objectivo (ampliação: 40x, abertura numérica: 0.8) de um microscópio de dois fotões de varredura a laser. Continuamente perfundir o banho com oxigenada Normal ACSF aquecido a 30-32 ° C a uma taxa de 2,5-3 mL/min.
- Use o contraste de interferência diferencial infravermelho (IR-DIC) ou microscopia Dodt-SGC para localizar uma célula de interesse usando o seu tamanho, forma e posição.
Nota: Dependendo da população alvo neurônio, um modelo do rato geneticamente modificado pode ser usado para localizar facilmente as células de interesse. Neste caso, esta etapa pode ser substituída com o uso de uma fonte de luz fluorescente. - Encha uma pipeta de estimulação com uma solução de ACSF Normal contendo o fluoróforo vermelho (por exemplo, Alexa-594).
- Defina a pipeta de estimulação (conectada a uma unidade de estimulação elétrica) em cima da fatia, para que a ponta é na mesma região que a célula de interesse.
- Depois de encher a pipeta de remendo com solução de remendo e anexá-lo a um estágio de cabeça, configurá-lo sobre a fatia para que sua ponta está diretamente acima da célula de interesse.
- Caber uma seringa em uma torneira de três vias e conectá-lo ao remendo-pipeta através do tubo de plástico. Injetar constante pressão positiva dentro da pipeta de remendo (≈ 0,1 mL) utilizando a seringa. Manter a torneira na posição de "fechar".
- Ativar o módulo de software de controle do amplificador e alternar para o modo de tensão-braçadeira, clicando no botão "VC". Abra o software de aquisição de dados de eletrofisiologia (por exemplo, clampex) para aquisição de sinais eletrofisiológicos e clique no ícone do "Teste de membrana" para tê-lo continuamente enviar um pulso de tensão quadrada (5 mV, 10 ms), que é necessário para monitorar alterações na resistência a pipeta.
- Baixe a pipeta de remendo até que é bem em cima da célula alvo. Após fazer contato com a membrana celular, retire a pressão rodando a torneira na posição "aberta".
Nota: O contato com a membrana celular é detectado quando um pequeno aumento na resistência a pipeta (≈ 0,2 MΩ) é visto e um pequeno recuo na célula é causado por pressão positiva. - Exercendo uma ligeira pressão negativa para a pipeta de remendo usando uma seringa vazia encaixar a torneira até que a resistência de pipeta fornecida pelo software atinja 1 GΩ. Na janela 'Teste de membrana' do software de aquisição de dados, fixar a célula a -60 mV.
- Continue a aplicar a pressão negativa, até que a célula é aberta e a configuração de célula inteira é alcançada. Deteção deste estado de célula baseia-se se a mudança repentina da resistência de pipeta (a partir de 1 GΩ para MΩ 70-500, dependendo do tipo de interneurônio) e o aparecimento de grandes capacitivos transientes na janela 'Teste de membrana'.
4. dois fotões Ca2 + imagens
- Se estiver interessado nas respostas pós-sinápticos excitatórias, adicionar o gabazine de bloqueador do receptor de GABAA (10 µM) e o bloqueador do receptor GABAB CGP55845 (2 µM) no banho ACSF.
- No módulo de software de controle de amplificador, definir a configuração de remendo para corrente-braçadeira, clicando no botão "CC" e gravar o padrão de disparo da célula em resposta às injeções somáticas de despolarizar corrente (0.8-1.0 at, 1 s). Aguarde pelo menos 30 min para a célula a ser preenchido com os indicadores presentes na solução remendo.
Nota: O padrão de queima e ativas Propriedades da célula podem ser usadas para identificar o subtipo da célula; por exemplo, células de rápido-cravação. É importante para a concentração do indicador estabilizar através da difusão antes de começar a gravar gatos (ver tabela 2 para solução de problemas). - AP-evocada gatos
- Usando o software de aquisição de imagem, começa a aquisição de imagens. Localize um dendrito de interesse usando o sinal de fluorescência vermelha. Para garantir uma resposta visível, em primeiro lugar, escolha um dendrite proximal (≤ 50 µm) como a eficiência de retropropagação AP pode declinar significativamente com a distância em gabaérgica interneurônios22.
- Usando a ferramenta' retangular' do software de aquisição de imagem, zoom sobre a região de destino e mudar para o "xt" modo (linha). Posicione a verificação através do ramo dendrítica de interesse. Com os controladores de intensidade do laser do software de aquisição, definido o laser dois fotões em um nível mínimo de energia onde a fluorescência de base verde é apenas ligeiramente visível, para evitar a fototoxicidade.
- O eletrofisiologia dados software de aquisição de software de aquisição de imagem e a janela de 'Protocolo', crie um gravação de julgamento a duração desejada, contendo uma injeção atual somática da amplitude desejada.
- Usando o software de aquisição de imagem, clique no botão "Começar a gravar" e adquirir a fluorescência continuamente por 1-2 s. repetir a aquisição de imagem 3 - 10 vezes. Espere pelo menos 30 s entre as varreduras única para evitar Fotodano. Se adquirir a linescans em vários pontos ao longo de um dendrite, levá-los em ordem aleatória para evitar efeitos de ordem.
- Gatos synaptically evocada
- Localize um dendrito de interesse usando o sinal de fluorescência vermelha.
- Defina a pipeta de estimulação na superfície da fatia acima o dendrito de interesse. Abaixe lentamente a pipeta de estimulação no lugar, minimizando o movimento para evitar perturbar a configuração de células inteiras. Posição da pipeta em 10-15 µm do dendrito.
- Para visualizar a localização do microdomains sináptica em aspiny dendrites, do software de aquisição de imagem, mude para o 'xt' (linha) modo e posicionar a linha ao longo do ramo dendrítica de interesse.
- Na janela de 'Protocolo' (do software de aquisição de dados de eletrofisiologia) e software de aquisição de imagem, crie um julgamento de gravação que aciona a unidade de estimulação após o início do julgamento.
- Usando o software de aquisição, clique no botão "Começar a gravar" a varredura ao longo do dendrito continuamente para aquisição de repetição s. 1-2 3 - 5 vezes, esperando 30 s entre as varreduras para evitar Fotodano.
Nota: O comprimento do scan pode ser ajustado dependendo da cinética do evento evocado, mas deve ser minimizado para evitar Fotodano (ver tabela 2 para solução de problemas). - Repita a etapa 4.5.5 em condições diferentes (por exemplo, diferente intensidade/comprimento de estimulação, a introdução de um bloqueador farmacológico, etc) dependendo da pergunta específica a ser tratada.
- Impedir a aquisição quando a célula mostra sinais de deterioração da saúde: despolarização abaixo -45 mV, aumento da linha de base Ca2 + nível, deterioração morfológica de dendrites (por exemplo, blebbing, fragmentação; ver tabela 2 para solução de problemas).
- Para obter informações preliminares sobre a morfologia da célula e manter um registro da localização da pipeta estimulação, adquira uma Z -pilha da célula no canal vermelho. Usando o software de aquisição de 'xyz' modo, definir os limites superior e inferior da pilha para toda a célula de imagem com todos os processos incluídos. Definir o tamanho do passo do' ' em 1 µm e iniciar a aquisição de pilha usando o botão "Iniciar gravação".
- Quando o Z-aquisição de pilha está completa, use a opção de "Projeção máxima" no software para sobrepor todos os planos focais da pilha e verificar a qualidade da aquisição. Em seguida, retraia lentamente a pipeta de remendo fora a fatia.
- Para corrigir a fatia para identificação morfológica post hoc , rapidamente retirar a fatia do banho usando um pincel de pintura lisa e coloque-a entre dois papéis de filtro, em um prato de Petri ACSF-cheia. Substituir o ACSF com uma solução de paraformaldeído (PFA) 4% e deixe o prato em uma sala de 4 ° C ou a geladeira durante a noite.
5. imuno-histoquímica para Post Hoc identificação morfológica das células gravadas
Nota: Depois de 1 noite de fixação em PFA, a fatia pode ser armazenada em tampão fosfato (PB) com azida de sódio (0,5%) até 1 mês.
- Coloque a fatia em tampão Tris solução salina (TBS) com Triton X-100 (0,3%) e executar 4 lavagens (5-10 min cada).
- Coloque a fatia na TBS-Triton 0,3% com 10% de soro de cabra normal (NGS) por 1h.
- Coloque a fatia na TBS-Triton 0,3% com 1% NGS e um fluoróforo estreptavidina conjugada (por exemplo, estreptavidina conjugada com Alexa Fluor 546, 1: 200) para incubação de noite.
- Lave 4 vezes (5-10 min) na TBS.
- Monte as fatias em corrediças do microscópio e imagem usando um microscópio confocal. Para ter uma reconstrução celular completa, adquirir um Z-pilha (passo tamanho: 1 µm) usando um objectivo de 20x. Para um rótulo de Alexa 546-conjugados de imagem, uso de um laser de 543 nm e uma detecção de nm 515-560 filtro definido.
6. análise dos gatos
- Extrair os valores de fluorescência, de regiões de interesse (ROIs) nas imagens de linha dos canais vermelhos e verdes e média os valores das várias repetições para cada condição reduzir o ruído.
Nota: Quando a aquisição de linha é executada ao longo do dendrito, é possível extrair dados de ROIs múltiplos, que podem corresponder a microdomains dendríticas (2-5 µm), e assim permitindo o estudo de Ca2 + sinal compartimentação. - Para cada ROI, expressa as mudanças de Ca2 + amplitude como:
Nota: Aqui G é o valor de fluorescência do canal verde; G0 é o valor de fluorescência de base do canal verde durante o período de pré-estimulação; R é o valor de fluorescência do canal vermelho18. Como dois fotões excitação é altamente localizada e não gera um significativo fundo, subtração de fluorescência de fundo não é necessária.
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Representative Results
Usando o protocolo aqui apresentado, obtivemos gatos evocados por injeção atual somática e por estimulação elétrica em dendritos de oriens/alveus interneurônios na área CA1 do hipocampo. Depois de remendar um neurônio, identificado com base em sua forma e posição, adquirimos linescans através de um dendrite proximal em vários pontos no dado as distâncias do soma (figura 1A). Observamos uma diminuição da amplitude dos gatos induzido por backpropagating APs como a distância entre o soma aumentada (indicativo de reduzida amplitude de AP ou um declínio de distância-dependente na distribuição de canais de cálcio, figura 1B). Depois de imuno-histoquímica (usando estreptavidina conjugada Alexa Fluor 546), fomos capazes de recuperar a rotulagem biocytin da célula e identificar o neurônio gravado como uma célula de bistratified com um axônio ocupando estrato oriens e estrato radiatum (Figura 1 C). no segundo experimento, uma pipeta de estimulação foi levada a um site dendrítica distal. Verificação ao longo do dendrito, então fomos capazes de avaliar a amplitude dos pós-sináptica Ca2 + sinais num determinado ramo dendrítica (Figura 2A–C) em resposta à estimulação elétrica de axônios de passagem. Os gatos pós-sináptica diferiam entre vizinhos microdomains dendríticas (segmento de 1 a 6; Figura 2D), que pode ser associado com um spread de Ca2 + sinal da zona de iniciação e/ou diferentes mecanismos pós-sinápticos envolvidos.
Figura 1: Exemplo representativo de transientes de AP-evocada Ca2 +.. . Máximo (A) projeção de um de dois fotões Z-pilha (13 µm) de um interneurônio remendado cheio de Alexa-594 (20 µM). Linhas brancas indicam a localização e a extensão do linescans. (B) traços mostrando os gatos suscitou nos locais mostrados no rastreamento de r. Top mostra curto trem AP gerado através de injeção atual somática durante a gravação de julgamento. Escala de tempo é o mesmo em todos os traços mostrados. Máximo (C) projeção de um confocal Z-pilha mostrando o biocytin de rotulagem da célula. O/A: Oriens/Alveus; PYR: Estrato Pyramidale; RAD: Stratum Radiatum. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Pós-sináptica Ca2 + transientes evocados por uma explosão de estimulação elétrica (3 estímulos a 100 Hz). Máximo (A) projeção de um de dois fotões Z-pilha (148 µm) mostrando um interneurônio remendado cheio de Alexa-594. Pontas de seta brancas apontam para o local de terminais axonal dentro da camada piramidal, sugerindo que o interneurônio é uma célula de cesta. (B) plano focal único ilustrando a ramificação dendrítica onde o eletrodo de estimulação foi posicionado. Linha tracejada mostra a localização da linha mostrada na (C1 e C2). (C) imagens ilustrando o resultado de uma linha de vermelho (1; Alexa-594; 20 µM) e verde (2; Oregon Green Bapta-5N; Canais de 300 µM). As imagens foram guardadas em segmentos menores para analisar a propagação da resposta mais de 30 µm. (D) traços mostrando as transientes de Ca2 + (gatos) suscitou nos segmentos exibidos em C2. Top rastreamento mostra a resposta de tensão para estimulação elétrica registada a nível somático durante o julgamento de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução | Componente de | Concentração (mM) |
| ACSF-Normal | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 2 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glicose | 10 | |
| CaCl2 | 2 | |
| ACSF-recuperação | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 3 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glicose | 10 | |
| CaCl2 | 1 | |
| ACSF-sacarose | KCl | 2 |
| NaH2PO4 | 1.25 | |
| MgSO4 | 7 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glicose | 10 | |
| Sacarose | 219 | |
| CaCl2 | 1 | |
| K+-Patch solução baseada em | K+- gluconato | 130 |
| HEPES | 10 | |
| MgCl2 | 2 | |
| Sal de phosphocreatin di (tris) | 10 | |
| ATP-Tris | 2 | |
| GTP-Tris | 0.2 | |
| Biocytin | 72 | |
| Alexa-594 | 0.02 | |
| Oregon Green-BAPTA-1 | 0.2 |
Tabela 1: receitas solução. Compostos e concentrações para soluções utilizadas durante o protocolo.
| Problema | Solução |
| Não é possível corrigir o neurônio saudável | Verificação de sinais que as fatias são insalubres: encolhidas ou inchados, células, núcleos visíveis, etc. Em caso afirmativo, descarte as fatias. Também verifique se a resistência de remendo-pipeta e osmolalidade da solução-remendo; substituí-los se os valores não estiverem no intervalo adequado. |
| Sinal de fluorescência de dendrites é baixa | Espere mais tempo para preencher a célula. Se uma obstrução impede a remendo-solução de difusão para a célula, tente aplicar uma pequena quantidade de pressão negativa no remendo-pipeta. |
| Estimulação elétrica não é evocar uma resposta de Ca2 + | Verificar a presença de um artefato eletrofisiológicos na gravação. Se ausente, cheque para um curto-circuito/estimulando o mau funcionamento da unidade. Se estiver presente, aumentar a intensidade de estimulação ou mover a pipeta de estimulação mais perto para o dendrito. É de notar que a distância entre os eletrodos de estimulação e o dendrito não deve exceder 8 hum para impedir a despolarização direta de dendrites quando estudar Respostas sinápticas. |
| Evocado Ca2 + sinal é muito alta/satura o Ca2 + indicador | Reduza a potência do laser. Se o problema persistir em várias células, usar um indicador de diferentes Ca2 +, com uma menor afinidade Ca2 +. |
| Sinal de linha de base Ca2 + está aumentando gradualmente durante o experimento | Espere por um período mais longo entre as varreduras individuais. Se a linha de base ainda está aumentando, pare... aquisição; indica que a saúde da célula provavelmente está caindo. |
| Diminui a amplitude do sinal de Ca2 + durante as varreduras | Reduzir a potência do laser ou diminuir o zoom (se aplicável). |
| Dendrito está se fragmentando ("blebbing") após a digitalização | Reduzir a potência do laser ou diminuir o zoom. Se blebbing é limitado para o dendrito alvo, escolher outro dendrito e reduzir a potência do laser / diminuir o zoom. Se múltiplos dendritos são blebbing, pare de aquisição. |
| Sinais de fluorescência são "à deriva" fora da linha de varredura após varreduras | Reduza o movimento na fatia, reduzindo a velocidade de perfusão ACSF. Antes de remendar, fazer Tenho certeza que a fatia é fortemente fixada no lugar por uma rede. |
Tabela 2: tabela de resolução de problemas. Soluções para problemas comuns que podem surgir durante uma Ca2 + experiência de imagem.
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Discussion
O método mostrado aqui demonstra como a combinação de dois fotões Ca2 + imagem e Eletrofisiologia do remendo-braçadeira pode ser usada para estudar dendríticas Ca2 + sinalização nos dendritos neuronais em fatias cerebral aguda. Esse método permite o monitoramento de ambos as locais Ca2 + elevações evocadas pela AP elétrica de estimulação ou backpropagating em segmentos dendríticas e resposta somática da célula. Isso torna uma excelente ferramenta para estudar como várias partes da árvore dendrítica integram entradas e comunicar-se com o soma. Mas, dada a duração da experiência, atenção especial precisa ser pago para a saúde celular, limitando o uso do poder do laser de imagem a fim de evitar o Fotodano dos dendritos. Isto pode ser também conseguido diminuindo o nível de zoom, diminuir a duração da varredura e aumentando a velocidade de varredura durante a aquisição de imagens. Imagem latente dendrites interneurônio apresenta desafios adicionais. Como dendrites dessas células têm sem espinhos, varredura ao longo o dendrito é recomendado para facilitar a localização de Ca2 + microdomains pós-sináptica. Além disso, tendo em conta uma alta Ca2 + ligação capacidade endógena, Ca2 + elevações em dendritos interneurônio são menores e mais lento do que aqueles gerados nos dendritos das células piramidais. Isso requer a aquisição de várias imagens de linha para uma média assim como uma duração suficientemente longa de linescans individuais a fim de descrever a cinética de Ca2 + sinal adequadamente.
Estimulação elétrica local utilizando eletrodo bipolar theta-vidro representa uma ferramenta útil para a caracterização da dendrítica pós-sináptica Ca2 + microdomains. No entanto, ele ainda pode ativar diferentes "en passant" axônios localizados em uma determinada região. Neste caso, o número de entradas ativado é desconhecido e pode apenas ser estimado usando ferramentas computacionais adicionais. Dois fotões glutamato uncaging27, que permite a estimulação simultânea de múltiplas sinapses individuais, representa uma boa alternativa para suscitar dendríticas Ca2 + respostas locais. Este método é amplamente utilizado para o estudo das células principais, que claramente definidos estruturas pós-sináptico excitatórias (espinhas), mas não é adequado para o estudo dos interneurônios, que em geral têm uma densidade de baixo da coluna. Uncaging glutamato ao longo do dendrito interneurônio como é aplicado a células principais inevitavelmente activaria múltiplos mecanismos extrasynaptic de Ca2 + sinalização9,10, tornando difícil de interpretar o observações.
Na última década, os avanços em tecnologias ópticas ofereceram melhor resolução temporal para dois fotões Ca2 + tratamento de imagens. Uma das mais promissoras é a microscopia de acesso aleatório (rampa) por meio de defletores Acusto-óptica (AODs)28,29. Ao contrário de convencional raster digitalização, rampa verifica selecionados pontos turísticos em alta frequência, que é ativada pela rápida velocidade de AODs livre de inércia. É ideal para o estudo simultâneo de várias ramificações dendríticas, como não é limitado às questões dispostas em um padrão linear. No entanto, a maior resolução temporal oferecida pelo nível pode ser desnecessária quando imagem Ca2 + eventos durando centenas de milissegundos no mesmo plano focal. Além disso, a localização dos pontos dentro da mesma estrutura de interesse de digitalização pode ser difícil de controlar devido a micro-drifts na fatia preparações associadas com uma taxa de perfusão elevada, que é necessária para fatia de boa qualidade. Portanto, o método de aquisição baseada em linha de alta resolução temporal (500-700 Hz) apresentado neste artigo é ainda preferível quando Ca2 + sinais em ramificações dendríticas individuais de imagem.
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Disclosures
Os autores têm sem concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de institutos canadenses de pesquisa em saúde, ciências naturais e pesquisa de engenharia (NSERC Discovery Grant) e a Fundação de Savoy. OC foi apoiado por uma bolsa de doutorado do NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Strain: Mouse CD1 | Charles River | 022 | |
| Isoflurane | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
| CGP 55845 hydrochloride | Abcam | ab120337 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
| SR95531 (Gabazine) | Abcam | ab120042 | |
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris |
Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosine (GTP)-Na+ |
Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 |
ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Phosphocreatine di(tris) salt |
Sigma-Aldrich | P1937 | |
Streptavidin-conjugated Alexa-546 |
ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Patch Borosilicate Glass Capillaries |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Theta Borosilicate Glass Capillaries |
Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller |
Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope |
Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser |
Coherent | ||
| LAS AF Imaging Acquisition Software | Leica Microsystems | ||
Temperature Controller TC-324B |
Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplifier |
Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer |
Molecular Devices | ||
Confocal Translator |
Siskiyou | ||
Micromanipulator |
Siskiyou | ||
pClamp Data Acquisition Software |
Molecular Devices | ||
A365 Constant Current Stimulus Isolator |
World Precision Instruments | ||
Vibraplane Optical Table |
Kinetic Systems |
References
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