Summary
Aquí, presentamos un protocolo para evaluar el efecto de péptidos sobre la migración de células epiteliales bronquiales. Este método permite la obtención de datos cuantitativos sobre la velocidad de cierre herida de migración celular rápida y altamente reproducible.
Abstract
El objetivo de este trabajo es mostrar un nuevo método para evaluar la capacidad de algunas moléculas inmunomoduladoras, como péptidos antimicrobianos (AMPs), para estimular la migración celular. Lo importante, migración celular es un evento de limitación de velocidad durante el proceso de cicatrización para restablecer la integridad y la función normal de las capas de tejido después de la lesión. La ventaja de este método sobre el análisis clásico, que se basa en un rasguño hecho manualmente en una monocapa de células, es que el uso de la cultura de silicona especial inserta proporcionando dos compartimientos para crear un campo de pseudo-herido libre con un ancho bien definido (500 μm ). Además, debido a una plataforma de análisis de imagen automatizado, es posible obtener rápidamente datos cuantitativos sobre la velocidad de la herida cierre y migración celular. Más precisamente, se mostrará el efecto de dos amplificadores de piel de rana en la migración de células epiteliales bronquiales. Además, el tratamiento previo de estas células con inhibidores específicos proporcionará información sobre los mecanismos moleculares subyacentes a este tipo de eventos.
Introduction
En gran parte es conocido que la cicatrización de heridas en los animales es un proceso fundamental para restablecer la integridad y la función normal de las capas de tejido después de la lesión1. A pesar de superficies epiteliales expuestas al medio externo (por ejemplo, la piel, vías respiratoria y tracto gastrointestinal) forman una barrera protectora de insultos físicos y químicos, la formación de heridas puede ocurrir fácilmente, especialmente después cirugía o infecciones microbianas2. Por ejemplo, la colonización del tejido pulmonar por el bacteriano patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa, sobre todo en enfermos de fibrosis quística (FQ), lleva a daño del epitelio de las vías aéreas con la consecuente insuficiencia respiratoria3, 4. La cicatrización es un mecanismo de reparación de host complejo para restaurar la arquitectura normal de un tejido lesionado5. Se caracteriza por la inflamación inicial, seguida de un período de regeneración abarca epithelialization, angiogénesis y remodelación tisular con la producción de colágeno y de la célula diferenciación6,7,8 . Para asegurar la integridad epitelial y para controlar la proliferación microbiana, todos los organismos vivos producen moléculas de defensa, incluyendo péptidos antimicrobianos (AMPs)9,10. El proceso de cicatrización es muy difícil simular en vitro debido a la falta de restos celulares y las interacciones complejas entre diferentes tipos de células. Sin embargo, la capacidad en vitro de un péptido para acelerar el cierre de una herida pseudo estimulando la migración de células epiteliales es indicativa de su capacidad para sanar un epitelio comprometido. De hecho, migración celular es un evento de limitación de velocidad en la cicatrización de heridas, y estudiar los factores que pueden afectar la migración celular ayudará a terapias objetivo para mejorar la cicatrización.
Aquí, un ensayo experimental altamente reproducible se proporciona basado en silicona especial cultura insertos para evaluar la migración de células in vitro. Se basa en la creación de un espacio μm 500 (pseudo-herida) sobre una monocapa celular confluente. Las células en el borde del campo artificial "herido" comenzará a migrar a la zona libre de células, formando nuevos contactos célula-célula. La inserción de la cultura representa una nueva herramienta para experimentos de cicatrización rápida. Se proporcionan dos depósitos separados por una pared μm 500, y pueden ser colocados correctamente en una placa de 3 cm plato o en el pozo de una placa de 12 pozos. Llena cada compartimiento del parte movible con una suspensión permite a las células crecer en cada área designada hasta confluencia, mientras que la extracción del inserto generará un espacio libre de células de aproximadamente 500 μm (el mismo ancho que el muro de separación). Un medio de cultivo celular adecuada complementado con un compuesto de prueba puede añadirse al plato placa/bien. Luego, el cierre de la brecha puede ser visualizado en diferentes intervalos de tiempo bajo un microscopio invertido, preferiblemente uno equipado con una cámara de vídeo para la adquisición de la imagen. Por último, medición de los cambios en el área de célula cubierta por el programa de análisis de imagen automatizado basado en web permite la cuantificación de la velocidad de la herida cierre y migración celular. En general, este método es un paso adelante en relación con el análisis clásico, donde un cero se hizo manualmente mediante la incisión de monocapas confluentes de células con una aguja estéril o pipeta tip11. De hecho, el último procedimiento puede destruir el plástico inferior del plato placa/pozo y el revestimiento de la superficie, creando arrugas. Además, el área de "herido" no tiene un ancho bien definido a lo largo de toda la longitud de la brecha, como esto depende altamente de la presión aplicada por los investigadores a la punta de aguja. Además, las células desalojadas pueden formar cúmulos de células vivas y muertas en los bordes del scratch; por otra parte, la propagación de las células vivas en el área de "herido" puede interferir con la velocidad de migración de la célula, generando resultados no reproducibles12.
Además, gracias a una plataforma de análisis de imagen cero, los usuarios pueden rápidamente recibir (en minutos) datos cuantitativos sobre el comportamiento migratorio de las celdas seleccionadas sin necesidad de adquirir software adicional. Esta plataforma es capaz de analizar imágenes de microscopía de contraste de fase de baja (~ 5 X), mediana (~ 10 X) y aumento alto (~ 20 X). Después de subir un archivo zip de imágenes (*.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, formato *.tiff) automáticamente se realizaron el análisis para generar un archivo de resumen que muestra el porcentaje de zonas cubiertas de células y zonas cero, así como la velocidad de la célula migración, a intervalos de tiempo distintos.
En este trabajo, mediante el uso de un amplificador-derivado de la piel de rana, es decir, Esc(1-21) y su diastereomer Esc(1-21) - 1 c13y una línea de células bronquiales expresando el funcional CF conductancia transmembrana (CFTR) del regulador14,15, se proporciona un ejemplo de la migración celular inducida por el péptido en comparación con las muestras sin tratamiento (control). Tenga en cuenta que el epitelio de las vías respiratorias y el CFTR desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la función pulmonar y16de la reparación de la herida. Además, mediante inhibidores selectivos (por ejemplo, AG1478)17 de receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE), evidencia que la migración de las células bronquiales inducida por los péptidos mencionados implica activación de EGFR12, 18 se divulga.
En Resumen, el objetivo de este procedimiento es mostrar cómo el uso de estos rellenos de silicona cultura representa un ensayo rápido y de fácil acceso para determinar con precisión la migración de células adherentes (p. ej., células epiteliales bronquiales) y molecular mecanismos que controlan este tipo de eventos.
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Protocol
1. preparación de la célula
- Semilla de 2.5x106 células en 10 mL del mínimo esencial Medium (MEM) suplementado con glutamina 2 mM (MEMg), más 10% de suero bovino fetal (FBS), antibióticos (0,1 mg/mL de penicilina y estreptomicina) y puromicina (0,5 μg/mL para la selección y mantenimiento de la línea de la célula) en un matraz T75. Incube el frasco a 37 ° C y 5% de CO2 durante 2 días. Antes de comenzar el experimento, comprobar la confluencia de las células bajo un microscopio invertido.
Nota: Las células utilizadas para el experimento son las células epiteliales bronquiales humanas inmortalizadas transduced con un vector lentivirales que confiere resistencia a puromicina. Estable expresan CFTR funcional14,15. - Una vez alcanzada la confluencia de las células 90-100%, Aspire el medio del frasco y deséchela en una botella de residuos bajo una clase gabinete de seguridad biológica II. Lavar las células con 6 mL de tampón fosfato salino sin calcio y magnesio (CMF-PBS). Suavemente el matraz de la roca manualmente y deseche CMF-PBS.
Nota: Tenga cuidado de no tocar la monocapa de células con la pipeta. - Añadir 10 mL de PBS de CMF e Incube el frasco a 37 ° C y 5% de CO2 durante 10 minutos.
- Aspire CMF-PBS y deséchela. Luego agregar 2 mL de tripsina/EDTA al matraz.
- Muévalo suavemente el matraz, permitiendo que la solución completamente las células de la capa, y se Incube el frasco a 37 ° C y 5% de CO2 durante 10 minutos hasta que las células son separadas visiblemente bajo el microscopio.
Nota: Al final de la incubación, las células deben aparecen redondeados y no adheridos a la superficie de plástico. Si las células no están bien separadas, agitación manual puede ser necesario. - Añadir 10 mL de MEMg plus 10% FBS para inactivar tripsina y recoger las células por el fondo del matraz de lavado. Transferir el volumen a un tubo cónico de 50 mL.
- Centrifugar el tubo durante 5 minutos a 80 x g.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 6 mL de MEMg plus 10% FBS. Pipeta varias veces para dispersar cualquier grumos.
- Extraiga 10 μl de suspensión celular con una micropipeta e inyectar el volumen bajo la cubierta de vidrio puesto anteriormente sobre una cámara de Bürker, Neubauer.
- Contar el número de celular.
2. siembra en el cultivo de célula inserta
- En cada pocillo de una placa de 12 pozos, transferencia de la inserción de la cultura con una pinza estéril (figura 1). Use pinzas para presionar a lo largo de los bordes de insertos para fijar a la superficie de la placa.
Nota: Los insertos tienen un superficie inferior pegajoso que permite la adherencia.
Figura 1 : Representación esquemática de los insertos de silicona cultura, bien poner en pocillos de una placa de la pozo 12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Diluir correctamente la suspensión celular en MEMg plus 10% FBS. Llene cada compartimento del parte movible con 70 μl de suspensión celular (aproximadamente 3.5x104 células/cámara).
Nota: La densidad de células en cada compartimiento depende del tipo de células. Se recomienda utilizar una densidad celular que conduce a completar la confluencia dentro de 24 h. - Bajo el microscopio, comprobar que las células no son fugas de los compartimentos de insertar e incuban la placa de la pozo de 12 por 24 h a 37 ° C y 5% CO2.
3. pseudo-herida curativo ensayo
- Después de la incubación visualizar las células bajo el microscopio invertido para verificar que se han formado las monocapas confluentes de células.
- Vuelva a suspender los compuestos de prueba (e.g., amperios) en 1 mL de MEMg.
Nota: Preparar frescas diluciones de AMPs a partir de la solución stock almacenada a-20 ° C. - Suavemente Quite los insertos pinzas estériles. Tenga cuidado de no romper las monocapas de células. La transferencia de los rellenos sobre papel absorbente.
Nota: Para volver a usar los insertos de la misma, esterilizarlas en etanol al 70% durante al menos 3 horas. Se recomienda desecharlos luego. - Para eliminar las células no adherentes, añadir 1 mL de MEMg por bien utilizando una micropipeta. Cerrar la placa y suavemente la roca.
Nota: No agregue medio directamente sobre monocapas de células para evitar su interrupción. - Aspire el medio y sustituirlo con 1 mL de MEMg por pozo. Cerrar la placa y visualizar los espacios acelulares (creados por los insertos) bajo el microscopio invertido con 4 aumentos, equipada con una cámara de vídeo. Adquisición de imágenes en el tiempo cero (T0) y guardarlas en formato jpg.
- Retire el medio de los pozos de lavado con 1 mL de PBS y deséchela.
- Agregue los compuestos de prueba (preparados en el punto 3.2) a los pocillos. Para las muestras control sin tratar, añadir 1 mL de MEMg. Incubar la placa a 37 ° C y 5% CO2.
- Después de 15, 20 y 24 h tratamiento, observar la migración de la célula al microscopio con aumentos de 4 y adquirir imágenes.
Nota: Durante este paso, trata de plasmar imágenes en las mismas áreas en cuanto a T0. La elección de los intervalos de tiempo en el cual se capturan imágenes depende de la velocidad de migración celular. - Para estudiar el efecto de algunos inhibidores selectivos, es decir, AG1478, en la migración celular, aspirar el medio de cada compartimiento de inserción antes de quitar partes movibles.
- Lavado de cada compartimento con MEMg fresco y llenar con 70 μl de MEMg suplementado con AG1478.
- Después de 30 min de incubación a 37 ° C y 5% CO2, proceda como se describe desde el punto 3.3.
Nota: Durante el paso de lavado y tratamiento previo de monocapas de células con los inhibidores específicos, tenga cuidado de no quitar los insertos.
4. Análisis de la imagen
- Al finalizar el experimento, seleccionar imágenes de las muestras más representativas de los diferentes grupos experimentales y crear un archivo zip que contiene imágenes en h T0, T15, T20 y T24.
Nota: Imágenes estan tomadas a intervalos de tiempo seleccionados para todas las muestras. Ejecute triplicados para cada experimento, que se repite al menos tres veces. Al final, para grupos todo experimentales, un mínimo de 3 imágenes ("a", "b", "c", etc., derivadas de cada experimento independiente) en cada momento son analizados. - Subir el archivo zip en el software de análisis de imagen que proporciona automáticamente por correo electrónico un archivo Resumen de hoja de cálculo que contiene los datos experimentales de áreas cubiertas de la célula y del rasguño (en porcentaje) en los puntos de tiempo seleccionado.
Nota: El reconocimiento de la vanguardia y el gap se basa en el método de detección de borde (dirigido a identificar los puntos en que el brillo de la imagen cambia abruptamente). - Guardar los datos y recogerlos. Normalizar todos los datos con respecto al valor promedio en el tiempo cero. Calcular el valor promedio de los datos normalizados de todas las repeticiones en cada punto del tiempo y el error estándar relativo (SEM). Mediante el uso de dos vías de análisis de varianza (ANOVA), realizar análisis estadísticos con un software estadístico apropiado. Diferencias entre los grupos tratados con péptido y grupos de control en diferentes intervalos de tiempo son consideradas estadísticamente significativa para un p< 0.05.
- Representar los datos obtenidos en un gráfico como un histograma, que muestra el porcentaje de área cubierta de la célula de todos muestra grupos versus los intervalos de tiempo seleccionados.
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Representative Results
Este protocolo se utilizó para determinar el efecto de Esc(1-21) y Esc(1-21) - 1 c en términos de actividad de la migración celular inducida en las células epiteliales bronquiales expresando la CFTR funcional de cicatrización. En este ensayo, cultura insertos fueron colocadas en los pocillos de una placa de 12 pozos, y cada compartimiento fue sembrado con 35.000 células en MEMg suplementado con 10% FBS. Las células alcanzaron confluencia completa dentro de 24 horas después, se generó un vacío de 500 μm, y cada bien se llenó de MEMg que contiene el péptido a distintas concentraciones. El experimento se repitió cuatro veces. Como se indica en la figura 2, el cierre casi total del campo pseudo-herido producido en la monocapa celular fue inducido por dos péptidos dentro de ~ 20 h, a las concentraciones óptimas de 1 μM y 10 μM para Esc(1-21) - 1 c y Esc(1-21), respectivamente. Esto indica que Esc(1-21) - 1 c es más eficiente en la promoción de re-epithelialization de una pseudo-herida en células bronquiales.
Figura 2 : Efecto de 1a esculentin derivados amperios en el cierre de una pseudo-herida creado en una monocapa de células epiteliales bronquiales. Las células fueron sembradas en cada compartimiento de la inserción de la cultura de silicona y, después de su retiro, las células fueron fotografiadas por pruebas de migración de la célula 15, 20 y 24 h después de la adición de péptidos. El porcentaje de área cubierta de la célula en cada tiempo se calculó el punto en comparación con las células no tratadas control (Ctrl) y se divulga en el eje y. Todos los datos son los medios de cuatro experimentos independientes ± SEM y se toman de un anterior estudio14. Los niveles de significación estadística para las pruebas entre el control y las muestras tratadas son: *p< 0.05, **p< 0.01, ***p< 0.001, y ***p< 0.0001. Microfotografías que muestran resultados representativos antes (T0) y 20 h después del tratamiento de células con cada péptido en la concentración de 1 μM, en comparación con el control, también se divulgan. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para verificar si la activación de EGFR desempeñó un papel en el cierre de la herida inducida por Esc, células bronquiales se incuba durante 30 minutos con 5 μM de AG1478, un inhibidor selectivo de la EGFR, antes del retiro de insertar. Puesto que el porcentaje de área cubierta de células se redujo significativamente en todos los intervalos de tiempo en comparación con los resultados encontrados cuando las células no fueron pretratadas con la administración del péptido anterior del inhibidor (figura 3), esto indica que inducida por el péptido migración celular implica la activación de EGFR. Sin embargo, otros estudios serán necesarios para aclarar los acontecimientos moleculares provocados por los péptidos Esc (por ejemplo, activación de EGFR directa o trans-activación mediada por metaloproteasas, que se han demostrado para unirse a ligandos EGFR anclado de la membrana 19).
Figura 3 : Efecto de AG1478 inhibidor de la migración inducida por el péptido de las células epiteliales bronquiales. Antes del retiro de inserción, las células fueron previamente incubadas con 5 μM AG1478 por 30 min y posteriormente tratadas con el péptido en la misma concentración. Todos los datos son los medios de ± SEM de cuatro experimentos independientes y son tomados de nuestro anterior trabajo14. Los niveles de significación estadística para las pruebas de entre las muestras del grupo indicado son: *p< 0.05; p< 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Migración celular es un proceso esencial en muchos eventos fisiológicos y patológicos, incluyendo la cicatrización de heridas, desarrollo embrionario y metástasis del cáncer. El procedimiento básico para el estudio de la migración de la célula en vitro implica: (i) la creación de una monocapa de células, (ii) la producción de una pseudo-herida en la capa confluente de células, (iii) la captura de imágenes en diferentes intervalos de tiempo hasta que la herida cierre se alcanza y (iv) el análisis de la secuencia de imágenes con el fin de cuantificar la velocidad de migración de las células solicitadas.
Nuestros resultados han demostrado que la aplicación de rellenos de cultura es un objetivo y confiable técnica experimental para la evaluación cuantitativa de las características de la migración celular. Este ensayo puede realizarse por cualquier grupo de investigación con equipo de laboratorio básico. Sin embargo, algunos pasos críticos del Protocolo se deben considerar para lograr reproducibilidad. Por ejemplo, es importante definir, mediante experiencias piloto, el número exacto de semilla en cada compartimento con el fin de obtener el mismo grado de confluencia en todas las muestras individuales de las células. Para ello, tener células con una fase de ciclo sincronizado y evitando grumos de células antes de sembrar es fundamental. Una posible forma de minimizar la aglutinación es un pasaje suave de la suspensión celular a través de una aguja de jeringa. Sin embargo, aumentar el tamaño de las muestras significativamente contribuirá a disminuir la variabilidad entre las células.
Además, la creación de un espacio con un ancho definido en todas las muestras es crucial. Para ello, insertos de silicona no deben volver a utilizarse más de dos veces. Además, debe evitarse el crecimiento de células en la pared de separación de silicona. Para evitar este problema, la presión suave en la parte superior la inserción, una vez colocado en el plato placa/bien, puede ser aplicado manualmente con pinzas estériles para aumentar la adherencia del inserto en el plástico. Retiro prudente del inserto también obstaculizará la ampliación de la superficie de la célula con la interrupción de la monocapa celular.
Sin embargo, una vez que la inserto correctamente la obstrucción y una pseudo-herida se produce perfectamente, algunas líneas de células pueden separar de la superficie de plástico, sobre todo si se incuban en medios sin suero o suplementos como vitaminas, aminoácidos y factores de crecimiento. La ausencia de estos factores en un medio de cultivo celular puede ser dictada por el hecho de que pueden interferir con la actividad de promover la cicatrización de prueba compuestos. Para evitar este problema, la elección racional de la composición del medio de cultivo es muy recomendable.
Otro paso fundamental a tener en cuenta antes de configurar este procedimiento de cicatrización es la velocidad de migración diferente que existe entre los diferentes tipos de células. También en este caso, experimentos preliminares necesitan ser programadas con el fin de determinar los intervalos de tiempo correcto en que las imágenes tienen que capturar. También es necesario considerar que una limitación asociada a este método es que dichos insertos de cultura no pueden ser empleadas para el estudio de la migración de células que crecen en suspensión (por ejemplo, los leucocitos polimorfonucleares).
A pesar de cicatrización ensayos realizados con la cultura de silicona rellenos son más costosos que el ensayo de rayado clásico, permiten una reproducción rápida y precisa de los datos sobre la actividad de migración celular. Lo importante es que, una vez que el sistema de configuración, puede utilizarse para ampliar conocimientos sobre el mecanismo molecular subyacente a la actividad estimulada por factores endógenos o exógenos de cicatrización. Para ello, puede realizarse tratamiento previo de monocapas de células con moléculas específicas (por ejemplo, inhibidores) antes de crear la herida pseudo. Un ejemplo es dado por el tratamiento previo de las células con (i) la célula proliferación bloqueador del mitomycin C para explorar si el cierre del campo "herido" inducido por amperios está influenciado por la división de célula tipo20 o (ii) pesar los inhibidores para verificar la contribución de metaloproteasas en la activación de EGFR mediada de señalización de la vía12.
Lo importante es que, durante el proceso de cierre de herida, muestras pueden fijarse y tratadas con manchas apropiadas para la detección de núcleos y citoesqueleto (phalloidin y DAPI, respectivamente) para visualizar los cambios en el aspecto morfológico de las células (por ejemplo, la formación de lamellipodia en el borde delantero) por microscopia fluorescente/confocal. Por otra parte, el tratamiento de células con un amplificador marca fluorescente puede permitir la visualización de la distribución celular (membrana de la superficie o localización intracelular/intranucleares) en diferentes momentos, desde el comienzo de la actividad migratoria de las células. Además, estas piezas pueden ser explotadas para el análisis de la actividad de curación de herida en las células epiteliales polarizadas y diferenciadas (por ejemplo, las células bronquiales primarias mantenidas en la interfase aire-líquido), después de haber colocado en transwell adecuado soportes permeables.
En conclusión, el método descrito tiene considerable potencial para mejorar significativamente la comprensión de las características migratorias de diferentes tipos de tejidos de células animales adherente, epitelial, así como la selección de los más prometedores-heridas promotores o inhibidores, en poco tiempo y con alta exactitud.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos de la Universidad la Sapienza de Roma y la Fundación italiana de investigación de Fibrosis Quística (proyecto FFC #11/2014 aprobada por delegaciones de FFC de Siena, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny y Pavía). Parte de este trabajo fue apoyado también por FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020.
Agradecemos al Dr. Loretta Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, Italia) para proporcionar a las células epiteliales bronquiales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
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