Summary
Burada, yöntemleri temizleyerek bir en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı üç boyutlu (3D) kullanarak görüntü insan pankreas bölümlerine pasif mevcut. Bu el yazması insan adacıkları innerve otonomik ve duyusal sinir ağları temel unsurları belirlemek için boyama birden çok ayirt tarafından takip pasif optik takas için bu yordamları gösterir.
Abstract
Geleneksel histolojik yöntemlerle, araştırmacıların yansımasına tüm yeteneklerini engel vardır doku veya organ büyük ölçekli 3D. Histolojik kesitler genellikle sınırlıdır < 20 µm formalin olarak sabit parafin bölüm cam slaytlara veya < serbest yüzer sabit bölümleri için 500 µm. Bu nedenle, yoğun çabaları seri kesit ve 3D örnekleri için yeniden oluşturmak için büyük ölçekli görüntü yeniden yapılanma yöntemleri için gereklidir > 500 µm geleneksel yöntemlerle. Ayrıca, ışık scatter oluştururlar dokularda, özellikle lipidler, üzerinden engeller derinliğe görüntüleme > 150 µm ile en confocal mikroskoplar. Işık saçılım azaltmak için ve basit confocal mikroskobu kullanarak derin doku görüntüleme için izin vermek için kemirgen ve insan doku örnekleri için ilgili daldırma tarafından giderilen çeşitli optik Temizleme yöntemleri geliştirilmiştir. Birkaç yöntem ve ilgili Akrilamid ve Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) ile takas doku ile protein crosslinking kullanın. Çeşitli avantajları ve dezavantajları her değişiklik olmasına rağmen diğer optik Temizleme teknikleri çeşitli çözücüler kullanılır. Burada, bir en iyi duruma getirilmiş pasif optik takas yöntemi insan pankreas innervasyon çalışmaları için ve insan adacıkları innervasyon sorgulama için özel olarak tanımlanmaktadır.
Introduction
Yakın zamana kadar büyük doku veya tüm organları 3 boyutlu (3D) inşası zahmetli seri kesit, boyama ve resim birden çok bölüm yeniden inşası ile gerçekleştirildi. Bu yöntemler çok sayıda seri kesitler, zavallı doku penetrasyon ile antikorlar ve dokularda derin görüntüleme önleme saçılma ışık güvenilmesi dahil olmak üzere çeşitli dezavantajları vardı. Daha fazla ışık ve antikor penetrasyon için izin vermek için araştırmacılar protein antijenleri ışık saçılım lipidler çoğunluğu kaldırılırken korumak için kimyasal yöntemler geliştirdi. Birkaç yöntemleri katı Imaging doku Clear Lipid-Exchanged Akrilamid melezleşmiştir hidrojel (NETLİK), pasif netlik tekniği (anlaşma) ve ( 1',2 gözden perfüzyon destekli Aracısı yayın içinde in situ (PARS) ilgili ,3,4,5,6). NETLİK yöntemi sabitleme formaldehit, Akrilamid ve Elektroforez bir SDS çözüm2' kullanarak lipid kaldırma tarafından takip BIS hidrojel kullanarak proteinlerin temel alır. Bu yaklaşım daha sonra takas pasif için değiştirilebilir ve gelişmiş görüntüleme7. Daha fazla en iyi duruma getirme BIS ortadan kaldırılması ve çeşitli oranlarda paraformaldehyde hidrojel çözüm (1-%4) en uygun antijen stabilizasyon elde etmek için anlaşma 8adında bir teknik için kısa takas süresi ile yol açtı. Bu optik Temizleme teknikleri geliştirmek için erken girişimleri zor-e doğru iş ile ve transgenik fare modellerinde çeliklerini endojen floresan proteinler organik veya diğer bileşikler dahil. Bu ek yöntemler ölçekler engelsiz beyin/beden kokteyller ve Computational analizi (kübik), tüm çeşitli avantajları ve dezavantajları ile9anahtarı ve Dimensional Imaging of Solvent-Cleared organları (DISCO) yöntemleri dahil, 10,11,12. Orijinal NETLİK yöntemi lipid zengini fare beyin dokusunda geliştirilmiştir ve optik Temizleme yöntemleri insan doku7,8,11,13' te,14 test sınırlı oldu .
Optik takas yöntemler olduğu gibi fare merkezi sinir sistemi olduğu gibi uzun mesafelerde izleme sinirler için idealdir. Pankreas de otonomik ve duyusal sinir sistemi tarafından innervated. Pankreatik endokrin bölmenin of Langerhans adacıkları, tüm organ (% 1-2) çok küçük bir bölümünü oluşturan ve adacıkları heterojenite boyutları (50-250 µm), endokrin hücre oranlarını ve özellikle diyabet ( 15 gözden dansitesi tanıyoruz ,16). Bir protokol gelişmekte olan, çeşitli optik Temizleme yöntemleri için insan pankreas test edildi ve bir anlaşma yordam sinirler ve adacıkları ile ün mükemmel morfolojik korunması (~ 2 hafta) temizleme zamanı en iyi dengeyi sağlamak için bulundu. Son en iyi duruma getirilmiş yordamı nöro-ada ağ için tarif burada açıklanan büyük ölçekli (milimetre mesafeler) ve birden çok sağlam pankreas adacıkları yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme. Örnekleri yanı sıra depolama tarafsız tampon formalin içinde sabit ve parafin balmumu içinde gömülü sonra hemen fiksasyon ardından insan pankreas veya uygun bir tekniktir. Örnekleri confocal tarafından görüntüleme için uygundur veya lightsheet mikroskobu.
Protocol
Tüm deneyler Florida Üniversitesi Kurumsal değerlendirme Komitesi ve Federal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
Dikkat: Paraformaldehyde ve Akrilamid toksik tahriş edici vardır. Reaktifler bir duman başlıklı uygun kişisel koruyucu ekipman (önlük, eldiven, göz koruması) ile başa.
1. deparaffinization formaldehit sabit dokuların (Eğer taze dokular ile çalışma, 2. adıma atlayın)
- Yeni jilet veya neşter parafin ile doku yüzeyine dik kesmek için kullanın. Parafin bu gevşeme bitirmek için doku arasındaki sınırda kesti. Forseps veya bir spatula nazikçe gevşetin ve optik temizlenecek doku kaldırmak için kullanın. Yavaşça bir spatula (şekil 1A) kullanarak dokusundan fazla parafin kazı.
- Bir cam kaba Ksilen (yaklaşık 30 mL 3 x 3 x 3 mm bölüm doku için) ile doldurun ve 24 saat oda sıcaklığında (RT) için bu çözüm dokusunda kuluçkaya.
- Başka bir cam kaba 1.2.1 aynı birimle taze Ksilen ile doldurun. Aktarım ve RT. 24 h için bu çözüm dokusunda kuluçkaya
- % 100 etanol 1.2.1 aynı birimle konik bir tüp içine koyun. Aktarım ve RT. 24 h için bu çözüm dokusunda kuluçkaya
- % 95 etanol 1.2.1 aynı birimle konik bir tüp içine koyun. Aktarım ve RT. 24 h için bu çözüm dokusunda kuluçkaya
- % 70 etanol 1.2.1 aynı birimle konik bir tüp içine koyun. Aktarım ve RT. 24 h için bu çözüm dokusunda kuluçkaya
- Durulama 0.01 M fosfat dokusunda tamponlu tuz (PBS) ve doku parafin (şekil 1B, doğru kapı aynası) ücretsizdir RT. emin olun, 24 h için equilibrate için 0,01 M PBS konik tüp içinde bir yerde.
2. % 4 Paraformaldehyde (PFA) sabitleştirici hazırlayın
- 10 mL % 16 pipet PFA 50 mL konik tüp içine 4 mL 0.1 M PBS ekleyin ve 26 mL distile deiyonize su (GKD2O) ekleyin. Kapağı kapatın ve kısa bir süre karıştırın.
- % 4 daha büyük birimleri PFA devam et ve dondurulmuş aliquots içinde yapılabilir. Aliquots 4 ° C'de bir hafta ve 1 ay-20 ° C'de (RT), oda sıcaklığında 1 gün için iyi
3. pankreas fiksasyon
- Pankreas örnek (≤ 1 x 1 x 2 cm) taze hazırlanmış %4 oranında tamir PFA 48 saat için 4 ° C'de. Örnek 1 x 1 x 2 cm, içine daha küçük incelemek için bir bistüri veya jilet kullanın daha büyük ise en fazla 1 cm kalınlığında parçalar. Doku örneği üç değişiklikleri 0,01 M PBS için en az 15 dk içinde her yıkama yıkama ve 15 mL santrifüj tüpü % 0,01 PFA/0,01 M PBS ya da % 0.5 sodyum azid/0,01 M PBS kadar kullanmak saklayın.
- Fiksasyon sonra doku işlenmesi için 1-2 mm kalınlığında bölümlere bölüm. Bir vibratome bile kesit yardımcı olması için kullanın.
Not: Son bölüm başlangıç örnek boyutu üzerinde bağlıdır.
4. embed doku hidrojel içinde
- 200 mL % %4 Akrilamid/1 paraformaldehyde (A4P1) hidrojel monomer çözeltisi şekilde hazırlayın:
- Bir şişe buz bir kova bir manyetik heyecan plaka üstüne yerleştirin. Şişeye düz oturuyor emin olun ve bir manyetik heyecan çubuğu ekleyin.
- Aşağıdaki sırayla ekleyin: 147.8 mL soğuk (4-8 ° C) ddH2O, 20 mL 0.1 M PBS, 20 mL soğuk (4-8 ° C) % 40 Akrilamid çözüm, 12.2 mL % 16 PFA çözüm ve 250 mg VA-044 başlatıcı. En az 10 dakika için bir manyetik heyecan çizgiyle tüm hidrojel çözüm mix ve buz sonraki adım için çözüm bırakmaktır.
- 15 mL konik tüp buz yanında hidrojel solüsyon içeren şişeye koyun. Monomer çözüm 14 mL tüp içine pipet ve 1-2 mm kalınlığında sabit doku örneği tek parça ekleyin. Sonra tüp kap.
- Monomer çözüm örnek 4 ° C'de 3 gün kuluçkaya ve ışıktan korumak. Aliquot kalan monomer çözüm ve mağaza-20 ° c ileride kullanmak için.
5. Monomer çözüm degas ve hidrojel polimerize
- Oksijen gaz halinde olan yakıtlar N28kullanarak hidrojel monomer çözümden kaldırmak.
- Bir kova dolusu buz hazırlamak ve hidrojel monomer çözüm buz üzerinde örnek yer.
- 2-3, 18'lik Hipodermik iğneler örnek, parafin film ve bir zamanlayıcı ücret toplamak. Tüp azot tankı bağlama azot akabilir. Örnek üzerinde buz tutarken dikkatli bir şekilde bir tarafta örnek içeren bir konik tüp kap işlemek ve sıvı monomer çözüm altında o kadar Hipodermik İğne yüzeydir 1'e basın.
- Başka bir şırınga iğnesi kap karşı tarafına ponksiyon için kullanın, ama su altında olmak izin vermez.
Not: İkinci iğne tüp delik. - Tüp hidrojel altında batık Hipodermik İğne azot tankından bağlanabilir ve sürekli sıvı ile köpüren kadar yavaş azot üzerinde döner.
- 10 dk için sıvı ile kabarcık azot sağlar.
- Oksijen kaldırılır bir kez hızlı bir şekilde her iki iğne kaldırmak ve gazlar tüp ve çevre arasında daha fazla herhangi bir değişimi önlemek için bir parafin film kapaklı kapağı. Degassed örnek bir kuluçka hidrojel polimerize 3 h için 37 ° C'de yerleştirin.
6. doku takas
- 500 mL çözüm (pH %8,5 4 SDS) temizleyerek hazırlayın. GKD2O ~ 300 mL için 50 mL 0.1 M PBS ve 20 g SDS toz karıştırma bir manyetik heyecan çizgiyle süre ekleyin. Sodyum hidroksit ve hidroklorik asit pH 8,5 için kullanarak çözüm ayarlayın. Son hacim 500 mL kadar GKD2O ekleyin.
- Polimerizasyon sonra uzak aşırı hidrojel dökün ve bir kimyasal atık konteyner içine atın. Yavaşça örnekten uzak hidrojel silin ve bir kimyasal atık konteyner içine atmak için kağıt havlu kullanın.
- Örnek 3-5 değişimleri 0.01 m PBS (at yıkama sıvısı içine kimyasal atık) 15 dakika her yıkama adım yıkayın. Örnek arabellek açıklığın 40 mL ile 50 mL konik tüp içine aktarın.
- Örnek 37 ° C'de takas arabellekte kuluçkaya ve örnek taze takas arabelleğe her gün değiştirin.
- Örnek uygun takas emin olmak için örnek boyutu (~ 8 hafta 3 mm x 3 mm x 3 mm örnek için) bağlı olarak 2-8 hafta boyunca takas arabellekte bırakın.
- Doku takas izleneceğini ve tamamlandığında. Uygun takas için kontrol etmek için ışığa tutarak örnek yeterince şeffaf olduğundan emin olun (genellikle bazı tan boyama ekzokrin bölgelerde devam edecek).
Not: Aşırı temizlenmiş bir örnek kenarlarında yıpranmış görünür ve doku Forseps ile elime aldığımda çok yumuşak olacak. Düzensiz temizlemek örnek için yaygındır. Ayrıca, doku kadar (INSERT, şekil 1 c) ortam takma yerleştirilir tamamen saydam olmayacaktır.
7. birden çok ayirt
- Bir shaker 60 RPM üzerinde örnekleri RT bir günlüğüne taze arabelleğine kez (4-5 tampon, toplam 40 mL her h son yıkama kadar değişen her yıkama değiştirir) değişen 40 mL 0.01 M PBS yıkayın. Gecede RT. devam son yıkama izin
- Arabellek boyama PAKTI hazırlayın. 500 mL 0.01 M PBS için 50 mg sodyum azid ve 0.5 mL TritonX-100 ekleyin. İyice karıştırın.
- Örnek birincil antikorlar ile kuluçkaya.
- 2-mL düz dipli tüp arabellekte boyama temel PAKTI % 2 normal serum (aynı tür ikincil antikor olarak) eklemek (en az 1 mL Toplam hacim örnek/tüp önerilir).
- Birincil antikor % 2 serum/tampon boyama PAKTI için ekleyin. (Yani bir antikor için standart immünhistokimya, PAKTI boyama için kullanım 1: 100 seyreltilmiş 1:500 ise) için standart immünhistokimya derdi gibi yaklaşık 5 x birincil antikor miktarı PAKTI boyama için kullanın.
- Bir spatula örnek yıkama arabelleğinden kaldırın ve kağıt havlu üzerine kapalı aşırı arabellek dab sonra birincil antikor çözüm ile tüp yerleştirmek için kullanın.
- RT bir shaker 60 RPM üzerinde 2-4 gün kuluçkaya. Örnekleri RT bir shaker 60 RPM taze arabelleğe 4 - 5 kez değişen ve son yıkama gecede adım 7.1 olduğu gibi bırakarak 0.01 M PBS üzerinde iyice yıkayın.
- Örnekleri ikincil antikorlar ile kuluçkaya.
- 2-mL düz dipli tüp arabellekte boyama temel PAKTI % 2 normal serum (aynı tür ikincil antikor olarak) eklemek (örnek/tüp 1 mL Toplam hacim tavsiye edilir).
- İkincil antikorlar (1 mL arabelleği 5 µl) 1: 200 bir konsantrasyon ekleyin.
Not: Küçük format antikorlar tercih, aynı zamanda son derece çapraz adsorbe antikorlar birden fazla birincil antikor kullanıyorsanız geçerlidir. - Bir spatula örnek yıkama arabelleğinden kaldırın ve kağıt havlu üzerine kapalı aşırı arabellek dab sonra ikincil antikor çözüm ile tüp yerleştirmek için kullanın.
- Bir shaker 60 RPM üzerinde RT, 2 gün kuluçkaya ve örnek ışıktan korumak.
- Örnekleri iyice yıkayın, RT bir shaker 60 RPM taze arabelleğe 4 - 5 kez değişen ve final bırakarak 0.01 M PBS üzerinde 7.1, adımda olduğu gibi gece yıkama, ışıktan yıkama sırasında korumak.
8. montaj örnekleri görüntüleme için
- Kırılma indisi eşleşen çözüm (jant) arabellek hazırlayın.
- Non-iyonik yoğunluk gradient orta (örneğin, Histodenz) 11 g tartmak ve dikkatle 50 mL konik tüp aktarın.
- ~ 5 mL 0,02 M fosfat tampon (PB)8 toz non-iyonik yoğunluk gradient orta hava serbest bırakmak için bir spatula kullanarak ekleyin.
Not: Çözüm çok viskoz, iyice karıştırın. - 10 mL daha fazla PB kullanarak ses getirmek, bir spatula ile karıştırın ve tüpün içine aşırı spatula kapalı kazımak.
- JANTLAR eriyene kadar 37 ° C de kuluçkaya, ters çevir ve karışımı yavaşça gerektiği gibi.
- Örnekleri jantlar aktarın. Bunu yapmak için 2-mL düz-alt tüpüne pipet 1 mL jantlar. Bir spatula örnek yıkama arabelleğinden kaldırın ve kağıt havlu üzerine kapalı aşırı arabellek dab sonra jantlar çözüm ile tüp yerleştirmek için kullanın.
- JANTLAR örnekte daldırın tüpü hafifçe dokunun. Örnek 2-4 gün önce görüntüleme için RT ışıkta korunuyorsunuz bankta jantlar yerleştirin.
- Görüntü için jantlar küçük bir miktar bir 8-şey coverslip alt odası slayt içine yerleştirin. Daha fazla örnek üzerinde ters bir kapsamı görüntü daha zorlaştırır float neden olur, sadece yeterli alt kat için ekleyin. Örnek kuyuya Ekle ve slayt görüntüleme için kap.
9. görüntüleme
- Confocal mikroskobu ve düşsel bilgisayar yazılımı
- Uyarma ve PAKTI örnekleri leke için kullanılan fluorophores salma spectra için uygun lazerler seçin. Kanallar arasında herhangi bir çakışma ortadan edinme yazılım ayarlarını ayarlayın. (İki fluorophores benzer uyarma spectra) ayrı parça gerekiyorsa kullanın.
- Resim alma ayarla
- Maksimum edinme hız, 16 bit, 4 veya daha fazla ortalamalar ve 1024 x 1024 çözünürlük seçin ya da daha iyi.
- Yansıması için nesnesine zoom.
Not: Bu fotoğraf beyazlatma azaltmak ve ayrıca dosya boyutu ve karşıdan akış düzenleme azaltmak için satın alma zaman azaltacaktır.
- Z-yığın Kur.
- Kullanılan amaç için en uygun kesit seçin. Deconvolution daha sonra isterseniz bir z-adım en uygun 1 µm gibi daha küçük kullanın.
- Z-yığın düzeltme kullanın.
- Doku yüzeyine en yakın başlamak ve amaç z uçağın odaklanır kazancı artar ve düzeltmeleri ekleyin. Düzeltme için lazer ayarlarını değiştirmeyin!
- Bir ortalama, 512 x 512 çözünürlük ve maksimum edinme hız testi yığınıyla elde etmek. Görüntü 3D son yüksek çözünürlüklü z-yığın alınıyor önce her renk için yığını boyunca eşit parlaklık olduğundan emin olmak için denetleyin.
- Lightsheet görüntüleme
- Örnekleri jantlar en az 24 h için ideal görüntüleme için equilibrated, görüntüleme odasında taze jantlar için örnekler aktarmak ve odasında equilibrate için en az bir gün için izin emin olun.
- Görüntüleme için örnek monte
- Örnek takmak için en küçük (siyah) kılcal seçin
- Macun veya bir tabak kılcal damar sonuna kadar süper yapıştırıcı uygulanırken örnek tutmak için kullanın. Küçük mümkün olduğunca doku yüzeyine dokunmadan kılcal için doku yapıştırıcı.
- Görüntüleme için örnek ekleyin.
- Resim 5 X veya 25 X hedeflerine uygun optik temizlenen örnekleri pivot kullanarak seçeneği tarama kullanarak. Gölgeleme veya bulanıklık ortaya çıkarsa, örnek döndürme ve yeniden deneyin veya jantlar equilibrate devam örnek izin.
Not: 1 mm yığını genellikle az beş dakika ayarlarına bağlı olarak elde edilebilir. - Görüntüleyin ve görüntü analiz yazılımı kullanarak görüntü yığınları düzenleyin.
Representative Results
Bu boyama işlemleri büyük ölçekli bir inceleme insan pankreas adacıkları ve ilişkili otonomik ve duyusal ağları incelemek için sağlamak için geliştirilmiştir. Çeşitli yordamlar NETLİK7, iDISCO17, dahil olmak üzere test edildi ve PAKTI8 en iyi bulunan anlaşma yöntemi ile insan pankreas ve confocal görüntüleme için uygun.
Birincil antikorlar başlangıçta test edildi üzerinde insan pankreas örnekleri uygun pozitif ve negatif kontrol örnekleri ile sabit (fare beyni, diğer). Her laboratuvar antikor dilutions çok sayı ve doku kaynağına bağlı olarak en iyi duruma getirmek için bekleyebilirsiniz rağmen birincil antikorlar ve önerilen dilutions Malzemeler tablolistelenir. Birincil antikor çok çok varyasyon etkisi boyama yoğunluğu ve özgüllüğü ve leke yoğunluğu aynı derecede eski reaktifler gibi ile elde etmek için doğrulama gerektirir.
İnsan pankreas adacıkları insülin, glukagon ve secretogranin 3 (Resim 2) tarafından belirlenen. Schwann hücreleri gliyal fibrillary asit protein (GFAP'nin, Şekil 2 ve şekil 3A) kullanarak tarif. Parasempatik marker vazoaktif intestinal peptid (VIP) karşı antikor ile lekeli sinirler Lightsheet (şekil 3B) görüntüsü. Sempatik sinirler (gösterilmez) tirozin hidroksilaz için boyama ile görülebilir.
Şekil 1. İnsan pankreas optik takas. (A) bir jilet kesmek ve doku bölümü kaldırma ve Dış Saha fazla parafin (alt paneller) dokusundan kazıma önce parafin gömülü doku (üst panelleri) bir bölümünü gevşetmek için kullanılır. Temsilcisi doku örnekleri (B sol, C üst) önce ve sonra (sağ B, C orta) optik takas Protokolü bölümünde açıklandığı gibi parafin gömülü doku gösterilir. Temizlenmiş, sabit doku (B doğru C üst) ve sık sık doku temizledikten sonra tamamen şeffaf değil şişlik olabilir (C, orta panel)takdir. Temizlenen doku denge jantlar (C, alt panel)sonra tamamen şeffaf olur. Ölçek çubukları: 500 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. İnsan nöro-ada ağ. İnsan pankreas örnekleri nPOD organ bağış veya arşivleme parafin gömülü doku açıklandığı gibi temizlendi. (A-D) Schwann (GFAP'nin +, beyaz) hücreleri ve endokrin hücreleri (kırmızı) insülin ve glukagon (yeşil) tarafından lekeli gösterilir. (A) Confocal mikroskobu ve maksimum yoğunluk projeksiyon (MIP) üzerinde kan damarları adacık çevre yanındaki akan ve adacıkları uzanan sinirler Schwann hücreleri (GFAP'nin +) izlemeyi gösterir. İlave yüksek çözünürlük elde edilen ve GFAP'nin + Schwann hücreleri ve endokrin hücreleri arasında temas gösterir gösterir. (B) paneli bir 3D görüntü (ölçek: x = 50 µm, y 20 µm, = z = 25 µm) A. Parafin-PAKTI örnek confocal mikroskobu ile görüntülü gösterilir ve sunulan en fazla yoğunluk projeksiyon (C) olarak ve 3D (D), ölçek: x, y = 50 µm, z = 25 µm). Ölçek barlar , C: 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. 3 boyutlu görselleştirme ve dikiş. Üç dikişli görüntü yığınları GFAP'nin ve confocal mikroskobu kullanılarak lekeli ve neurite izleme eklentisi görüntü analiz yazılımı kullanarak takip Schwann hücreleri elde. (A) Izleme 3B dolgu gösterilir (ölçek çubukları: x 150 µm, = y = 200 µm (0.2 mm), z = 120 µm) (B) A PAKTI örnek VIP antikor ile lekeli ve lightsheet mikroskop kullanarak yansıma. Yığın > 1 mm derinlik ve sinir lifleri yüksek çözünürlükte açıkça görülmektedir. Bir kanalı (D, ön plan) ve bir gangliyon (G, arka plan) kaydırma lifleri görülebilir (büyük kılavuz: x, y, z = 200 µm; onay işaretleri: x, y, z = 40 µm). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Yeni optik Temizleme yöntemleri kullanılabilirliğini benzeri görülmemiş büyük ölçekli sınav merkezi ve periferik sinir sistemi hayvan modellerinde izin vardır. İnsan pankreas genel innervasyon şekillerinin doku yoğunluğu ve yüksek kaliteli biospecimens edinme zorlukları nedeniyle büyük ölçüde keşfedilmemiş. Bu Protokolü protokol insan pankreas dokusu sabit veya parafin gömülü arşivleme örneklerinden için Temizleme en iyi duruma getirilmiş bir doku sunar.
Zaman bağlıdır örnek boyutu, sabitleştirici türü, süresi, depolama süresi ve 1-8 hafta, aşağıdaki önemli noktalar önemlidir bu yüzden gerektirebilir. Uzun süreli depolama takas süresi artar çünkü doku % 4 İngiltere'de yılın fiksasyon yakında sonra mümkünse temizlemek en iyisidir. Takas süresini en aza indirmek için PFA miktarına hidrojel monomer olarak %4 1 fiksasyon adımda insan pankreas için kullanılan % azalma. Diğer dokulara özellikle fare dokular, PFA antijenleri korumak için yeterli hidrojel sertlik sağlamak için gerekli miktarda ampirik olarak belirlenmelidir. Yeterli açıklığın da antikor penetrasyon kötü temizlenen dokularda azalır ve ikincil antikorlar tarafından boyama yüzey artar gereklidir. Takas çözüm değiştirme her diğer gün (veya, hatta günlük) pH sabit ve deterjan taze tutmak en iyisidir. Diğer taraftan, aşırı olumsuz takas hücresel Morfoloji etkileri ve doku friability artırır. Bazı pankreas örneklerini düzensiz bölgeleri fibrozis gelen kronik pankreatit gibi doğal patolojileri veya diğer patolojiler nedeniyle temizlemek beri sık sık bu işlem izlemek önemlidir. Vibratome kalın bölümleri kullanımını Tekdüzen kalınlıkları yapmak için de kullanılabilir henüz gerekli değildir. En kısa zamanda ışığın kolayca örnek geçtiğini örnekleri deterjan kaldırılır böylece takas işlemi izleme örnek yeterince temizlenir sağlar.
Antikor penetrasyon ve yüzey boyama PAKTI örnekleri ile düşünmeye önemli sorunlar vardır. İyi antikor penetrasyon sağlamak için örnekleri birincil antikorlar ile en az 2 gün kuluçkaya önemlidir. Çeşitli antikor farklı Difüzyon oranlarına sahip ve tek tek optimize edilmelidir, ama çoğu antikorlar için 4 gün oldu 1 mm3 örnek bir tam penetrasyon için yeterli süre. Yüzey boyama bir sorun ise, özellikle Lightsheet görüntüleme için örnek yarım kesilmiş veya yüzey boyama sonra uzağa disseke. Küçük format antikorlar ne zaman elde edilebilir doku penetrasyonu8ile yardımcı olmak için beklenir. Preconjugated antikor yanı sıra aynı çekimsiz klon çalışması için görünür ve nonspesifik bağlama ve yoksul doku penetrasyon yüksek arka plan olabilir hiç çalıştıkları görülmektedir. Serum preconjugated antikorlar ile geliştirilmiş başarı için artırmak ve boyama içinde TritonX-100 konsantrasyonları tampon ve daha uzun incubations kullanın (> 4 gün). Boyama sonra jantlar örnekte kuluçka birkaç gün için çok önemlidir. PBS ve jantlar kuluçka temizlenen doku swell onları geri orijinal boyuta Küçült neden olur. Özellikle lightsheet görüntüleme ile örnek tamamen görüntüleme önce equilibrated.
Örnekleri confocal mikroskop düşsel, düzeltme her zaman yeni bir pozisyon seçilir ayarlanması gerekir. Çeşitli edinme derinlikleri ve doku boyunca yoğunluk boyama içinde değişim gerektirir dokusunun en iyi şekilde yansıması için her alan için ayarlar. Aynı şekilde, kullanılan ikincil antikorlar dikkatle düşünülmesi gerekir. Fluorophores uygun şekilde parlak bir sinyal confocal mikroskop emisyonlarına filtre uygularken emin olmak bir düşük uyarma veya emisyon örtüşme seçilmelidir böylece spektral unmixing PAKTI örnekleri, meydan okuyor. Böylece en iyi kalitede görüntü fotoğraf beyazlatma olmadan elde edilebilir her uygulama için bir denge çözünürlük, görüntüleme hızı ve gürültü azaltma arasında vurdu gerekir. Çözünürlük 1024 x 1024'ten büyük insan gözü tarafından algılanamaz değil ama bir leke miktar gerekirse bazı uygulamalar için gerekli olabilir.
Bir optik Temizleme tekniği seçerken ve optik takas diğer daha geleneksel yöntemleri üzerinde seçerken dikkat etmeniz gereken pek çok şeyler vardır. Düşük bereket antijenleri böylece antijen saptama sınırlamalar vardır anlaşma yöntemi kullanılarak tespit olmayabilir. İmmünolojik antijenleri (CD3, CD4, CD8, vb) gibi belirli antijenleri PAKTI yöntemi tarafından yok edilir ve yüksek kaliteli antikorlar rağmen onları tespit etmek kullanılabilir vardır. Başka bir bu yöntemin boyama takas kadar sonra ayırt etmek zor olan donör pancreases arasında doğal değişkenlik kısıtlamadır. Her donör doku temizleyin ve benzer şekilde prosedürleri arasında leke eğilimi, ama farklı donör doku yaygın olarak değişen takas kez ve doku Morfoloji kalite takas sonra. Bu değil iyice araştırmış olsa da bir çok sayıda hasta pankreas örnekleri için yeterli erişim varsa arşivleme doku kullanma yeteneğini bu sınırlama azaltmak. Burada rapor anlaşma Protokolü ucuz ve kolay uygulanan standart Laboratuar donanımları ile bulundu. Temizlenen örnekleri geleneksel confocal mikroskobu, yanı sıra 2-Foton ve Lightsheet teknolojileri ile görüntüleme için uygun ve yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu görüntüleri sinirler ve büyük bölümlerini insan pankreas adacıkları sağlanan. Bu yordam gelecekteki uygulamalar fetal pankreas ekzokrin ve endokrin bölmeleri ve adacık çalışmalarda tip 1 ve tip 2 diyabet için geliştirme çalışmaları içerir.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Dr Ann Fu ve Joseph Canzano teknik destek için Dr Jennifer Treweek için çok değerli tavsiyeler ve Dr Kristin Overton ve Dr. Karl Deisseroth Stanford Üniversitesi NETLİK atölye ile MCT için eğitim için teşekkür ederiz. JDRF nPOD ve Organ tedarik kuruluşlar doku örnekleri sağlanan. Bu eser JDRF (47-2014-1), Helmsley hayırsever güven (HCT 2015-PG-T1D052) ve NIDDK 1OT2 TR001773 MCT için tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | Buffers |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | S375-500 | PB buffer (RIMS) |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | 71507-250 | PB buffer (RIMS) |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | Immersion fixation, hydrogel, storage solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | Hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | Hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | Hydrogel |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | Clearing buffer |
| Sodium azide | Sigma | S8032 | Sample storage buffer |
| 18 gauge needles | Fisher | 14-840-91 | Degassing hydrogel solution |
| N2 tank | AirGas | various | Degassing hydrogel solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 100 ml | Buffers |
| Goat, normal serum | Vector | S-1000 | Use as 2% in blocking buffer |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | RIMS |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80827 | Imaging |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 710 | Imaging |
| LightSheet microscope | Zeiss | Z1 | Imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibody | |||
| CD45 | Bioss | bs-4820R-A488 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Did not work |
| CD45 | DAKO | M0754 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| GFAP | DAKO | Z0334 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | BD Biosciences | 565891 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | Cell Signaling | 2760S | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| Glucagon | Abcam | ab10988 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Insulin | DAKO | A0564 | Host: Guinea Pig Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| NCAM (CD56) | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| NCAM (CD56)-FITC conjugate | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Peripherin | EnCor | RPCA-Peri | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| PGP9.5 | DAKO | Z5116 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Secretogranin 3 | Sigma | HPA006880 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Smooth muscle actin | Sigma | A5228; C6198 (Cy5) | Host: Mouse Dilution: 1:200; 1:200 Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated |
| Substance P | BioRad | 8450-0505 | Host: Rat Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Abcam | Ab76442 | Host: Chicken Dilution: 1:100 Comments: Worked, but weak staining |
| Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) | Immunostar | 20077 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) | Synaptic Systems | 139103 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Secondary Antibody | |||
| Guinea pig IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Mouse IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rat IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat, Donkey Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Chicken IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
References
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Orlich, M., Kiefer, F. A qualitative comparison of ten tissue clearing techniques. Histol Histopathol. , 11903 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Curr Opin Biotechnol. 40, 193-207 (2016).
- Hsueh, B., et al. Pathways to clinical CLARITY: volumetric analysis of irregular, soft, and heterogeneous tissues in development and disease. Sci Rep. 7 (1), 5899 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Campbell-Thompson, M. Organ donor specimens: What can they tell us about type 1 diabetes? Pediatr Diabetes. 16 (5), 320-330 (2015).
- Kim, A., et al. Computer-assisted large-scale visualization and quantification of pancreatic islet mass, size distribution and architecture. J Vis Exp. (49), (2011).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
