Summary
העור האנושי פועל כשורה הראשונה של הגנה מפני הסביבה החיצונית. אנו מציגים שיטה לבודד את ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים. Keratinocytes מבודדים אלה שימושיים רבים setups ניסיוני, הם מודל המתאים מאוד ללמוד המנגנונים המולקולריים ב ביולוגיה עורית במבחנה.
Abstract
הפונקציה העיקרית של keratinocytes נועד לספק את השלמות. המבנית של האפידרמיס, ובכך שומר על מחסום מכני אל העולם החיצון. בנוסף, keratinocytes ממלאות תפקיד חיוני החניכה, תחזוקה, רגולציה של תגובות חיסוניות עוריות באופן אקטיבי של מערכת החיסון המולדת להגיב לגירויים antigenic בצורה מהירה, לא ספציפית. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור בידוד של ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים, ומדגימים כי תאים אלה מגיבים סידן-induced התמיינות סופנית, כפי שנמדדה על ידי ביטוי מוגבר של involucrin סמן בידול. בנוסף, אנו מראים כי keratinocytes מבודדים הם מגיבים IL-1β-induced הפעלת איתות המסלולים תאיים כפי שנמדד על-ידי הפעלת מסלול MAPK p38. יחדיו, נתאר שיטת בידוד, culturing של ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים. מאחר keratinocytes הן סוג התא השולט האפידרמיס, שיטה זו שימושית לחקור את המנגנונים המולקולריים ב ביולוגיה עורית בתוך חוץ גופית.
Introduction
העור הוא האיבר הגדול ביותר בגוף האדם ומשמש מחסום מגן מפני הסביבה החיצונית. העור מורכב שתי שכבות עיקריות: דרמיס לאפידרמיס, איפה האפידרמיס מהווה את השכבה החיצונית ביותר של העור. הסוג הנפוץ ביותר תאי האפידרמיס הוא keratinocytes הכוללת יותר מ 95% של מסה1,תא2. Keratinocytes נשמרים בשלבים שונים של בידול האפידרמיס, מאורגנים לשכבות הבזליים, spinous, פרטנית ו cornified התואמים בשלבים מסוימים של בידול3. התפקיד העיקרי של keratinocytes נועד לספק את השלמות. המבנית של האפידרמיס, ובכך לייצר מחסום שלם לעולם החיצון.
Keratinocytes לייצג גם את השורה הראשונה של הגנה מפני פתוגנים בעור, לכן יש תפקיד חשוב ב4,תגובה חיסונית מולדת5. חשיפת keratinocytes לגירויים חיצוניים מוביל ההפעלה של איתות המסלולים תאיים ובעקבות כך, ייצור של מספר מתווכים דלקתיים שונים, לרבות ציטוקינים, נוגדנים פפטידים מיקרוביאלית. חלבונים אלה נגזר תקין להשתתף בתגובה דלקתית על ידי גיוס והפעלת תאים חיסוניים כגון תאים דנדריטים, נויטרופילים ספציפי T תאים6,7. לכן, בגלל keratinocytes לשחק תפקיד מכריע בתהליכים ביולוגיים רבים, הרציונל מאחורי הטכניקה המובאת כאן היה ליצור מודל במבחנה ללמוד ביולוגיה העור. תרבויות תקין ראשוני המתקבל העורלה neonatal משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד העור-ביולוגיה-8,-9. עם זאת, עם הטכניקה המתוארת כאן, keratinocytes של שני המינים מתקבלים וכתוצאה מכך מגוון ביולוגי גבוה יותר של התאים.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט על בידוד ועל הדור של ראשי keratinocytes האדם מן העור למבוגרים, כולל תחזוקה, הקפאה של keratinocytes. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לייצר ראשי keratinocytes אנושי שיכול לשמש כמודל ללמוד ביולוגיה עורית חוץ גופית בתוך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
האוסף של דגימות עור בריא מתנדבים בוגרים שעברו ניתוח פלסטי מחייב אישור מן הוועדה האתית במוסדות המארח. פרוטוקול זה אושרה על ידי אזורי אתית הוועדה של אזור Midtjylland, דנמרק (M-20110027). השיטה המתוארת כאן נגזר ממחקרים דומים על ידי. Maciaq et al. 10 ו ליו, Karasek11.
1. בידוד של Keratinocytes מהעור האנושי
- נתחיל בכך את הפתרונות הבאים: 50 מ ל תמיסת גלוקוז טריפסין, 0.1% 0.25% ב- DPBS. מיקס ומסנן לחטא (0.2 µm) הפתרון. הכינו 10 מ"ל של RPMI-1640 + 2% FBS פתרון, 50 מ של DPBS ותקין ללא סרום בינוני (KSFM). להוסיף 500 מ"ל של KSFM KSFM תוספי תזונה ו- 250 µL של gentamycin. לחמם את הפתרונות 37 ° C לפני השימוש.
- לאסוף עור בריא מתנדבים בוגרים שעברו ניתוחים פלסטיים. הדגימות העור בשימוש כ 10 ס"מ x 15 ס מ, אך יכול להשתנות בגודלו. שמור הקריר העור תחת תחבורה על ידי הובלת את העור הדגימות בקופסת קלקר המכילה קירור. במידת הצורך, דוגמית העור ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- להסיר שומן מן תחת המקטע העור באמצעות מספריים מעוקר, כמו מה, אזמל, מלקחיים.
- אבזם את המקטע העור (כ 10 ס"מ על 15 ס"מ) על כיסוי סטרילי על גבי צלחת באמצעות מחטים. ראשית, לנקות את העור עם כרית יבשה גאזה מעוקר. לאחר מכן לנקות את העור באמצעות כרית סטיריליים גזה עם 70% אתנול.
- באמצעות פלנר רגל, חתך של השכבה העליונה (האפידרמיס) של המקטע העור ושם אותו בתוך 9 ס מ פטרי. לאחר מכן, מיד להוסיף 25 מ של הפתרון DPBS/טריפסין/גלוקוז (להכין בשלב 1.1) צלחת פטרי. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- באמצעות פיפטה להסיר את הפתרון DPBS/טריפסין/גלוקוז הפטרי ולהוסיף 10 מ"ל של RPMI-1640 + 2% FBS כדי להשבית את טריפסין.
- באמצעות מלקחיים שני, עכשיו שחרר את התאים באפידרמיס לתוך האמצעי על ידי גירוד ובעדינות לזעזע את אפידרמיס והן תא עורי של הסעיפים העור.
- לסנן את המתלים תאים באפידרמיס דרך פילטר מתכת (גודל החור של 1 מ מ), ולאסוף בשפופרת 50 מ. להוסיף הסעיפים הנותרים העור שפופרת 50 מ ל המכיל 10 מ"ל של RPMI-1640 ללא FBS ו מערבולת למסנן ס' 10 ההשעיה דרך המתכת לסנן לתוך צינור 50 מ ל המכיל את המתלים תאים באפידרמיס. להוסיף DPBS הנפח הכולל של 50 מ.
- Centrifuge התליה תא 10 דקות ב g x 450 בטמפרטורת החדר.
- הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תאים באפידרמיס כ- 10 מ"ל של 37 ° C KSFM בהתאם לגודל בגדר התא. לספור את התאים באמצעות התכלת Trypan מכתים שיטת תחת מיקרוסקופ. מספר התאים המתקבל מקטע העור 10 ס"מ על 15 ס"מ הוא כ 50-100 x 106 תאים. את כל הבקבוק תרבות2 75 ס מ, העברת תאים6 8 x 10 יחד עם 12 מ של 37 ° C KSFM. ללחוץ בעדינות את המבחנות תרבות כדי להבטיח התפלגות אחידה של תאי.
- דגירה של keratinocytes ב חממה 37 ° C עם 100% לחות ו-5% CO2. לשנות את המדיום ואחרי יומיים שלוש פעמים בשבוע. מעבר תאים כאשר 70-80% confluent, אשר לוקח כשבועיים תלוי קצב התפשטות keratinocytes התרבות.
2. passaging של Keratinocytes
- מחממים את הכמות המתאימה של 0.05% טריפסין-EDTA לפתרון 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור. השתמש 4.5 מ של 0.05% טריפסין-EDTA פתרון עבור בקבוקון תרבות 75 ס מ2 .
- הסר בינוני את התאים, וכן להוסיף 4.5 מ ל/75 ס מ2 תרבות הבקבוק מראש חימם 0.05% פתרון טריפסין-EDTA לתאים. מקם את הבקבוקון תרבות בחממה (37 מעלות צלזיוס), לאחר כ 5 דקות, לבדוק תחת המיקרוסקופ אם התאים החלה התרופפות.
- כאשר כ- 50% של התאים יש השתחררו, פגע בעדינות את הבקבוק תרבות נגד היד כדי לשחרר את התאים הנותרים. לאחר מכן, כדי להשבית את טריפסין, להוסיף 6 מ של RPMI-1640 + 2% FBS (37 מעלות צלזיוס)2 . הבקבוק תרבות 75 ס מ, להעביר התליה תא צינורות 50 מ.
- לשטוף את המבחנות תרבות עם 3 מ"ל של RPMI 1640 + 2% FBS ולהוסיף הצינורות 50 מ ל. צנטריפוגה תאים עבור 10 דקות ב g x 450 בטמפרטורת החדר.
- Resuspend תאי pelleted 10 מ"ל של KSFM (37 מעלות צלזיוס). לספור את התאים ולהעביר 3 x 106 תאים בקבוקון תרבות 150 ס"מ2 יחד עם 20 מ של KSFM (37 מעלות צלזיוס). לנער בעדינות את הבקבוק תרבות כדי להבטיח התפלגות אחידה של התאים. להקפיא את התאים כאשר התרבות היא 80-90% confluent, אשר לוקח כ 4-6 ימים בהתאם קצב התפשטות keratinocytes (ראה סעיף 3, הקפאת פרוטוקול להלן). הרחב את keratinocytes ליצירת מניות קפוא המתאים.
3. הקפאת Keratinocytes
- מחממים את הכמות המתאימה של 0.05% טריפסין-EDTA לפתרון 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור. השתמש 9 מ של 0.05% טריפסין-EDTA פתרון עבור בקבוקון תרבות2 150 ס"מ.
- הסר בינוני את התאים, וכן להוסיף 9 מ ל/150 ס מ2 תרבות הבקבוק מראש חימם 0.05% פתרון טריפסין-EDTA לתאים. מקם את הבקבוקון תרבות בחממה (37 מעלות צלזיוס), לאחר כ 5 דקות, לבדוק תחת המיקרוסקופ אם התאים החלה התרופפות.
- כאשר כ- 50% של התאים יש השתחררו, פגע בעדינות את הבקבוקון תרבות נגד היד על מנת לשחרר את התאים הנותרים. לאחר מכן, כדי להשבית את טריפסין, להוסיף 12 מ של RPMI-1640 + 2% FBS (37 מעלות צלזיוס) הבקבוקון תרבות של2 ס מ 150, תשאף התליה תא ל 50 מ ל צינורות.
- לשטוף את המבחנות תרבות עם 6 מ של RPMI 1640 + 2% FBS ולהוסיף הצינורות 50 מ ל. Centrifuge צינורות 10 דקות ב g x 450-4 מעלות צלזיוס. הכן תא קר כקרח קפוא בינוני (KSFM + 10% דימתיל סולפוקסיד).
- Resuspend בגדר תא KSFM + 10% דימתיל סולפוקסיד לספור את התאים, הקפאת תאים על צפיפות של 6 x 106 תאים למ"ל באמצעות שיטות הקפאה קריוגנית קירור איטי תקן12.
- לאחסן את keratinocytes בחנקן נוזלי (אדי שלב) עד מוכן לשימוש.
4. מפשיר ו Culturing Keratinocytes קפוא
- במהירות להפשיר את הבקבוקונים קפוא המתאים באמבט מים 37 ° C. השתמש 70% אתנול לנקות את החלק החיצוני של cryovial. להעביר מספר מתאים של תאים (כ- 15,000 תאים/cm2) בקבוקון תרבות ולהוסיף מיד מדיום הגידול ומחוממת מראש (KSFM) הבקבוקון תרבות.
ניתן להשתמש בכל גודל של תרבות מבחנות בהתאם הכיוונון של הניסוי. - השתמש בינוני תרבות 5 מ"ל בקבוקון תרבות2 25 ס מ.
הערה: הנתונים שלנו הראו כי בממוצע 95% של תאים מבודדים באמצעות פרוטוקול המתוארים כאן הם חיוביים עבור cytokeratine-14 תקין-מרקר13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סידן-induced התמיינות סופנית
Keratinocytes האדם עוברים התמיינות סופנית בעת טיפול עם סידן14,15,16. ראשי keratinocytes האנושי היו מבודדים ותרבותית כמפורט בפרוטוקול לעיל. כאשר כ 50-60% confluent, התאים היו מגורה עם סידן (1.2 מ מ) או הרכב ותמונות של התאים צולמו ביום 0, 1 ו- 2. איור 1 מציג את השינויים מורפולוגי של keratinocytes שנצפו על גירוי סידן.
הביטוי של Involucrin הוא גדל על גירוי סידן
בתרבית keratinocytes האנושי היו בוגרים עד כ 50-60% confluent אחרי אשר התאים היו מגורה עם סידן (1.2 מ מ) או כלי רכב עבור 24 ו 48 שעות. להדגים כי במקביל הבידול מוגבר של התאים כפי שנצפה על ידי שינויים מורפולוגיים של keratinocytes, הביטוי mRNA של involucrin סמן הבידול גדל באופן משמעותי על גירוי סידן. לאחר 24 ו-48 שעות של גירוי, הביטוי mRNA involucrin היה גדל כ 5.5-fold, 3.5-fold, בהתאמה, לעומת רכב (איור 2).
IL-1β-induced זירחון של p38 MAPK
כדי לקבוע אם keratinocytes אנושית מבודדת היו מגיבים בהשפעת ציטוקינים הפעלת איתות המסלולים תאיים, keratinocytes בתרבית היו מגורה עם איל-1β (10 ng/mL) עבור נקודות זמן שונות. בתוך 5 דקות, IL-1β גירוי הובילו זירחון/הפעלה מהירה של p38 MAPK, כפי שנקבע על ידי סופג המערבי. לאחר 1 h, IL-1β-induced p38 MAPK זרחון חזר לרמה הבזליים (איור 3). רק הצורה phosphorylated של p38 MAPK היה גדל, כמו IL-1β גירוי לא השפיע על רמת החלבון הכולל p38 MAPK (איור 3).
איור 1 : להחליפן בתמונות של סידן-induced התמיינות keratinocytes של. בתרבית keratinocytes האדם העיקרי היו מגורה עם הרכב (dH2O) או סידן (1.2 מ מ) על הנקודות הזמן שצוין. (A - E) שלב תמונות חדות של keratinocytes ביום 0 (A), יום 1 (B ו- C), וביום 2 ( Eו-D ) לאחר גירוי סידן. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : עלה הביטוי mRNA של involucrin על גירוי סידן. סידן (1.2 מ מ) או רכב (dH2O) נוספה בתרבית keratinocytes אנושי ראשוני על הנקודות הזמן המצוין (n = 3). RNA היה מבודד, הביטוי של involucrin סמן הבידול נותחו על ידי qPCR. RPLP0 הביטוי (Ribosomal חלבון גדול P0) mRNA שימש נורמליזציה. תוצאות לייצג זאת אומרת ± ש בין 3 ניסויים שונים. p < 0.05 לעומת הרכב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : IL-1β-induced זירחון של p38 MAPK. בתרבית keratinocytes האדם העיקרי היו מגורה עם הרכב (PBS + 0.15% BSA) או איל-1β (10 ng/mL) על הנקודות הזמן שצוין. תמציות חלבונים היו מבודדים מערבית סופג וניתוח למדידת רמת phosphorylated p38 MAPK, סה כ p38 MAPK. טעינת שווה אומתה על ידי דגירה עם נוגדן anti-β-אקטין. מוצגים נתונים מהניסוי נציג אחד מתוך שלושה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו נתאר כיצד לבודד בקלות keratinocytes האדם העיקרי מן העור למבוגרים, וכיצד תרבות אותם במבחנה. מודל זה יכול להיות יישום נרחב לחקירה של ביולוגיה של התא עוריות ולאחר יכול להיות שימושי עבור מהחוקרים המעוניינים ללמוד מחלות עורית.
חלק מהיתרונות של הפרוטוקול המתואר כאן הוא בניגוד keratinocytes מבודד מן העורלה neonatal המתקבל זכרים היילוד שעברו ברית מילה, keratinocytes האדם העיקרי של חולים מבוגרים הם מבודדים מן גברים ונשים כאחד ולכלול שנים ≥18 בכל גיל. לכן, המגוון הביולוגי הוא הרבה יותר גדול בתאים אלה לעומת keratinocytes מן העורלה neonatal. יתר על כן, ניתן להשיג חתיכות גדולות יחסית של דגימות עור בחולים שעברו ניתוחים פלסטיים, כגון ניתוח הקטנת שדיים או ניתוח הרזיה.
כפי שהוזכר לעיל האפידרמיס מאורגן המתאים לשלב ספציפי התמיינות keratinocytes שכבות שונות. כדי שיוכל ללמוד ביולוגיה העור, המודל המתואר כאן הוא מוגבל על ידי חוסר microenvironment תלת מימדי. הרבדים השונים של האפידרמיס, כמו גם את סוגי תאים שונים המצויים בעור הם לא חיקה במודל זה. כדי להתגבר על זה, דוגמניות שוות ערך העור האנושי יכול לשמש, אשר מורכב של האפיתל מרובה שכבות היכן keratinocytes להבדיל עם חשיפה לממשק אוויר נוזלי, וכך, יותר מקרוב מחקה את האפידרמיס יליד17, 18,19. מודל נוסף אשר ניתן להשיג על מנת ללמוד ביולוגיה העור הוא שמחוץ העור הדגם, בו נשמרים ביופסיות העור בתרבויות ב לאטמוספרה אוויר נוזלי כמו שתואר לעיל20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. המחבר יש אין ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
המחבר מבקש להודות אנט Blak רסמוסן, קריסטין מולר התמיכה הטכנית שלהם
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | - |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | - |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | - | - | Forceps from any company can be used |
| Scissors | - | - | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | - | - | - |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | - | - | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | - |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | - |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
References
- Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J.
- Nickoloff, B. J., Turka, L. A.
- Fuchs, E., Raghavan, S.
- Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
- Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G.
- Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
- Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
- Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
- Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
- Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
- Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
- Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).
- Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
- van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
- Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).
