Summary
Основной целью данного исследования является для стандартизации и проверить метод пневматические (воздуха зачистки) сбора яиц в радужной форели и форель. Этот метод позволяет просто и эффективно сбора яиц без необходимости массаж живота рыбы.
Abstract
Яйцо коллекция является одной из самых важных процедур во время размножения рыб лососевых инкубаториев. Классические методы связаны с использованием ручной массаж на животы рыбы высылать яйца. Альтернативный метод использует давление газа, вводят в полость тела, что приводит последующего выпуска яиц. Считается, что этот метод является менее негативное воздействие на благополучие и яйцо качество broodstocks. Здесь мы сравниваем результаты воздуха и ручной зачистки методы в отношении один год выживания и яйцо количества и качества в двух лососевых рыб, радужной форели (Oncorhynchus mykiss) и кумжа (Salmo trutta Морфа fario). Наши результаты показывают, что воздух зачистки дали лучшее качество яиц и выше один летняя выживаемость в радужной форели. Кроме того, зачистки воздуха привело к ниже показателя смертности в группе подвергается ручной зачистки (25% против. 35%). Уровень pH и штриховка рука лишил группы был ниже, чем те из воздуха лишил группы. В случае форель качество яиц, полученные как ручной, так и воздуха зачистки методы был похож; Однако один год потери рыбы были выше в раздели авиагруппы (15% по сравнению с 0% в руки раздели рыбы). Хотя преимущества воздуха, зачистки метод над ручной зачистки с точки зрения качества яиц может не соблюдаться в всех лососевых видов, воздух зачистка процедура может быть многообещающим вариантом должен быть принят в инкубаторах, как он обеспечивает высокий уровень воспроизводимости и эффективности.
Introduction
И радужной форели (Oncorhynchus mykiss), кумжа (Salmo trutta Морфа fario) принадлежат к семейству лососевых ихтиологии1. Производство этих двух видов в мирового аквакультурного приобрела быстрого роста, вследствие их коммерческого и рекреационного значения. В Польше производство лососевых рыб составляет около 20 000 тонн, с радужной форели, будучи доминирующим видом. С другой стороны ручьевая форель представляет источник основных ресурсов пресноводных рыб в Европе из-за его коммерческую ценность в области аквакультуры и важность для ловли. Во многих водных экосистемах существование кумжа население находится под угрозой. В результате Искусственное воспроизводство был применен для пополнения местного населения этого вида2.
Ручьевая форель и радужная форель достигает половой зрелости обычно в возрасте трех лет, с самцами, созревания на год раньше, чем самки1. В искусственных условиях яйца и спермы и радужная форель ручьевая форель обычно собираются нежный массаж живота. На практике, в небольших масштабах зачистки ручной метод сбора яиц является экономически эффективным. Однако в больших масштабах, метод ручной зачистки может быть трудоемкой и изнурительной. В результате этот метод может привести к сломанной яиц из-за усталости Хатчери работников. Обрыв яиц часто приводит к снижению рН яичников жидкости и выпуск яичного желтка, оба из которых негативно сказаться на оплодотворение яйца3. Кроме того этот традиционный метод сбора яиц (неоднократно нажимая живота) может также привести к broodstock смертности, вызванной инфекции кожи, связанные с ухудшением защитный барьер слизи.
Пневматический метод сбора яиц был впервые использован в Австралии в 19574. Метод основан на инъекции газы (воздух, азот или кислорода) в полость тела высылать яйца с помощью давления газа. Это быстрый и простой метод успешно применяется в лососевых рыб без каких-либо негативных побочных эффектов на рыб4. Недавно этот метод был использован в диких видов (щука, Esox lucius) собрать Зрелые яйца в искусственные условия5. Было показано, что воздуха раздели яйца выше оплодотворение и инкубационные ставки по сравнению с ручной раздели яйца, независимо от решения, используемых для оплодотворения (раствор Woynarovich, Billard буфер или инкубатор воды)5.
Основной целью данного исследования было для тестирования метода пневматические (воздуха зачистки) сбора яиц в радужной форели и форель по сравнению с традиционной ручной зачистки метод. Эффективность обоих методов (объем полученных яйца) и время сбора, качество гамет (яичников жидкости рН), а также штриховки и после нереста смертности были сопоставлены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры были проведены в соответствии с местным комитетом по этике животных эксперименты в Ольштыне, Польша.
1. Подготовка оборудования
- Используйте шприц и игла для инъекций газа в полость тела рыбы.
- Установите давление газа на 0,5 бар и поддерживать это давление, чтобы быть ниже 1 бар во всем.
- Контроль потока воздуха. Для лососевых рыб 1,5 Л/мин является наиболее эффективным скорость истощения газа. Поддерживать оптимальную скорость, потому что выше скорость не может получить все яйца в то время как медленнее скорость может излишне затягивать процедуру.
- Подключите шприц с иглой резьбовой (0,8-1,2 мм диаметр) чтобы избежать иглы отряда, вызванные давление газа.
2. Воздушный нереста
- Анестезировать рыба с 0,2% Propiscin. Место рыбы в водяной бане с 0,2% Propiscin и ждать, пока рыба перестает отвечать на запросы.
- Тщательно высохнуть перед нерестом, вытирая сухой хлопчатобумажной тканью.
- Место рыбы на наклонной кровать о 35-40°, на ее стороне стороне хвоста вниз. С мягкий толчок брюшко рыбы проверьте поток яйцо из половых путей. Если яйца не присутствуют, рыбы не должны быть породил.
- Поместите контейнер с сеткой ниже соска рыбу собирать яйца.
- Быстро Вставьте иглу ниже брюшной плавники.
- Свободно удалите яйца, газ до тех пор, пока только сингулярных яйца удаляются из тела рыбы.
- Нежно массируйте живот, чтобы удалить излишки газа из тела рыбы.
- После нереста, мягко передавать рыбы танк с потоком воды. Рыба, выпущен в бак после нереста воздуха может первоначально плавают на поверхности воды. После нескольких минут рыба выпускает оставшийся газ во время купания и начинает плавать нормально.
Примечание: Полученные яйца очень чистой и свободной от заражения крови или Кале.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Самцов и самок радужной форели (возраст 2 +, 1700 ± 328 g) и кумжа (возраст 3 +, 1900 ± 435 g) были получены из лососевых рыбопитомник (Рутки Żukowo, внутреннему рыболовству институт в Ольштыне, Польша). Мужчины и женщины были размещены в отдельных резервуаров объемом около 5 м3. Температура воды была 12±1 ° C. До манипуляции, рыбы были под наркозом с 0,2% Propiscin. Рыбы были разделены на две группы. Часть из них прошел традиционный метод, чтобы получить яйца, т.е. внутрибрюшного давления (n = 20). Остальные группы прошла пневматические процедуру с использованием воздуха (n = 20). Яйца от каждой девушки были собраны отдельно и помещены в сухой пластиковый мисках.
Во время ручной зачистки из яиц рыбы был сначала протереть сухой тряпкой удерживая рыбу на ее стороне, хвост. Продолжительность нереста была измерена, начиная с точки, где оператор держит рыбу и либо, начать нажав живота или инъекционные иглы. Конечная точка была установлена в то время, когда яйца остановить течь в миску. Для ручной зачистки один квалифицированный работник был выбран для проведения всего эксперимента, и воздух, зачистка процедура осуществлялась другого квалифицированного работника.
Во время процедуры объем полученных яйца была измерена с помощью измерительного цилиндра и яичников жидкость была собрана отдельно от каждой женской особи. После этого ее уровень pH была проанализирована с помощью рН электрода. Broodstock рыбы, используемые в наших экспериментах были отмечены с пассивной комплексной транспондер (Пит) Теги. Пометки позволил нам наблюдать смертности в каждой группы рыб.
Сразу же после сбора каждый образец был подвергнут оплодотворения. Спермы для оплодотворения собрали около 10 минут до для нереста и хранятся разводят в Morisawa раствор6 (0,1 М NaCl, 0.04 M KCl, CaCl 0,003 М2, 0,0015 М MgCl2 x 6 H2O, 0,05 М трис, рН 8,5), в соотношении 1:9 в 4 ° C. Смесь сперматозоиды, полученные из четырех радужной форели или форель мужчины использовался соответственно.
Так как штриховки скорость является наиболее целесообразной мерой качества яиц, радужная форель и коричневые яйца полученные от руки и пневматические зачистки методы были подвергнуты оплодотворение. Яйца были оплодотворенные спермой около 100000 на яйцо, используя около 100 яиц от каждого породил девушки. Концентрации спермы были измерены в зале Bürker, после того, как были спермы решения разреженных 1:2000 с 0,7% NaCl. Яйца были оплодотворены спермой в 5 мл раствора Billard (0,125 М NaCl, 0,002 М трис-буфер, 0,003 М глицин и 0,001 мм2CaCl, рН 9,0) для каждого варианта7. Две параллельные мероприятия были выполнены для каждой выборки яиц. Три минуты после оплодотворения, яйцо образцы были тщательно промывают дважды в инкубатор воды. Затем яйца были помещены в специальные сетки, размещения каждого экспериментальный вариант отдельно. Оплодотворенные яйца были помещены в инкубаторы на 8 ° C, и количество яиц, глазами было установлено приблизительно через четыре недели. Доля что вылупившихся яиц также определяется по формуле: (яйца, которые были оплодотворены x 100%) / (все яйца в конкретный вариант).
Различия между экспериментальные методы лечения были определены с парными t тесты на уровень значимости P < 0,05. Данные, выраженные как процент был преобразован с помощью преобразования дуги грех перед статистического анализа. Статистические анализы были проведены с GraphPad Призма программного обеспечения.
Продолжительность яйцо коллекции вручную зачистки метод был короче (приблизительно 10 s.) по сравнению с воздуха, зачистки метод в обоих видов (рис. 1; P < 0,05). Методы (традиционные или пневматические) зачистки не имеют влияние на объем яйца, полученные от самки коричневая озёрная форель и радужная форель (рис. 2). Яичников жидкости рН в радужной форели после ручной зачистки 7.6, в то время как в воздухе, зачистки метод, pH было увеличено до 8.0 (рис. 3; P < 0,05). Однако, независимо от методов сбора яиц, яичников жидкости рН в форель был неизменным (рис. 2). В радужной форели уровень штриховки был значительно выше (рис. 4; P < 0,05) в воздух лишен яиц, чем в руку раздели яйца. Процент смертности был выше после ручной зачистки по сравнению с воздуха, зачистки в радужной форели. Однако в ручьевой форели, процент смертности был выше (15%) в воздух лишен яиц, чем в руку раздели яйца (Таблица 1).
Рисунок 1 . Время зачистки после традиционной (ручной зачистки) и пневматические (воздуха зачистки) метод сбора яиц в радужной форели и ручьевая форель. Статистическая значимость обозначается звездочками, представляющая P-значение (*** P < 0,001), погрешностей указывают SD (n = 20). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Объем яиц полученной после традиционной (ручной зачистки) и пневматические (воздуха зачистки) методы сбора яиц в радужной форели и ручьевая форель. Планки погрешностей указывают SD (n = 20). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Яичников жидкости рН после традиционной (ручной зачистки) и пневматические (воздуха зачистки) методы сбора яиц в радужной форели и ручьевая форель. Статистическая значимость обозначается звездочками, представляющая P-значение (*** P < 0,001), погрешностей указывают SD (n = 20). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Процент ставки штриховкой после традиционной (ручной зачистки) и пневматические (воздуха зачистки) методы сбора яиц в радужной форели и ручьевая форель. Статистическая значимость обозначается звездочками, представляющая P-значение (** P < 0.01)., погрешностей указывают SD (n = 20). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Виды | Метод сбора яиц | |
| Ручной зачистки | Кондиционер зачистки | |
| Радужная форель | 35 | 25 |
| Ручьевая форель | 0 | 15 |
Таблица 1. Процент смертности после нереста после традиционной (ручной зачистки) и пневматические (воздуха зачистки) методы сбора яиц в радужной форели и форель, как измеряется за один год.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Пневматический метод сбора яиц из рыбы, хотя больше времени, чем традиционный метод (ручной зачистки), может обеспечить высокое качество зрелой яйцеклетки (эта работа). Это связано с низким риском механического разрушения яйца при применении этой процедуры. Высокий рН в яичнике жидкости, а также увеличение коэффициента оплодотворения, свидетельствуют о полезности пневматический метод. В целом воздуха, зачистки метод сбора яиц в воспроизводство рыб может быть многообещающим вариантом с точки зрения стандартизации протоколов Хатчери, как их успешное применение не связанных с ручной мастерства операторов.
Хотя нереста воздуха, как представляется, автоматический вариант, мы обнаружили, что это может занять больше времени, чем ручной нереста. Эта разница в продолжительности может быть очевидной, особенно когда Хатчери опытных работников применять процедуры, ручной зачистки. Однако, следует отметить, что продолжительность нереста с использованием давления воздуха по-прежнему удовлетворительно; около 20 секунд на рыбу. Кроме того эффективность этого метода зависит от не рабочие опыт, как в случае с ручной зачистки метод.
Хотя мы не наблюдали любые различия между томами полученных яиц, различия в рН яичников жидкости были очевидны в случае радужной форели. Этот эффект был наиболее вероятно, связано с Разбитые яйца, как pH, является хорошим показателем этого явления3. Неоплодотворенные яйца более подвержены механической травмы и их увеличение сопротивления после активации яйцо во время закаливания времени8. Неоплодотворенные яйца сломанной отвечают за более низких ставок оплодотворения в лососевых рыб, как сообщалось в других местах. Таким образом должна быть максимальная осмотрительность во время сбора яиц. Наши данные показывают, что неоплодотворенных яиц радужной форели слабее, чем яйца ручьевую форель. Икринки радужной форели, собранные ручной зачистки были ниже рН и штриховка по сравнению с результатами, полученными путем удаления воздуха. Это не был замечен в случае форель. Наши эксперименты показывают, что для лососевых видов с мягкие яйца, воздух зачистка процедура может быть полезным с точки зрения после нереста качества.
Индивидуальные смертности broodstock после нереста всегда видна в инкубаторах лососевых рыб. Однако их появление связано с индивидуального состояния и состояния здоровья рыб. Зачистки воздуха, как представляется, быть мягкий метод сбора яиц, как там было не гибели кожи слизь, важный барьер против патогенов из воды. Несмотря на тот факт, что мы не наблюдали любой после нереста смертности (в течение одного месяца от нереста) целый год наблюдения показали некоторые теряет рыбы. В случае радужная форель мы наблюдали, что около 10% выше потерь в руке лишил группы, в то время как в ручьевой форели, зачистки воздуха привели к смертности 15% за год. Мы можем предположить, что воздух зачистки может быть более выгодным для радужной форели, чем ручьевая форель с точки зрения качества яиц и общей смертности broodstock.
Хотя воздуха зачистки выгодно икринки радужной форели, но не ручьевая форель, мы предлагаем, что эта процедура может быть более стандартизированы по сравнению с ручной зачистки процедуры. В воздухе зачистки давление, применяемое в брюшную полость рыб является единственным фактором, который влияет на качество и количество зрелой яйцеклетки получены. Использование этого метода в инкубаторах снижает потери лосося яйца, которые главным образом возникают в результате Разбитые яйца11. Поскольку никаких специальных навыков требуется для выполнения процедуры удаления воздуха, мы ожидаем, что аналогичные количество и качество яиц может быть получено как Хатчери квалифицированные и неквалифицированные рабочие. Мы рекомендуем воздуха зачистка процедура как перспективный вариант для новых инкубаторов, ищет процедура сбора яиц характерны высокий уровень воспроизводимости и эффективности, а также мало или нет опыта операторами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Представлены исследования был поддержан проект «пневматический метод зачистки рыбы - возможного применения, влияние на гамет качества и количества и благополучия рыбы» (акроним: PNEUFISH) финансируемых «оперативной программы развития рыбного хозяйства Сектор и прибрежных районах 2007 - 2013 годы» (OR-61724-OR1400001/10), средств, ассигнованных институт репродукции животных и продовольствия исследований Польской академии наук, Ольштын, Польша и поддерживать стоимость бюро (продовольствие и сельское хозяйство стоимость действий FA1205: AQUAGAMETE ). Мы хотели бы поблагодарить, Стэнли Савельева Угву за огромную поддержку в английском редактирования. Мы хотели бы также признать производителей анимации «Studio Filmowe Ruchome Obrazki».
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycine pure P.A. | AVANTOR | 527560117 | sperm activating buffer |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | sperm activating buffer |
| Sodium chloride Bioreagent | Sigma Aldrich | S5886 | sperm activating buffer |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma Aldrich | C4901 | sperm activating buffer |
| Propiscin (0.2% etomidate solution) | IRS Olsztyn, Poland | not indicated | |
| compressor | Thomas Sheboigan WI USA | DT/SR 070800001882 | |
| reduction valve | Camozzi | cRJUS U7J | |
| air hose | ZEC T.P.U. | SH.98 | |
| syrgine | EFD | 7012118 | |
| Air spawning stage | Biopasz, Poland | PNEU001 | |
| Orion Ross Ultra electrode | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 8102BNUWP |
References
- Nelson, J. S. Fishes of the World. , 4th, JohnWiley and Sons, Inc. Hoboken, NJ, USA. (2006).
- García-Marín, J. L., Sanz, N., Pla, C. Proportions of native and introduced brown trout in adjacent fished and unfished Spanish rivers. Conservation Biology. 12, 313-319 (1998).
- Dietrich, G. J., Wojtczak, M., Slowinska, M., Dobosz, S., Kuzminski, H., Ciereszko, A. Broken eggs decrease pH of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) ovarian fluid. Aquaculture. 273, 748-751 (2007).
- Zurbuch, P. E. A structure for easy fish recovery during drainage of an impoundment. Progressive FishCulturist. 27, 237-238 (1965).
- Cejko, B. I., et al. Effects of different stripping methods of female and activation medium on fertilization success in northern pike (Esox lucius). Czech Journal of Animal Sciences. 10, 481-486 (2016).
- Morisawa, S., Morisawa, M. Induction of potential for sperm motility by bicarbonate and pH in rainbow trout and chum salmon. Journal of Experimental Biology. 136, 13-22 (1988).
- Billard, R., Cosson, J., Perchec, G., Linhart, O. Biology of sperm and artificial reproduction in carp. Aquaculture. 129, 95-112 (1995).
- Iuchi, I., Ha, C. R., Sugiyama, H., Nomura, K. Analysis of chorion hardening of eggs of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Development Growth and Differentiation. 38, 299-306 (1996).
- Wojtczak, M. A., Kowalski, R. K., Dobosz, S., Goryczko, K., Kuźminski, H., Glogowski, J., Ciereszko, A. Assessment of water turbidity for evaluation of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) egg quality. Aquaculture. 242, 617-624 (2004).
- Tabrizi, E. N., Khara, H., Nezami, S. A., Lorestani, R., Shamspour, S. Broken Eggs Influence on Fertilization Capacity and Viability of Eggs, Turbidity and pH of Ovarian Fluid and Fertilization Water in the Endangered Caspian Brown Trout, Salmo Trutta Caspius. International Journal of Biology. 3 (1), 161-166 (2011).
- Carl, G. C. Beware of the broken egg! A possible cause of heavy losses of salmon eggs. Progresive Fish-Culturist. 53, 30-31 (1941).
