זרימת עבודה אוטומטית למחצה מוצג עבור רצף יישוב של rRNA מטוסי אף-16 מ חלב וסוגים אחרים של הדגימה נמוך-ביומסה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחקרים של קהילות מיקרוביאלי הפכו נרחבת עם הפיתוח של רצפי התפוקה יחסית זול, מהיר וגבוה. עם זאת, כמו עם כל הטכנולוגיות הללו, תוצאות לשחזור תלויות שזרימת עבודה במעבדה משלבת אמצעי הזהירות המתאימים ופקדים. דבר זה חשוב במיוחד עם דגימות נמוך-ביומסה איפה לזיהום חיידקי ה-DNA ניתן להפיק תוצאות מטעות. מאמר זה מפרט זרימת עבודה אוטומטית למחצה כדי לזהות חיידקים מדגימות חלב בשד האנושי באמצעות רצף יישוב של אזור V4 ribosomal RNA (rRNA) 16 בסולם נמוך - עד אמצע - throughput. הפרוטוקול מתאר הכנת הדוגמא של חלב מלא כולל: לטעום פירוק, חילוץ חומצת גרעין, הגברה של אזור V4 של מטוסי אף-16 rRNA ג'ין, וכן ספריית הכנה עם אמצעי בקרה. חשוב, הפרוטוקול ואת הדיון לשקול סוגיות שאינן בולטות הכנה, ניתוח דוגמאות נמוך-ביומסה לרבות הפקדים המתאימים חיוביים ושליליים, הסרת המעכב PCR, דוגמת זיהום על ידי הסביבה, מגיב, או מקורות ניסיוני, ושיטות עבודה מומלצות ניסיוני, שנועדו להבטיח הפארמצבטית. בעוד הפרוטוקול כפי שמתואר ספיציפית דגימות חלב, זה יכולת הסתגלות רבים סוגי דגימה ביומסה נמוכה ולא גבוהה, כולל דוגמאות שנאספו על דגימות, קפוא מסודר, או התייצב במאגר שימור.
מבוא
הקהילות אותן מיקרוביאלי לישוב בני האדם מאמינים כי חשובה ביותר לבריאות האדם ומחלות המשפיעים על חילוף החומרים, פיתוח המערכת החיסונית, נטייה למחלות, תגובות חיסון התרופות, טיפול1, 2. מאמצים כדי להבין את השפעת microbiota על בריאות האדם כיום מדגישים את הזיהוי של מיקרובים המשויכות מוגדרים תאים אנטומיים (כלומר, עור, בטן, אוראלי, וכו '), כמו גם אתרי מקומי בתוך אלה3,תאים4. המאמצים האלה החקירות לגורם המרכזי עליו מושתתת היא התפתחותה המהירה של נגישות מוגברת של טכנולוגיות הדור הבא רצפי (הגדרות) המספקים פלטפורמה בנפט במקביל לניתוח של התוכן הגנטי מי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
עבור כל פרוטוקול השלבים, חובה ללבוש ציוד מגן אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי), גישות למניעת זיהום מחמירים צריכים להילקח. לבחון את זרימת העבודה מן קדם הגברה לעבוד אזורים לאזורים הגברה שלאחר עבודה כדי למזער את הזיהום של דגימות. כל ציוד המשמש הן סטרילי, ללא RNase, DNase, ה-DNA ו- pyrogen. כל הטיפים פיפטה מסוננים. תרשים זרימה של המדרגות פרוטוקול מסופק (איור 1).
1. מדגם פירוק
הערה: פירוק מדגם והפקת חומצת גרעין מבוצעות באמצעות ערכת חילוץ DNA/RNA בסביבת חדר נקי איפה פקדים הנדסה והן פרוצדורלי במקום כדי למזער את ההקדמה של חיידקים סביבתיים הדגימות.
- הכנת שטח עבודה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול המוצג כאן כולל שלבים חשובים בקרת איכות (QC) כדי להבטיח כי הפגישה נתונים שנוצרו ובחינות עבור פרוטוקול בקרת רגישות, ירידה לפרטים, זיהום. הצעד הראשון של הפרוטוקול QC בעקבות PCR הגברה של אזור V4 16 (איור 2). µL אחד של מוצר ה-PCR של כל מדגם נותחה על ידי אלקטרופורזה לאשר שזה היה בטווח גודל הצפוי של 315-450 bp (איור 2, חץ אדום). דגימות חלב שנוצר כמויות נמוכות של מוצר מסוים (איור 2A, מסלולים להשוות .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
רצף יישוב הדור הבא של מטוסי אף-16 rRNA היא טכניקה בשימוש נרחב, מהיר microbiome אפיון18. עם זאת, גורמים רבים, כולל אפקטים אצווה, זיהום סביבתי, זיהום, לדוגמה, רגישות הפארמצבטית יכול להשפיע לרעה להשפיע על תוצאות הניסוי, וחיסול7,שלהם פרשנות19 , 20. להקל הכי חזקים 16 ניתוחים, זרימות עבודה microbiome עליך לשלב עיצוב ניסיוני טוב, את השימוש הפקדים המתאימים, היבדלות של שלבים בזרימת עבודה, ויישום של שיטות עבודה מומ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
ברצוננו להודות Helty Adisetiyo, PhD, Shangxin יאנג, PhD לפיתוח של הפרוטוקול. הכוללת תמיכה עבור הבינלאומי אימהי בילדים מתבגרים איידס קליניים ניסויים קבוצה (IMPAACT) סופק על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) של במכון הלאומי של בריאות (NIH) תחת מספרי פרס UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC), UM1AI106716 (IMPAACT LC), עם השתתפות במימון המכון הלאומי יוניס קנדי שרייבר של ובריאות הילד והתפתחות האדם (NICHD), את נבחרת המכון לבריאות הנפש (NIMH). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של NIH.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ערכת מיני AllPrep RNA / DNA | Qiagen | 80204 | ערכת מיצוי DNA / RNA |
| Eliminase | Fisher Scientific | 435532 | RNase, DNase, DNA decontaminant |
| Thermo Mixer | Fisher Scientific | מבוקר טמפרטורה | |
| מערבולת מאגר RLT בתוספת | Qiagen | 1053393 | גואנידיניום תיוציאנט מאגר ליזה / חלק מערכת |
| Allprepß-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | ß-ME הוא חומר מפחית שיפגע באופן בלתי הפיך ב-RNases על ידי הפחתת קשרי דיסולפיד |
| LME חרוזים | MP ביו-רפואיים | 116914050 | צינור חרוזים |
| QIAgen TissueLyzer | Qiagen | 85300 | סט מתאם משבש דגימה אוטומטי |
| QIAמגרסה עמודה | Qiagen | 79654 | |
| צינור מיקרוצנטריפוגה של יצרן | |||
| QIAcube וכלי פלסטיק קשורים | Qiagen | 9001292 | מכשיר טיהור DNA |
| אוטומטי יציאת DNA בתוספת | Applichem | A7089 | פתרון טיהור לא אנזימטי |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | מאגר פליטה |
| QIAgility וכלי | פלסטיק קשוריםQiagen | 9001532 | רובוטי מטפל בנוזלים |
| PCR מים | MO BIO | 17000-5PRIME | |
| HotMasterMix | Quantabio | 2200400 | |
| פריימרים הפוכים ברקודים | Eurofin | No Catalog # | תוכנן והוזמן |
| 96 באר PCR צלחת | ארה"ב מדעי | 1402-9708 | |
| Tapestation 2200 וכלי | פלסטיק קשורים | מנתח שברי DNA/RNA אוטומטי | G2964AA |
| ריאגנטים D1000 עבור Tapestation | Agilent | 5067-5585 | מאגר דגימה וסולם הם חלק מערכה זו |
| ערכת הסרת מעכבי OneStep PCR Zymo | Research | 50444470 | הסרת מעכבי PCR נעשית לפי הוראות היצרן. |
| ערכת טיהור PCR QIAquick | Qiagen | 28104 | ערכת ניקוי DNA: טיהור מבוסס קרום סיליקה של מוצרי PCR |
| Qubit dsDNA HS ערכת בדיקה | Thermo Fisher | Q32854 | מאגר דילול וצבע מבוססי דימתיל-סולפוקסיד הם חלק מערכה זו. |
| קיוביט פלואורומטר | תרמו פישר | Q33216 | |
| NanoDrop | תרמו פישר | ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח | |
| MiSeq 300 V2 ערכת | Illumina | 15033624/15033626 | |
| MiSeq | Illumina | No Catalog | #'s Next Generation Sequencer |
מקורות
- Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolite....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
