Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

人乳样品靶向16S 测序方法的研究

Published: March 23, 2018 doi: 10.3791/56974
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, University of California at Los Angeles

Summary

提出了一种半自动化工作流, 用于从人乳和其他低生物量样品类型中进行 16S rRNA 的目标排序。

Abstract

随着相对便宜、快速和高吞吐量测序的发展, 微生物群落的研究变得越来越普遍。然而, 与所有这些技术一样, 可重现的结果取决于实验室工作流, 其中包含适当的预防措施和控制。这是特别重要的低生物量样本, 污染细菌 DNA 可以产生误导的结果。本文详细介绍了一种半自动的工作流程, 即使用16S 核糖体 RNA (rRNA) V4 区域的目标测序, 在低到中吞吐量范围内, 识别出人类母乳样本中的微生物。该协议描述了从全牛乳样品的制备方法, 包括: 样品裂解、核酸提取、16S rRNA 基因 V4 区的扩增和质量控制措施的库准备。重要的是, 该议定书和讨论考虑了对低生物量样品的制备和分析具有显著意义的问题, 包括适当的阳性和阴性对照、PCR 抑制剂去除、环境样品污染、试剂或实验源和实验性最佳实践, 旨在确保重现性。虽然所描述的议定书是特定于人乳样本, 但它适用于许多低和高生物量样本类型, 包括收集在拭子上的样本, 冷冻整齐, 或稳定在保存缓冲区。

Introduction

殖民人类的微生物群落被认为对人类健康和疾病影响新陈代谢、免疫发展、对疾病的易感性以及对疫苗接种和药物治疗的反应至关重要1, 2. 为了解微生物群对人类健康的影响而作出的努力目前强调识别与定义的解剖隔间 (即、皮肤、肠道、口腔、等) 相关的微生物, 以及内部的本地化站点。这些舱室3,4。这些调查工作的基础是迅速出现并增加了下一代测序技术的可获得性, 为样品的微生物遗传量 (微生物) 分析提供了一个大规模的并行平台。对于许多生理样本, 相关的菌群既复杂又丰富 (即, 大便), 但对于一些样本, 微生物群是由低生物量 (即, 人乳, 下呼吸道) 所代表的, 其中敏感度、实验性文物和可能的污染成为主要问题。微生物研究和适当实验设计的共同挑战是多个评论文章的主题5,6,7,8。

本文介绍了一种基于 rRNA 16S V4 区域9的目标测序的鲁棒实验管道, 以表征人乳的微生物群。微生物菌群分析的人奶不仅是复杂的先天低生物量的10, 但另外由高级别的人类 DNA 背景11,12,13,14和PCR 抑制剂的潜在结转15,16在提取的核酸。该协议依赖于商业上可用的提取工具包和半自动平台, 可帮助最大限度地减少样本准备批次之间的可变性。它包含了一个定义良好的细菌模拟社区, 它与样品一起处理, 作为质量控制来验证协议中的每一步, 并提供一个独立的管道健壮性度量。虽然所描述的协议是特定于人乳样本, 它很容易适应其他样本类型, 包括大便, 直肠, 阴道, 皮肤, 晕和口服拭子10,17, 并可以作为一个起点希望进行微生物分析的研究人员。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

对于所有的协议步骤, 必须佩戴适当的个人防护设备 (PPE), 并需要采取严格的防污染措施。观察从预放大工作区到放大后工作区域的工作流程, 以尽量减少样品的污染。所有使用的用品是无菌的, 没有 RNase, DNase, DNA 和热原。所有吸管提示都被过滤。提供了协议步骤的流程图 (图 1)。

1. 样品裂解

注: 样品裂解和核酸提取是在洁净室环境中使用 DNA/RNA 萃取试剂盒进行的, 在这两个工程和程序控制都到位, 以尽量减少向样品中引入环境细菌。

  1. 工作区准备
    1. 清洁生物安全柜 (BSC) 工作区与适当的表面清洁剂, 以消除任何核酸污染。
    2. 打开温度控制的 vortexer, 并将其设置为37摄氏度。
  2. 胍硫氰酸盐裂解缓冲液的制备 (见材料表)
    1. 检查沉淀的溶解缓冲。在37摄氏度的温度下重新溶解沉淀。
    2. 为每个样品准备600µL 的裂解缓冲液和6µL β巯基乙醇 (β i)。考虑每个样本额外的20% 卷。
  3. 样品准备
    1. 如果整个牛奶都结冰了, 就在冰上解冻。整除5毫升的全脂牛奶成15毫升或5毫升不育管在平衡计分卡, 并保持在冰上。
    2. 旋转5毫升牛奶整除10分钟在 5000 x g 在4°c 到颗粒细胞。
    3. 去除脂肪层, 现在的顶层在管, 用塑料铲或大口径吸管尖。
    4. 不干扰颗粒, 除去所有上清, 除100µL。
    5. 用 resuspending 在1毫升无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中清洗颗粒。
    6. 通过将1毫升不育 PBS 添加到5毫升管中, 准备1负控制。
    7. 将悬浮液转移至清洁的1.5 毫升离心管, 并在离心中旋转1分钟 (室温 (RT) 5000 x g)。
    8. 使用1000µL 无菌过滤吸管提示丢弃整个上清/脂肪层。
    9. 如果不提取同一天, 通过将细胞颗粒放入乙醇/干冰泥浆中, 并立即将其转移到-80 摄氏度冷藏库中, 将其冻结。
  4. 样品中断和均匀化 (珠敲打)
    1. 加入600µL 的裂解缓冲液, 其中含有β i 的颗粒, 并将悬浮液转移到珠管上。
    2. 每个抽取批次12包含10个样本, 1 个负控制 (在步骤3.7 中编写), 1 个正控制 (在下一步中准备)。
      1. 用裂解缓冲剂和20µL 的细菌模拟样品制备1阳性对照 (模拟社区使用的浓度, 一旦提取, 大约 0.2 ng/µL 的 DNA)。
    3. 漩涡所有珠管大力十五年代。
    4. 在温度控制的 vortexer 的热样品在37°c 为10分钟, 与震动在 700-800 转每分钟。
    5. 将管道加载到自动的示例干扰器适配器集中。
    6. 珠打1分钟在30赫兹。
    7. 拆卸适配器集, 并手动将适配器集与从左机械手到仪器的右侧机械臂的样本板一起切换。
    8. 珠打1分钟, 在30赫兹。
    9. 离心管在 17200 x g, 3 分钟在25摄氏度。
    10. 用200µL 吸管取出所有上清液, 小心不要在样品的顶端或试样底部的珠子残留物上得到任何脂肪层, 并应用于均质体柱。
    11. 离心机均质柱最大速度为 17200 x 克, 3 分钟25摄氏度。
    12. 将350µL 的洗脱液转移到2毫升制造商的离心管中, 用于纯化 DNA 和 RNA 的自动仪器 (不要使用任何其他管)。注意不要转移任何残留的脂肪层。
    13. 如果流经体积小于350µL, 添加裂解缓冲与β-我到最后的体积350µL。
    14. 在使用自动 DNA 纯化仪进行核酸隔离之前, 将样品留在 RT 上长达2小时, 或在-80 摄氏度处冻结。
  5. 清洁工作区
    1. 清洁所有表面使用非酶净化溶液, 离开10分钟, 然后喷雾与70% 乙醇和擦拭表面。

2. 分离 DNA/RNA

  1. 工作区准备
    1. 打开散热块, 将温度设置为70摄氏度。
    2. 打开温度控制的 vortexer, 将温度设置为37摄氏度。
    3. 预热洗脱缓冲 (EB) 包含10毫米三氯, pH 8.5, 在50毫升管到70°c。
    4. 加热350µL 冷冻样品裂解物2毫升管在37°c, 直到完全解冻没有任何沉淀 (约10分钟)。
  2. DNA 纯化
    1. 漩涡和离心机2毫升管与样品简要地 (3000 x g 十年代)。
    2. 根据制造商的说明, 在自动 DNA/RNA 净化仪器的加载图后, 将2毫升管插入到振动筛中。
    3. 根据样品数量, 获取转子适配器并将其设置在托盘上。
    4. 根据样品的标识 (ID) 对每个转子适配器进行标签。
    5. 切下盖子, 平滑各个旋转柱的边缘, 用于 DNA 和 RNA。
    6. 插入没有收集管的 DNA 旋转柱进入转子适配器。丢弃收集管。
    7. 标签1.5 毫升收集管, 并插入到转子适配器。
    8. 根据自动 DNA/RNA 纯化仪的加载图, 将转子适配器设置为离心机。
    9. 插入制造商的1000µL 过滤器-提示到尖端机架。
    10. 根据样品数量 (根据特定机器协议指令), 在2毫升制造商的离心管中添加 RNase 水。
    11. 将管插入管插槽 "A" 的离心管插槽。
    12. 丢弃试剂瓶中剩下的试剂, 并填充最小体积10毫升。
    13. 将试剂瓶插入试剂瓶架中 (EB 瓶除外)。
    14. 从50毫升管中加入热 EB 到试剂瓶位置6。
    15. 检查1.5 毫升管放在转子适配器紧密。
    16. 关闭仪器的盖子并选择: "RNA" → "提取套件" → "动物, 组织和细胞" → "套件的名称350µL 部分自定义 DNA" →编辑洗脱量为100µL (默认) 或50µL 低生物量样品→ "开始"。
    17. 完成后, 从离心机上取出转子接头, 放在托盘上。
    18. 从转子适配器位置3丢弃 DNA 自旋柱。
    19. 不要丢弃转子适配器, RNA 在位置2。
    20. 去除1.5 毫升收集管含有洗脱 DNA 在位置 3, 并存储在−20°c。
    21. 收集从振动筛和存储在−20°c 样品, 如果任何样品留在, 否则丢弃。
    22. 继续与协议 "试剂盒的名称350µL 部分 B rna" 进一步纯化 RNA。
    23. RNA 纯化将由大约350µL 流经, 在转子适配器的中间位置。
  3. RNA 纯化
    1. 插入 RNA 旋转柱没有它的收集管和盖子到转子适配器。
    2. 标签新的1.5 毫升收集管和插入到转子适配器, 如手册中所示。
    3. 在自动 DNA/RNA 纯化仪的加载图后, 将转子适配器设置为离心机。
    4. 关闭仪器的盖子, 并选择: "RNA" → "制造商的套件" → "动物, 组织和细胞" → "标准部分 B RNA" → "开始"。
    5. 完成后, 从离心机上取出转子接头, 放在托盘上。
    6. 从位置3丢弃 RNA 自旋列。
    7. 去除1.5 毫升收集管包含30µL 洗脱 RNA 在位置 3, 并且存放在−80°c。
    8. 取出试剂瓶。
    9. 通过适当的危险废物通道处理转子适配器的内容。
  4. 清洁工作站
    1. 喷雾所有的自动 DNA/RNA 净化仪器的配件, 如试剂架, 托盘, 和任何其他表面使用非酶净化解决方案, 离开10分钟, 并冲洗与去离子 (DI) 水, 然后让他们干。
    2. 喷雾自动仪器只有制造商批准的非酶净化解决方案, 擦拭内部的离心机连同所有的表面使用, 离开10分钟, 然后擦拭70% 乙醇。不要使用其他类型的净化解决方案, 因为他们可以损坏仪器。

3. 靶向 16S PCR 设置

注: 16S PCR 的设置是在清洁室内指定的预放大工作区进行的。试剂和样品的制备, 然后加载到一个液体处理程序, 以执行 PCR 为每个样本三 (30 样品, 其中包括真实样品和提取阳性和阴性对照, 加上 2 PCR 水控制, 总共96组合的样本和控件)。一旦 PCR 反应组装和密封, 样品板被转移到一个热循环仪位于后放大区域的自行车。

  1. 工作区准备
    1. 清理 PCR 工作站。喷雾所有表面使用 RNase, DNase, DNA decontaminant, 其次是 DI 水两次, 最后70% 乙醇。
    2. 使用精确的样本列表准备 16S pcr 工作表 (参见目标 16S pcr 工作表), 并为每个示例9分配不同的条形码引物。打印出工作表和板块图 (见板 1)。
  2. PCR 主混合制剂
    注: 16S 底漆选择是基于感兴趣区域的特定研究, 并可通过研究或样本类型改变。因此, 在订购底漆之前, 重要的是要确认 16S rRNA 的哪个区域最好能放大特定研究中感兴趣的微生物。本协议的编写是为了放大 16S V4 区域。如果选择不同的引物/区域, 则热循环中的退火温度可能需要调整。
    1. 在 PCR 工作站工作, 准备一切。
    2. 从-20 摄氏度取出 50-100 µL 的 DNA 样本, 以及所有需要的试剂, 然后在冰上解冻。漩涡和简要地旋转下来。
    3. 引物预稀释至5µM 的工作浓度, 最小体积为20µL。
    4. 根据工作表上的计算, 在特定的5毫升管中准备 PCR 主混合, 只用正向底漆。
  3. 为自动 PCR 装置准备机器人液体处理程序
    1. 对于样品, 拿出一个32井仪器的样品适配器, 并根据制造商的指示, 按照96井板图载入 50-100 µL 的 DNA 样本。
      1. 对于每一个 pcr 板, 设置2阴性控制通过放置30µL PCR 水在一个干净的样品管。
      2. 将所有样品放置在32井仪器的样品适配器上, 并将瓶盖锁定在打开位置。
    2. 对于反向引物9
      1. 删除每个反向底漆的上限与特定的条码 # 的一个在一次 (更换手套之间, 以避免交叉污染)。
      2. 在仪器的试剂适配器上放置最多32个底漆。
    3. 拿出一个96良好的 PCR 板, 并标签它的研究名称, 样本数, 日期和技术员的缩写。
    4. 装载机器人液体处理程序
      1. 将试剂适配器放置在 B1 位置。为了避免边缘效应, 小心地将适配器的一端放在手柄一侧, 然后慢慢地将另一边缘向下。一定要把适配器的所有角落都推上。
      2. 将样品适配器放置在 C1 位置。一定要把适配器的所有角落都推上。
      3. 涡流5毫升主混合, 打开帽, 并将其放置在仪器的主混合和试剂块位置 A。
      4. 将 pcr 盘放在96井仪器的适配器上, 用于控制半掠过的 pcr 板。
      5. 启动运行并另存为新文件。
      6. 按照提示和复选标记每个提示: 一个, 提示可用, 两个, 废物箱可用, 三, 开始。
    5. 运行完成后, 通过检查计算机中是否有错误消息来验证没有错误。
    6. 用12或8条带帽密封板, 漩涡大力, 并向下旋转1分钟使用96井板微调, 并把它放在冰或冰箱。
    7. 除去含有反向底漆和样品的管子。
    8. 将96井板带到后放大室, 并根据热循环条件表将该板加载到热循环仪并循环 (请参见表1)。

4. 采用基于胶带的凝胶电泳平台进行靶向16S 后 PCR 质量控制

注: PCR 后质量控制 (QC) 和所有后续步骤都在实验室指定的后放大区域进行。dna 被分析在一个自动化的 dna/RNA 片段分析仪。

  1. 工作区准备
    1. 通过喷洒 RNase、DNase、DNA decontaminant 的所有表面, 然后用二次水, 最后70% 乙醇, 清洁工作站。
    2. 收集所有需要的用品和设备。
  2. 制备试剂
    1. 将样品缓冲器和梯子放在温度控制的 vortexer 中, 在摄氏25摄氏度, 最小为30分钟。
  3. 当试剂正在升温时, 通过将每个样品的 3 pcr 复制汇集到一根管子中, 制备 pcr 样品。
  4. 在仪器上装载样品。
  5. 简要地涡旋和自旋向下管与汇集 PCR 产品。
  6. 将仪器的96井板放在 RT 上的机架上并贴上标签。
  7. 简要涡旋和向下旋转样本缓冲区和梯子。
  8. 将3µL 样本缓冲区添加到96井板的每个井 (至少需要53µL/丝网磁带)。
  9. 运行偶数样本;如果有奇数的样本, 将4µL 的样本缓冲区添加到空井中。
  10. 在梯子上加1µL 梯子。
  11. 按照地图, 将1µL 的聚合 PCR 产品添加到其指定的井中。
  12. 铝箔密封盖板
  13. 用仪器的 vortexer 和适配器在2000转1分钟内涡流板。
  14. 如果有气泡再次旋转, 向下旋转以将样品放置在管子的底部。
  15. 启动软件。
  16. 加载屏幕磁带和加载提示到仪器。
  17. 将样品装入带96井适配器的碎片分析仪中。
  18. 设置与控制器软件的运行。
  19. 一定要选择连编号井。
  20. 编写示例 id。
  21. 检查屏幕磁带的所有油井是否以灰色突出显示。
  22. 请确保分析器识别所有的吸管提示。
  23. 选择 "开始" 并指定一个文件名以保存结果 (研究名称、示例编号和日期)。
  24. 有关详细信息, 请参阅制造商的说明。
  25. 运行完成后, 丢弃笔尖、屏幕胶带和管子。
  26. 分析数据为16S 峰值 nM (315-450 bp 为 V4)。此峰值将根据所选引物的不同而有所不同。

5. 图书馆的计算、汇集、清理和 QC

  1. 在确定了所有示例的扩增子大小和浓度之后, 请将库池存储起来, 以实现池库的最终所需卷和 nM (请参见示例计算)。
  2. 根据制造商的协议 (请参阅材料表), 清理并集中使用基于硅膜的 PCR 产品纯化试剂盒的池库。
    1. 洗脱的 DNA 的最终体积为50µL。
  3. 根据制造商的协议, 使用双链 DNA 高灵敏度套件对荧光计, 立即测量清理后的库的浓度。
    1. 稀释2µL 的汇集和被清洗的图书馆与198µL 稀释缓冲器加上染料 (1:100 稀释)。
    2. 从荧光器件中记录测量值, 并根据稀释因子进行转换。
  4. 使用集中阅读 (ng/µL) 的汇集库, 计算图书馆浓度在 nM。使用1µL 未稀释的图书馆测量 microvolume 分光光度计上的 OD260/280。
    注: 值 1.8-2.0 表示库的纯度足够。
  5. 将最终库存储在-20 摄氏度, 直到为下一代排序做好准备。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

此处介绍的协议包括重要的质量控制 (QC) 步骤, 以确保所生成的数据符合协议灵敏度、特异性和污染控制的基准。该协议的第一个 QC 步骤是 16S V4 区域的 PCR 放大 (图 2)。通过电泳分析了每种样品的 PCR 产物的一个µL, 以确认其在 315-450 bp (图 2、红色箭头) 的预期尺寸范围内。一些人奶样本产生了较低数量的特定产品 (图 2A, 比较车道3和 9-11 与车道 4-8), 建议在这些样本中提取的微生物 DNA 水平较低, 或在提取过程中的 PCR 抑制剂的结转。对于在 315-450 bp 范围内产生少于2.0 毫微米的产品的样品 (图 2A、车道 7), PCR 抑制剂清除是使用单个步骤工具包进行的, 并且样品被重新放大。清除后的样品放大回收率约为40%。对每个样本 (图 2B) 的特定产品进行定量测量, 对于确定其所需的体积, 以便为测序提供相同的摩尔集合。用于目标排序的池库通常由特定的 PCR 产品 (图 3) 控制。如果库中有大量的非特定产品, 则应将凝胶纯化步骤添加到工作流中。

在图 2A中所示的示例中, 观察到缓冲区控制 (BC、车道2和 12) 和 PCR 水负控制 (PC; 车道 1) 的微弱频带, 表明可能存在环境或试剂污染。这种波段并不少见, 通常代表低数量的 PCR 产品 (即, < 1 nM), 并在排序 (< 1000) 中产生很少的读计数。具有代表性的排序结果 (图 4) 确认这些示例确实具有非常低的排序读取计数 (图 4A、车道1和 11;图 4B、缓冲区和 PCR 水车道), 重要的是, 对照样品的分类器组成有别于人奶样品 (图 4A; 比较车道1和11与车道 2-10)。负控制中的高读计数, 以及控件和样本之间的类群组成的显著重叠, 表明交叉污染和改进污染控制的需要。

排序结果 (图 4) 显示了与人乳菌群相关的分类的高度多样性, 以及每个样本的测序读取计数 (图 4A、车道 2-10) 的可变性。相比之下, 与人奶样本一起处理的细菌模拟的测序结果显示了类群组成和读计数, 这些分类与在以前的工作流运行中为模拟获得的结果相媲美 (比较图4A, 车道12与图 4B, 模拟车道)。模拟车道的一致结果表明, 观察到的人乳样品的变异是一个真实的实验结果, 而不是内在工作流变异性的函数。

Figure 1
图 1: 目标16S 测序管线的流程图.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 16S V4 amplicons 的质量控制分析.(A) 16S V4 amplicons 的凝胶图像使用自动 DNA/RNA 片段分析仪进行电泳解决。16S V4 amplicons 是根据 Caporaso et生成的。9, 根据制造商的指导原则, 使用高灵敏度的 DNA 试剂分析了每种 PCR 产品的一个µL。多数人牛奶样品 (车道 3-6 和 8-11) 和细菌模拟 (车道 13) 生产了一个主要 PCR 产品在期望大小大约 400 bp (红色箭头)。7车道的人奶样本未能生产出大量的特定产品, 并需进行清理和重新放大。检测了 PCR 阴性控制 (PC, 1 车道) 的最小产品, 裂解缓冲负控制 (BC, 车道2和 12) 表明, 在分析样品中存在着极小的污染。兆瓦, 分子量标记: 上红色和下绿色条分别识别 1500 bp 和 25 bp 大小标记, 在每条车道。(B) 3 车道的顶部电泳图谱从凝胶中 (A)。主要 pcr 产品位于由红色垂直条定义的峰值区域内, 包括从 299-497 bp 的大小不等的碎片, 导致平均 pcr 产品大小为 396 bp. 浇口在比预期的扩增子尺寸稍宽的范围内进行 (我n 这个案例 315-450 bp), 以确保包括整个样本峰值。上、下峰分别与 25 bp 和 1500 bp 的碎片大小相关。底部:图表概括了峰值区域的大小参数、在峰值区域内 pcr 产品的µL 浓度和浓度中的特定 pcr 产品的纳米量。然后, 此信息用于计算每个样本在一个相等的摩尔库中的聚集量 (参见示例计算)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 池和集中排序库的电泳图谱。将测序的单个样品的等量摩尔量合并成一个汇集库。然后, 图书馆被清洗和集中到总容量的50µL 使用硅膜 PCR 清理套件。根据制造商的协议, 对下一代排序器排序的库进行最后准备。尽管存在其他带区, 但该库已成功地进行了排序。如果对 PCR 产品的关注超出了预期的尺寸范围, 制造商的协议建议添加一个凝胶尺寸选择步骤。此 QC 步骤通常不执行。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 对负和正控制的评估.(A) 提取批次的细菌类群与控制和人乳样本的相对丰度。作为 QC 措施, 每一个提取批次的组成, 在自动 DNA/RNA 净化仪器上加载后, 立即产生的顺序运行。每个示例栏下的数字指示相应示例的筛选读取数。缓冲控制的组成与人乳样品的成分不同。(B) 缓冲、模拟和 PCR 控制中细菌分类的相对丰度。对所有阴性 (缓冲和 PCR 水) 和阳性 (细菌模拟) 控制的读数和成分的数量进行评估。缓冲物和水的成分各不相同, 但模拟群落仍相当稳定。请单击此处查看此图的较大版本.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

16S rRNA 的目标下一代测序是一种广泛使用的、快速的微生物特征18技术。但是, 许多因素, 包括批处理效果、环境污染、样本交叉污染、灵敏度和重现性都会对实验结果产生负面影响, 并混淆其解释7,19,20. 为了最好地促进强健的16S 分析, 微生物组工作流必须包括良好的实验设计、使用适当的控制、工作流步骤的空间隔离以及最佳做法的应用。此处描述的协议包含了每个参数, 并提供了重要的实验工具来解决上述挑战, 并为不同的示例实现16S 工作流。

良好的实验设计对16S 微生物菌群的分析至关重要。这包括适当收集和储存样品, 以及选择适合该地区的16S 底漆。例如, 为人乳选择了 V4 区域 (515 f/806 r), 因为它对双歧杆菌有很好的放大作用, 在新生儿肠道菌群21的发育中起着重要的影响。其他引物集 (例如、27 f/338 r、515 f/926 r) 可能更适合于其他微生物群落的研究。一个重要的注意事项是, 目标 16S PCR 的退火温度和预期的扩增子大小可能会因底漆选择而异。

其他地方可修改该协议的依据是在工作流程中纳入 QC 步骤的结果。如果在目标 16S PCR 放大步骤之后检测到没有或很少的 DNA, 则有几种方法可供诊断。1) 样品可以通过 PCR 抑制剂去除步骤。pcr 抑制剂去除后的扩增使用每个制造商的协议执行的单个步骤套件是成功的大约40% 的时间, 2) 更多提取的 DNA 可以添加到目标 16S PCR, 或 3) 一个新的和潜在较大的整除的牛奶可以处理, 如果有的话。如果对 PCR 产品的关注超出了预期的尺寸范围后, 硅膜基纯化的库, 可以添加凝胶净化步骤。最后, QC 步骤是确定是否有污染的证据的关键, 下面将详细讨论。如果检测到严重的污染, 则根据污染的引入地点, PCR 可以重复或必要时, 可以重新提取样品。幸运的是, 有了良好的实验室实践, 这些都是罕见的事件。最后, 虽然本议定书是为了强调在低生物量样本的放大和具体的人奶, 该协议可以很容易地修改, 以扩大口服, 直肠, 阴道, 皮肤拭子或海绵以及大便。如果选择了其他样本类型, 则考虑哪些抽取套件对特定的样本类型是最佳的。

由于试剂盒、试剂或顺序奔跑而产生的批次效应是微生物学研究中的重要变异来源。DNA 提取试剂盒与其他试剂一样, 具有较低的细菌 DNA 水平, 这可能会因大量的20、22、23、24而异。对于大型项目, 使用一大堆工具包、试剂、选择用于最小化套件污染的套件可能会简化分析7。对象和控件的示例并排处理。如果一项研究的所有样本, 无论是主题还是控制, 都可以纳入单一的测序运行, 这是最好的。如果要成批处理大量的样本, 则每个批次中都包含具有代表性的样本, 并将其与控件一起处理。同样重要的是组织批处理, 以最大限度地减少低生物量样品 (即, 人奶) 的污染, 样本是高生物量 (即, 大便)。在这种情况下, 先处理低生物量样本类型, 然后再进行高生物量样品的研究。

低生物量样品对微生物菌群的研究构成了独特的挑战, 因为环境、试剂、仪器和研究人员的污染使得很难区分在低丰度中存在的真实社区成员7,25,26和那些通过实验过程19人为地引入到示例中的方法。此处描述的工作流在样本准备步骤 (仅限缓冲区的裂解控制) 和 pcr 步骤 (pcr 水控制) 中包含重要的实验性负控制 (请参见 图 4)。这些控件有助于识别污染源, 并在工作台或在硅片27、28、29、30中提供有效的纠正措施。对负面控制进行仔细评估, 并报告研究结果7。

为了最大限度地减少污染, 实验活动的空间隔离成为一个干净的预 PCR 放大区和后扩增区是很重要的。最理想的情况是, 洁净室既有一个区域为 PCR 大师混合准备和样品准备/添加主混合区, 并可纳入一个单独的死亡空气箱或生物安全柜住房专用消耗品和小型设备所需的大师混合准备。洁净室设计采用了高效微粒空气过滤的正气流系统。使用个人防护设备对维持受控的低微生物环境至关重要, 包括发套、实验室大衣、手套和鞋盖。套件/试剂和样品理想地存放在单独的专用冰箱/冰柜中。在指定工作站的洁净室也进行 PCR 设置;在自动吹打平台上装载样品之前, 要保持从提取的 DNA 中清除底漆和试剂的清晰分离。一旦 PCR 装置完成, 板块转移到后放大区, 并加载到热循环仪。

重要的是要限制工作活动从洁净区流向扩后区;从后扩区到洁净区, 试剂、仪器或补给品没有逆行移动。进入任何放大后区域的人员不得进入清洁区24小时 (直到第二天)。除了上述工作流的考虑之外, 清洁协议必须在清洁和后放大区域内实现, 以最大限度地减少工作表面和仪器的核酸污染。如果不存在有形障碍或单独的房间, 则必须尽一切努力在尽可能远的地方建立工作。

除了污染外, 微生物研究还受到敏感度、变异性和重现性的31的挑战。此协议通过将已定义的细菌模拟社区与每批示例一起提取、放大和排序来解决这些问题 (请参见图 4b)。此控件提供一个恒定的内部引用, 用于评估生成的实验结果的重现性, 并可用于解决出现的问题。例如, 提取的模拟 DNA 的质量可以为有效的样品裂解和 dna 提取提供一个指标, 基因组 dna 控制的是脱靶量。pcr amplicons 的质量控制也表明 pcr 的效率和特异性。此外, 由于模拟包含多种细菌类型, 因此可以通过模拟样品的测序结果中分类的表示, 推断出处理过的样品的相对灵敏度。一个理想的模拟社区将评估检测车厢内主要细菌种类的能力, 因此模拟群落的组成可能需要通过研究来改变。如图 4a所示, 样本排序结果之间存在相当大的差异, 但细菌模拟社区的序列结果是高度可重现的 (请参见图 4b)。

虽然图 4中的模拟社区是一种独特的混合的33菌株从商业上可用和本地临床分离, 一个商业上可用的模拟社区最近被开发了32。

虽然此处描述的工作流在广泛处理不同微生物群研究的重现性方面是有限的, 但它确实提供了一个重要的实验方法, 使研究人员能够纳入适当的实验控制和监测其结果中的重现性。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们要感谢 Helty Adisetiyo, 博士和 Shangxin 杨博士的发展的协议。对国际妇幼青少年艾滋病临床试验组 (IMPAACT) 的总体支助是由国家卫生研究院 (NIH) 国家过敏和传染病研究所 (NIAID) 根据奖励数字提供的。UM1AI068632 (IMPAACT), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) 和 UM1AI106716 (IMPAACT LC), 与来自尤尼斯·肯尼迪-国家儿童健康和人类发展研究所 (发育研究院) 和国家心理健康研究所 (镍氢) 的共同资助。内容完全是作者的责任, 不一定代表 NIH 的官方观点。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AllPrep RNA/DNA Mini Kit Qiagen 80204 DNA/RNA extraction kit
Eliminase Fisher Scientific 435532 RNase, DNase, DNA decontaminant
Thermo Mixer Fisher Scientific temperature-controlled vortexer
Buffer RLT plus Qiagen 1053393 guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689-25ML-F ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME Beads MP Biomedicals 116914050 bead tube
QIAgen TissueLyzer Qiagen 85300 automated sample disruptor adapter set
QIAshredder column Qiagen 79654
QIAgen RB tube manufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticware Qiagen 9001292 automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plus Applichem A7089 non-enzymatic decontamination solution
EB Buffer Qiagen 19086 elution buffer
QIAgility and related plasticware Qiagen 9001532 robotic liquid handler
PCR water MO BIO 17000-
5PRIME HotMasterMix Quantabio 2200400
Barcoded reverse primers Eurofin No Catalog #'s designed and ordered
96 well PCR plate USA scientific 1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticware Agilent G2964AA automated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation Agilent 5067-5585 Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit Zymo Research 50444470 PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32854 dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216
NanoDrop Thermo Fisher microvolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kit Illumina 15033624/15033626
MiSeq Illumina No Catalog #'s next generation sequencer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
  2. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
  3. Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
  4. Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
  5. Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
  6. Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
  7. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
  8. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
  9. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  10. Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
  11. Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
  12. Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
  13. Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
  14. Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
  15. Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
  16. Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
  17. Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
  18. Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
  19. Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
  20. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  21. Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
  22. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
  23. Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
  24. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
  25. Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
  26. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
  27. Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
  28. Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
  29. Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
  30. Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
  31. Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
  32. ATCC. Mock microbial communities. , Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017).

Tags

免疫学和感染 问题 133 16S 核糖体 RNA 微生物群 下一代测序 母乳 人乳 低生物量
人乳样品靶向16S 测序方法的研究
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih,… More

Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih, S., Lee, D. J., Li, F., Aldrovandi, G. M. A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples. J. Vis. Exp. (133), e56974, doi:10.3791/56974 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter