Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Een methode voor gerichte 16S sequentiebepaling van menselijke melkmonsters

Published: March 23, 2018 doi: 10.3791/56974
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, University of California at Los Angeles

Summary

Een semi-geautomatiseerde workflow wordt gepresenteerd voor gerichte sequentiebepaling van het 16S rRNA van menselijke melk en andersoortige laag-biomassa monster.

Abstract

Studies van microbiële gemeenschappen geworden wijdverbreide met de ontwikkeling van relatief goedkope, snelle en hoge doorvoer sequencing. Echter, zoals met al deze technologieën, reproduceerbare resultaten hangen af van een laboratorium-werkstroom waarin passende voorzorgsmaatregelen en over besturingselementen. Dit is vooral belangrijk met lage-biomassa monsters waar besmetting van bacteriële DNA kan misleidende resultaten genereren. In dit artikel een overzicht van een semi-geautomatiseerde workflow voor het identificeren van de microben van menselijke borst melkmonsters met behulp van gerichte sequentiebepaling van het 16S ribosomaal RNA (rRNA) V4 regio op een schaal voor de lage en Midden throughput. Het protocol beschrijft de bereiding van de monsters van volle melk inclusief: proeven van lysis, nucleic zuur extractie, versterking van de V4-regio van het 16S rRNA gen, en de voorbereiding van de bibliotheek met kwaliteitscontrole maatregelen. Nog belangrijker is, het protocol en de discussie punten in overweging nemen die meest opvallende aan de voorbereiding en analyse van lage-biomassa monsters zijn, met inbegrip van passende positieve en negatieve controles, de verwijdering van de Inhibitor van de omwenteling van de PCR, monster besmetting door milieu-, reagens, of experimentele bronnen, en experimentele praktijken ter verzekering van de reproduceerbaarheid. Terwijl het protocol zoals beschreven specifiek voor menselijke melkmonsters is, is het aan te passen aan de talrijke lage - en hoge-biomassa monster soorten, met inbegrip van monsters die op de wissers, bevroren puur of gestabiliseerde in een buffer van behoud.

Introduction

De microbiële gemeenschappen die mens koloniseren worden verondersteld te zijn kritisch belangrijk voor menselijke gezondheid en ziekte beïnvloeden metabolisme, immuunsysteem ontwikkeling, gevoeligheid voor ziekte en reacties op vaccinatie en drug therapie1, 2. inspanningen om te begrijpen van de invloed van de microbiota op de menselijke gezondheid op dit moment benadrukken de identificatie van microben gekoppeld omschreven anatomische compartimenten (d.w.z.huid, darmen, oral, etc.), evenals gelokaliseerde sites binnen Deze compartimenten3,4. Grondslag van deze investigative inspanningen is het snelle ontstaan en de grotere toegankelijkheid van volgende-generatie sequencing (NGS) technologieën die een massaal parallelle platform te voor analyse van de microbiële genetische inhoud (microbiome) van een steekproef bieden. Voor veel fysiologische monsters, de bijbehorende microbiome is zowel complexe en overvloedige (d.w.z., ontlasting), maar voor sommige monsters, het microbiome wordt vertegenwoordigd door lage microbiële biomassa (dat wil zeggenmenselijke melk, lagere luchtwegen) waar gevoeligheid, experimentele artefacten en mogelijke verontreiniging worden belangrijke kwesties. De gemeenschappelijke uitdagingen van microbiome studies en passende proefopzet hebben het voorwerp geweest van meerdere review artikelen5,6,7,8.

Hierin gepresenteerd is een robuuste NGS experimentele pijpleiding gebaseerd op gerichte sequentiebepaling van het rRNA 16S V4 regio9 te karakteriseren van de microbiome van menselijke melk. Microbiome analyse van menselijke melk is ingewikkeld, niet alleen door een inherent lage microbiële biomassa10, maar bovendien door hoge niveaus van menselijk DNA achtergrond11,12,13,14 en potentiële overdracht van PCR remmers15,16 in de uitgepakte nucleïnezuur. Dit protocol is afhankelijk van verkrijgbare extractie kits en semi-geautomatiseerde platformen die kunnen helpen bij het minimaliseren van de variabiliteit in de sample voorbereiding batches. Het bevat een welomschreven bacteriële mock Gemeenschap dat naast de monsters wordt verwerkt als een kwaliteitscontrole te valideren van elke stap in het protocol en het bieden van een onafhankelijke metric van de robuustheid van de pijpleiding. Hoewel het protocol als beschreven specifiek voor de menselijke melkmonsters is, het is gemakkelijk aan te passen aan andere steekproef vormen, met inbegrip van de ontlasting, rectaal, vaginale, huid, areolar en mondelinge swabs10,17, en kan dienen als uitgangspunt voor onderzoekers die willen microbiome analyses uitvoeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Goede persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) gedragen moet worden voor alle stappen van het protocol, en strenge verontreiniging preventie benaderingen dienen te worden genomen. Stroom van het werk van pre amplificatie werkplaatsen aan na versterking werkgebieden te minimaliseren van verontreiniging van monsters te observeren. Alle leveringen gebruikt zijn steriel, gratis RNase, DNase en DNA pyrogeen. Alle Pipetteer tips worden gefilterd. Een stroomdiagram van de stappen van het protocol wordt verstrekt (Figuur 1).

1. steekproef Lysis

Opmerking: De lysis van de steekproef en extractie van de nucleïnezuur worden uitgevoerd met behulp van een DNA/RNA extractie kit in een schone kamer omgeving waar zowel de engineering en de procedurele controles plaats om te minimaliseren van de invoering van milieu bacteriën in de monsters worden.

  1. Gebied van werkvoorbereiding
    1. Het kabinet van de bioveiligheid (BSC) werken schoon gebied met passende oppervlak cleaner te elimineren elke besmetting van de nucleïnezuur.
    2. Inschakelen van de temperatuurregeling vortexer, en zet deze op 37 ° C.
  2. Guanidinium kaliumthiocyanaat lysis-buffermengsel bereiden (zie tabel van materialen)
    1. Controleer de lysis-buffermengsel voor precipitaten. Opnieuw los precipitaten door opwarming van de aarde bij 37 ° C.
    2. 600 µL van lysis buffer met 6 µL β-mercaptoethanol (β-ME) voorbereiden op elk monster. Overwegen een extra 20% volume per monster.
  3. Bereiding van de monsters
    1. Als volle melk is bevroren, ontdooien het op ijs. Geheel aliquoot 5 mL melk in een 15-mL of een 5-mL steriele buis in de BSC en bewaar deze op ijs.
    2. Draai de 5 mL melk aliquoot gedurende 10 minuten bij 5.000 x g bij 4 ° C tot pellet cellen.
    3. Verwijder de vetlaag, nu de bovenste laag in de buis, met een plastic spatel of grote boring pipette uiteinde.
    4. Verwijderen zonder de pellet te verstoren, alle het supernatant met uitzondering van 100 µL.
    5. De pellet wassen door resuspending in 1 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    6. Bereiden 1 negatieve controle door toevoeging van 1 mL steriel PBS tot een 5-mL koker.
    7. Spoel de suspensie tot een schone 1.5-mL centrifugebuis, en draaien in een microcentrifuge voor 1 min (5000 x g bij kamertemperatuur (RT)).
    8. Gebruik een 1.000 µL steriele gefilterde pipette uiteinde te ontdoen van de volledige laag van de bovendrijvende substantie/vetzuren.
    9. Als niet uitpakken van dezelfde dag, breek bevriezen de cel pellet door de gegevens in een ethanol/droog ijs drijfmest, en onmiddellijk over te brengen naar de vriezer-80 ° C.
  4. Verstoring van de steekproef en homogenisering (Parel-pak slaag)
    1. Voeg 600 µL van lysis buffer met β-ME naar de pellet, en spoel de suspensie tot een koker kraal.
    2. Elke batch van de extractie van 12 bevat 10 monsters, 1 negatieve controle (bereid in stap 3.7 hierboven) en 1 positieve controle (bereid in de volgende stap).
      1. 1 positieve controle met lysis-buffermengsel en 20 µL van het bacteriële mock monster (de mock Gemeenschap gebruikt heeft een concentratie, eenmaal uitgepakt, van ongeveer 0,2 ng/µL van DNA) voor te bereiden.
    3. Vortex alle bead buizen krachtig gedurende 15 s.
    4. De monsters van de warmte op de temperatuurgevoelig vortexer bij 37 ° C gedurende 10 min, met schudden bij 700-800 rpm.
    5. Buizen in de geautomatiseerde monster disruptor adapter set laden.
    6. Kraal verslaan voor 1 min bij 30 Hz.
    7. Demonteren van de adapter set en handmatig schakelen de adapter instellen met de monster-platen van de linker robotarm tot de rechts robotarm van het instrument.
    8. Kraal beat voor een andere 1 min bij 30 Hz.
    9. Centrifuge buizen bij 17,200 x-g, gedurende 3 min bij 25 ° C.
    10. Alle van het supernatans dat 200 µL Pipetteer voorzichtig niet om om het even welk van de vette laag aan de bovenkant van het monster of de kraal residuele aan de onderkant van het monster, en toepassen van een homogenizer kolom verwijderen.
    11. Centrifuge homogenizer kolommen ter maximum-vaart, 17,200 x-g, voor 3 min bij 25 ° C.
    12. 350 µL van het eluaat overbrengen van de fabrikant van een 2-mL microcentrifuge buis voor gebruik met de geautomatiseerde instrument voor zuivering van DNA en RNA (gebruik niet een andere buis). Wees voorzichtig niet over te dragen van eventuele resterende vette laag.
    13. Als het volume doorstroming minder dan 350 µL is, lysis-buffermengsel met β-ME aan een eindvolume van 350 µL toevoegen.
    14. Laten de monsters op RT voor maximaal 2 uur voordat u verdergaat nucleïnezuur isolatie met behulp van de geautomatiseerde DNA zuivering instrument of bevriezen bij-80 ° C.
  5. Schoonmaak werkgebied
    1. Schoon alle oppervlakken in gebruik met een oplossing van de niet-enzymatische decontaminatie, laat gedurende 10 minuten, dan spuiten met 70% ethanol en veeg beneden het oppervlak.

2. DNA/RNA isoleren

  1. Gebied van werkvoorbereiding
    1. Zet de warmte blok en de temperatuur instellen tot 70 ° C.
    2. Zet de vortexer temperatuurgevoelig en selecteer de temperatuur tot 37 ° C.
    3. Opwarmen van de elutie buffer (EB) met 10 mM Tris-Cl, pH 8,5, in een tube van 50 mL tot 70 ° C.
    4. Opwarmen van 350 µL van bevroren monster lysates in de buizen 2 mL bij 37 ° C tot volledig ontdooid zonder een eventueel neerslag (ongeveer 10 min).
  2. DNA zuivering
    1. Vortex en centrifuge de 2-mL buisjes met proeven van kort (3000 x g voor 10 s).
    2. 2 mL buizen in de shaker geautomatiseerde DNA/RNA zuivering van het instrument laden grafiek, per de instructies van de fabrikant na invoegen.
    3. Krijgen van de rotor-adapters en hen ingesteld op de lade op basis van het aantal monsters.
    4. Label elke adapter van de rotor op basis van het monster de identificatie (ID).
    5. Afgesneden de deksels en de randen van individuele spin kolommen vloeiend voor DNA en RNA.
    6. Voeg de DNA spin kolom zonder de collectie buis in de rotor-adapter. Gooi de collectie buis.
    7. Label 1,5 mL collectie buizen en rotor adapters invoegen.
    8. Rotor adapters in de centrifuge na geautomatiseerde DNA/RNA zuivering van het instrument laden grafiek instellen
    9. Invoegen van fabrikant 1.000 µL filter-tips in tip racks.
    10. RNase-vrij water aan van de fabrikant van een 2-mL microcentrifuge buis op basis van het aantal monsters (per specifieke machineinstructies protocol) toevoegen.
    11. Plaats de buis in buis sleuf "A" van microcentrifuge buis "slots".
    12. Gooi een reagens dat in reagens flessen en vul met een minimaal volume van 10 mL overblijft.
    13. Reagens flessen invoegen in het reagens Flessenrek (behalve EB fles).
    14. Warme EB uit een tube van 50 mL toevoegen aan het reagens fles standpunt 6.
    15. Selectievakje 1,5 mL tubes zijn strak in de rotor adapters geplaatst.
    16. Sluit het instrument deksel en selecteer: "RNA" → "Extractie kit" → "Dier, weefsels en cellen" → "kit's naam 350 µL deel A Custom DNA" → bewerken Elution Volume 100 µL (standaard) of 50 µL voor lage biomassa monsters → 'Start'.
    17. Als alles klaar is, verwijder rotor adapters uit de centrifuge en plaats ze in de lade legt.
    18. Gooi de DNA spin kolom vanaf rotor adapter positie 3.
    19. Gooi niet rotor adapters, RNA is in positie 2.
    20. Verwijderen 1,5 mL collectie buizen met geëlueerd DNA op positie 3 en sla op −20 ° c bedragen.
    21. Verzamelen van monster-bevattende buizen van de shaker en winkel in −20 ° C, als een monster, anders negeren overblijft.
    22. Ga verder met het protocol "kit's naam 350 µL deel B RNA" voor verdere zuivering van RNA.
    23. RNA zuivering zal gebeuren van de ongeveer 350 µL doorstroomtest thats in de middelste positie van de rotor-adapters.
  3. RNA zuivering
    1. Voeg de RNA spin kolom zonder collectie buis en deksel in de rotor-adapter.
    2. Label nieuwe 1,5 mL collectie buizen en voegt u deze in de rotor adapter zoals aangegeven in de handleiding.
    3. Zet de rotor adapters in de centrifuge na geautomatiseerde DNA/RNA zuivering van het instrument laden grafiek.
    4. Sluit het instrument deksel en selecteer: "RNA" → "Fabrikant Kit" → "Dier, weefsels en cellen" → "Standaard deel B RNA" → "Start."
    5. Wanneer voltooid, verwijder rotor adapters uit de centrifuge en plaats ze in de lade legt.
    6. Gooi RNA spin kolom in positie 3.
    7. 1,5 mL collectie buizen met 30 µL geëlueerd RNA op positie 3 te verwijderen en opslaan bij −80 ° C.
    8. Verwijder reagens flessen.
    9. Rotor adapter inhoud via kanalen van de passende gevaarlijk afval afvoeren.
  4. Schone werkplek
    1. Spray alle geautomatiseerde DNA/RNA zuivering van het instrument accessoires, zoals reagens rekken, lade en elke andere ondergrond in gebruiken met een niet-enzymatische decontaminatie-oplossing, laat gedurende 10 minuten en spoel af met gedeïoniseerd water (DI) en laat ze drogen.
    2. Spray de geautomatiseerde instrument met alleen fabrikant goedgekeurde niet-enzymatische decontaminatie oplossing, veeg de binnenkant van de centrifuge samen met alle oppervlakken in gebruik, laat gedurende 10 minuten en vervolgens veeg met 70% ethanol. Gebruik geen andere soorten decontaminatie oplossingen als ze schade aan het instrument veroorzaken kunnen.

3. gerichte 16S PCR Set-up

Opmerking: De set-up voor de 16S-PCR wordt uitgevoerd in een aangewezen pre amplificatie werkruimte gelegen binnen de schoon-kamer. De reagentia en monsters worden voorbereid en vervolgens geladen op een vloeibare handler voor het uitvoeren van PCR voor elk monster in drievoud (30 monsters, waaronder waar monsters en extractie positieve en negatieve controles, plus 2 PCR van het water controles in drievoud, voor een totaal van 96 gecombineerde monsters en besturingselementen). Zodra de PCR reacties worden geassembleerd en verzegeld, wordt de plaat van het monster overgebracht naar een thermische cycler gelegen in een gebied na versterking voor fietsen.

  1. Gebied van werkvoorbereiding
    1. Reinig het PCR-werkstation. Spray die alle oppervlakken in gebruik met een DNA RNase, DNase, decontaminant, gevolgd door DI water twee keer, en ten slotte 70% ethanol.
    2. Het 16S PCR werkblad voorbereiden (Zie gerichte 16S PCR werkblad) met een nauwkeurige monster lijst en toewijzen verschillende barcoded inleidingen op elk monster9. Afdrukken van het werkblad en de kaarten van de plaat (zie plaat 1).
  2. PCR master mix voorbereiding
    Opmerking: 16S primer selectie is gebaseerd op de regio van belang voor de bijzondere studie, en kan veranderen door het type studie of monster. Daarom voor het bestellen van inleidingen, is het belangrijk om te bevestigen wat ruimte van het 16S rRNA beste versterkt de microben van belang voor de bijzondere studie. Dit protocol zoals geschreven is voor versterking van het 16S V4 regio. Als er verschillende inleidingen/regio zijn geselecteerd, kan dan de onthardende temperatuur in de temperatuurcycli aanpassing vereist.
    1. Werken in het PCR-werkstation te bereiden alles.
    2. Neem 50-100 µL van DNA-monsters van-20 ° C, en alle van de reagentia die nodig zijn, en hen in de ijskast ontdooien. Vortex en kort draaien naar beneden.
    3. De inleidingen zijn vooraf verdund tot de concentratie van de werken van 5 µM in een minimale hoeveelheid 20 µL.
    4. Voorbereiding van de master mix van PCR in de specifieke 5 mL tube met alleen de voorwaartse primer volgens de berekening op het werkblad.
  3. Voorbereiden van de robotic vloeibare handler op geautomatiseerde PCR setup
    1. Bij monsters moet nemen van het instrument van een 32-well monster adapter en laden 50-100 µL van DNA-monsters volgens de 96-wells-plaat kaart volgens de instructies van de fabrikant.
      1. Voor elke PCR plaat, instellen 2 negatieve controles door het plaatsen van 30 µL van het PCR water in een schone monsterbuisje.
      2. Plaats alle monsters op het 32-well instrument steekproef adapter met doppen vergrendeld in open positie.
    2. Voor de omgekeerde inleidingen9
      1. Verwijder de dop van elke omgekeerde primer met specifieke barcode # 's één tegelijk (verandering handschoenen tussen Kruis-om verontreiniging te voorkomen).
      2. Plaats een maximum van 32 inleidingen op het instrument reagens adapter.
    3. Neem een plaat van de PCR 96-Wells en geef deze het label met de naam van de studie, monster nummer, datum, en de technicus de initialen.
    4. Laden van de robot vloeibare handler
      1. Plaats de adapter reagens in positie B1. Ter vermijding van een randeffect, zorgvuldig plaats een van de randen van de adapter tegen de zijkant van de handgreep en breng de andere rand langzaam naar beneden. Zorg ervoor dat druk op alle hoeken van de adapters.
      2. Plaats de adapter van de steekproef in positie C1. Zorg ervoor dat druk op alle hoeken van de adapters.
      3. Vortex de master mix van 5 mL, open het GLB, en plaats het in positie A op de master mix en reagens blok van het instrument.
      4. Plaats de PCR-plaat op de adapter van de 96-Wells-instrument dat bedoeld is om te houden van half skirted PCR platen.
      5. De run start en opslaan als een nieuw bestand.
      6. Volg de aanwijzingen en check Markeer elke prompt: één, tips zijn beschikbaar, twee, afgewerkte doos is beschikbaar, en drie, beginnen.
    5. Nadat de run voltooid is, controleert u of er geen fouten zijn door het controleren van de machine voor foutberichten.
    6. Afdichting van de plaat met de 12 of 8 strip caps, vortex krachtig, en spin down voor 1 min met behulp van een 96-wells-plaat spinner en plaats deze op het ijs of in de koelkast.
    7. Verwijderen van buizen met omgekeerde inleidingen en monsters.
    8. Neem de 96-wells-plaat naar de kamer na versterking en laden van de plaat op de thermische cycler en de cyclus volgens de tabel van thermisch-Fiet & Mountainbike voorwaarden (Zie tabel 1).

4. gerichte 16S Post-PCR kwaliteitscontrole met behulp van Tape-gebaseerd Platform voor de Elektroforese van het Gel

Opmerking: Post-PCR kwaliteitscontrole (QC) en alle volgende stappen worden uitgevoerd in een daarvoor aangewezen gedeelte van de post versterking van het lab. Het DNA wordt geanalyseerd in een geautomatiseerde DNA/RNA fragment analyzer.

  1. Gebied van werkvoorbereiding
    1. Reinig het werkstation door spuiten die alle oppervlakken in gebruik met een RNase, DNase, DNA decontaminant, gevolgd door DI water twee keer, en ten slotte 70% ethanol.
    2. Verzamel alle benodigdheden en apparatuur die nodig is.
  2. Bereiden van reagentia
    1. Plaats monster buffer en ladder in de vortexer temperatuurgevoelig bij 25 ° C gedurende ten minste 30 min.
  3. Terwijl de reagentia zijn warming-up, PCR monsters te bereiden door het bundelen van de 3 PCR wordt gerepliceerd voor elk monster in een enkele buis
  4. Monsters op instrument laden.
  5. Kort vortex en spin down buizen met gebundelde PCR product.
  6. Plaats van het instrument 96-wells-plaat op een rek op RT en geef deze het label.
  7. Kort vortex en spin down de monster buffer en ladder.
  8. Voeg 3 µL monster buffer toe aan elk putje van de 96 goed plaat (behoefte ten minste 53 µL/scherm tape).
  9. Uitvoeren van een even aantal monsters; Als er oneven aantal monsters, Voeg 4 µL van monster buffer aan een lege putje.
  10. Voeg 1 µL van ladder naar een ladder ook.
  11. Na de kaart, 1 µL van gebundelde PCR product toevoegen aan haar aangewezen goed.
  12. Afdekplaat met folie afdichting
  13. Vortex de plaat met behulp van de vortexer en de adapter van het instrument op 2.000 rpm voor 1 min.
  14. Spin opnieuw naar positie het monster aan de onderkant van de buis, als er bubbels spin naar beneden.
  15. Start de software.
  16. De scherminfo tape en laden in het instrument laden.
  17. Monsters in de fragment-analyzer met een 96-Wells-adapter te laden.
  18. Instellen van een run met de controller-software.
  19. Zorg ervoor dat u zelfs genummerde wells.
  20. Schrijven monster IDs.
  21. Controleer dat alle putjes van de cassette scherm grijs zijn gemarkeerd.
  22. Zorg ervoor dat de analyzer herkent alle uiteinden van de pipet.
  23. Selecteer start en geef een bestandsnaam als de resultaten (studie naam, monster getallen en datum) wilt opslaan.
  24. Verwijzen naar de instructies van de fabrikant voor meer informatie.
  25. Na de run voltooid is, gooi tip, scherm tape en buizen.
  26. Analyseren van gegevens voor 16S piek nM (tussen 315-450 bp voor V4). Deze piek hangt af van de inleidingen geselecteerd.

5. bibliotheek berekening, bundeling, Clean-up, en QC

  1. Na het bepalen van de grootte van de amplicon en molarity van alle monsters, bundelen de bibliotheken om de gewenste eindvolume en nM voor de gepoolde bibliotheek te bereiken (zie voorbeeld berekening).
  2. Sanering en concentraat de gepoolde bibliotheek met behulp van een zuivering silica membraan-gebaseerde kit voor PCR producten, volgens de fabrikant protocol (Zie Tabel van materialen).
    1. Elueer het DNA met een eindvolume van 50 µL.
  3. Meten van de concentratie van de schoongemaakte bibliotheek onmiddellijk met behulp van een dubbele gestrande DNA hoge gevoeligheid kit voor een Fluorimeter, volgens protocol van de fabrikant.
    1. Verdun 2 µL van de gebundelde en gereinigd bibliotheek met 198 µL van de verdunning buffer plus kleurstof (1:100 verdunning).
    2. De gemeten waarde van het fluorimetrische apparaat opnemen en zet het volgens de verdunningsfactor.
  4. Met behulp van de concentratie (ng/µL) lezen voor de gepoolde bibliotheek, berekenen de bibliotheek molarity in nM. 1 µL onverdund bibliotheek gebruiken voor het meten van de OD260/280 op een microvolume spectrofotometer.
    Opmerking: De waarde van 1.8-2.0 geeft voldoende zuiverheid van de bibliotheek.
  5. Bewaren de definitieve bibliotheek bij-20 ° C tot klaar voor de volgende generatie sequencing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het hier gepresenteerde protocol omvat belangrijke kwaliteitscontrole (QC) stappen om ervoor te zorgen dat de gegevens die zijn gegenereerd meet benchmarks voor de gevoeligheid, specificiteit en besmetting control protocol. Van het protocol eerste QC stap volgt PCR versterking van het 16S V4 regio (Figuur 2). Één µL van het PCR-product van elk monster werd geanalyseerd door elektroforese om te bevestigen dat er binnen het bereik van de verwachte grootte van 315-450 bp (Figuur 2, rode pijl). Sommige menselijke melkmonsters gegenereerd lagere hoeveelheden specifieke product (figuur 2A, vergelijk rijstroken 3 en 9 / 11 met rijstroken 4-8), suggereren of lage niveaus van microbiële DNA in die monsters, of overdracht van PCR remmers gewonnen tijdens de extractie. Voor monsters die minder dan 2.0 produceren nM van product in het 315-450 bp bereik (figuur 2A, lane 7), PCR-remmer schoonmaakbeurt is uitgevoerd-out met een enkele stap kit en het monster is opnieuw versterkt. Slagingspercentages voor herstel van monster amplificatie na schoonmaakbeurt ongeveer 40 is %. Kwantificatie van specifieke product voor elk monster (figuur 2B) is van essentieel belang voor het bepalen van het vereiste volume voor gelijke molaire poolen van monsters voor het rangschikken. Een gepaarde bibliotheek voor gerichte sequencing wordt meestal gedomineerd door een specifiek PCR product (Figuur 3). Als er een aanzienlijke hoeveelheid niet-specifieke product in de bibliotheek, moet een gel-zuivering stap worden toegevoegd aan de werkstroom.

In het voorbeeld gepresenteerd in figuur 2A, zwakke banden worden waargenomen voor buffer besturingselementen (v.Chr.; rijstroken 2 en 12) en de PCR water negatieve controle (PC; lane 1), met vermelding van mogelijke verontreiniging van het milieu of reagens. Bands zijn niet ongebruikelijk en meestal vertegenwoordigen lage hoeveelheid PCR product (dat wil zeggen, < 1 nM) en enkele Lees graven produceren tijdens het rangschikken (< 1.000). Representatieve rangschikkend resultaten (Figuur 4) bevestigen dat deze voorbeelden inderdaad zeer lage sequencing lezen graven (figuur 4A, rijstroken 1 en 11 hoeft; Figuur 4B, Buffer en PCR Water rijstroken) en, belangrijker, de samenstelling van de taxa voor de controlemonsters is verschillend van de menselijke melkmonsters (figuur 4A; vergelijk rijstroken 1 en 11 met rijstroken 2-10). Hoge lees graven in de negatieve controles, samen met de aanzienlijke overlap in taxa samenstelling tussen besturingselementen en monsters, suggereert kruisbesmetting en de noodzaak van verbeterde besmetting controle.

Sequencing resultaten (Figuur 4) tonen aan hoge diversiteit in de taxa die is gekoppeld aan de menselijke melk microbiome en variabiliteit in het aantal sequencing Lees telt voor elk monster (figuur 4A, rijstroken 2-10). Daarentegen de sequencing resultaten voor de bacteriële mock die is verwerkt samen met de menselijke melkmonsters aangetoond taxa samenstelling en lees graven die vergelijkbaar met de resultaten die zijn verkregen voor de mock in eerdere runs van de werkstroom waren (Vergelijk figuur 4A , lane 12 met figuur 4B, mock rijstroken). De consistente resultaten voor de mock rijstroken suggereren dat de waargenomen variabiliteit voor het menselijke melkmonsters een authentiek experimentele resultaat, en niet een functie van intrinsieke werkstroom variabiliteit is.

Figure 1
Figuur 1: stroomschema van de gerichte 16S Sequencing pijpleiding. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: analyse van de kwaliteitscontrole van 16S V4 waarbij. (A) Gel beeld van 16S V4 waarbij opgelost door elektroforese met behulp van een geautomatiseerde DNA/RNA fragment analyzer. 16S V4 waarbij werden gegenereerd volgens Caporaso et al. 9en één µL van elke PCR product werd geanalyseerd met behulp van hoge gevoeligheid DNA reagentia volgens de richtlijnen van de fabrikant. Meest menselijke melkmonsters (banen 3-6 en 8-11) en de bacteriële mock (lane 13) geproduceerd een primair PCR product op de verwachte grootte van ongeveer 400 bp (rode pijl). De menselijke melkmonster in baan 7 mislukt te produceren een aanzienlijke hoeveelheid specifiek product en was onderworpen aan opruimen en opnieuw versterking. Minimale product werd gedetecteerd voor de negatieve controle van PCR (PC, lane 1) en lysis buffer negatieve controles (BC, rijstroken 2 en 12) aangegeven minimale besmetting aanwezig in de geanalyseerde monsters. MW, moleculair gewicht Markeringen: bovenste rode en lagere groene balken identificeren de 1.500 bp en 25 bp grootte markers, respectievelijk, in elke baan. (B) Top Electropherogram van baan 3 uit gel in (A). Het primaire PCR product valt onder de regio van de piek gedefinieerd door de rode verticale balken en bestaat uit fragmenten, variërend in grootte van 299-497 bp resulterend in een gemiddelde grootte van PCR product van 396 bp. Gating wordt gedaan op een iets breder gamma dan de verwachte amplicon grootte (i n dit geval 315-450 bp) om er zeker van te nemen de gehele steekproef piek. De bovenste en onderste toppen correleren met fragment grootte van 25 bp en 1.500 bp, respectievelijk. Onder: grafiek de grootte-parameters voor de piek-regio, de concentratie in ng/µL van het PCR product binnen de piek-regio, en de molarity in nM van het PCR product samen te vatten. Deze informatie wordt vervolgens gebruikt om te berekenen hoeveel van elk monster zal worden samengevoegd in een gelijke molaire bibliotheek voor het rangschikken (zie voorbeeld berekening). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Electropherogram van de bibliotheek van een gebundelde en geconcentreerde sequencing. Gelijke molaire hoeveelheden van afzonderlijke monsters te worden sequenced werden samengevoegd in een gepoolde bibliotheek. De bibliotheek was dan gereinigd en geconcentreerd tot een totaal volume van 50 µL met behulp van een PCR op basis van silica-membraan opruimen kit. Laatste voorbereiding van de bibliotheek voor het rangschikken op de volgende generatie sequencer werd uitgevoerd volgens protocol van de fabrikant. Deze bibliotheek werd met succes sequenced ondanks de aanwezigheid van extra bands. Als er een bezorgdheid over PCR producten buiten het bereik van de verwachte grootte, stelt de fabrikant protocol de toevoeging van een gel grootte selectie stap. Deze QC stap is meestal niet uitgevoerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: evaluatie van negatieve en positieve controles. (A) de relatieve abundanties van bacteriële taxa van de partij van een extractie met besturingselementen en menselijke melkmonsters. Als een maatregel van QC, worden composities van elke batch van de extractie zoals deze zijn geladen op de geautomatiseerde DNA/RNA zuivering instrument gegenereerd onmiddellijk na een volgorde uitvoeren. Getallen onder elk monster balk aan te geven hoeveel van gefilterde luidt voor het respectieve monster. De composities van de buffer controles zijn verschillend van die van de menselijke melkmonsters. (B) relatieve abundanties van bacteriële taxa in buffer, mock en PCR besturingselementen. Aantal leest en samenstelling worden geëvalueerd voor alle negatieve (buffer en PCR water) en positief (bacteriële mock) besturingselementen. De composities van de buffer en water variëren, maar de mock Gemeenschap blijft vrij stabiel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gerichte volgende-generatie sequentiebepaling van het 16S rRNA is een veel gebruikte, snelle techniek voor microbiome karakterisering18. Echter kunnen vele factoren, met inbegrip van de effecten van de batch, milieuverontreiniging, monster kruisbesmetting, gevoeligheid en reproduceerbaarheid negatief beïnvloeden van experimentele resultaten en beschamen hun interpretatie7,19 , 20. om beste robuuste 16S analyses, microbiome werkstromen moeten nemen goede proefopzet, het gebruik van passende controles, ruimtelijke segregatie van Werkstroomstappen, en de toepassing van beste praktijken. Het protocol hier beschreven omvat elk van deze parameters en biedt belangrijke experimentele hulpmiddelen voor de bovengenoemde problemen aan te pakken en uit te voeren een 16S workflow voor verschillende monsters.

Goede experimentele design is van cruciaal belang voor 16S microbiome analyses. Het gaat hierbij om correcte inzameling en opslag van monsters, alsook selectie 16S inleidingen geschikt is voor de regio van belang. Bijvoorbeeld, is de V4-regio (515F/806R) geselecteerd voor menselijke melk omdat er goede versterking van Bifidobacterium, die een belangrijke rol in de ontwikkeling van de neonatale gut microbiome21 speelt. Andere sets primer (b.v., 27F/338R, 515F/926R) wellicht meer geschikt voor studies van andere microbiële gemeenschappen. Een belangrijke opmerking is dat de temperatuur voor de gerichte 16S gloeien PCR en de verwachte amplicon grootte kunnen variëren op basis van primer selectie.

Andere plaatsen die het protocol kan worden gewijzigd zijn gebaseerd op de resultaten van de stappen van de QC opgenomen in de workflow. Een paar mogelijkheden voor het oplossen van problemen wanneer er geen of weinig DNA wordt gedetecteerd na de gerichte 16S PCR versterking stap. 1) het monster kan worden gebracht door middel van een PCR stap voor de verwijdering van de Inhibitor van de omwenteling. Versterking volgende PCR remmer verwijderen met behulp van een enkele stap kit uitgevoerd per protocol van de fabrikant is ongeveer veertig procent van de tijd, 2 succesvolle) meer geëxtraheerde DNA kan worden toegevoegd aan de gerichte 16S PCR, of 3) een nieuw en potentieel grotere hoeveelheid melk kan verwerkt worden, indien beschikbaar. Als er een bezorgdheid over PCR producten buiten het bereik van de verwachte grootte na de silica membraan-gebaseerde zuivering van de bibliotheek, kan de zuivering van een gel worden toegevoegd. Tot slot zijn de QC stappen cruciaal om te bepalen als er sprake is van besmetting, die in detail hieronder wordt besproken. Als significante besmetting wordt ontdekt, dan afhankelijk van waar de besmetting is ingevoerd, ofwel de PCR kan worden herhaald, of indien nodig, het monster opnieuw gewonnen kan worden. Gelukkig, met goede laboratoriumpraktijken, dit zijn zeldzame gebeurtenissen. Tot slot, terwijl dit protocol is geschreven wil waarschuwingen in de versterking van lage biomassa monsters en specifiek menselijke melk, het protocol kan eenvoudig worden aangepast voor de amplificatie van orale, rectale, vaginale en huid swabs of sponzen, evenals kruk. Als andere typen monster worden gekozen, is dan overwogen waarnaar extractie kits optimaal voor het specifieke monster type zijn.

Batch effecten als gevolg van kits, reagentia of sequencing loopt zijn belangrijke bronnen van variabiliteit in microbiome studies. DNA-extractie-kits, samen met andere reagentia, bezitten lage niveaus van bacteriële DNA, die aanzienlijk door veel20,22,23,24 variëren kunnen. Voor een groot project, met behulp van één partij van kits, reagentia, het selecteren van kits die zijn ontworpen om te minimaliseren van verontreiniging van de kit kan vereenvoudigen analyse7. Monsters van zowel de onderwerpen en de besturingselementen worden naast elkaar verwerkt. Het is best als alle monsters voor een één studie, beide onderwerpen en beheersen, kunnen worden opgenomen in een enkele volgorde uitvoeren. Als een groot aantal monsters te verwerken in batches, zijn monsters die representatief voor zowel de onderwerpen en de besturingselementen zijn opgenomen in elke partij en samen verwerkt. Het is ook belangrijk om te organiseren batch-verwerking om te minimaliseren van verontreiniging van monsters van de lage-biomassa (d.w.z., menselijke melk) door monsters die hoge biomassa (d.w.z., kruk). In dergelijke gevallen verwerken lage biomassa monster typen eerste en vervolgens hoge biomassa monsters voor dezelfde studie.

Lage biomassa monsters vormen unieke uitdagingen aan microbiome studies, als verontreiniging van het milieu, reagentia, instrumenten, en de onderzoeker kan maken het moeilijk om te onderscheiden tussen authentieke communityleden aanwezig in lage overvloed7 , 25 , 26 en die kunstmatig zijn ingevoerd om het monster door de experimentele proces19. De hier beschreven werkstroom bevat belangrijke experimentele negatieve controles bij zowel de sample voorbereiding stap (dit is een alleen-buffer lysis control), en de PCR (PCR watercontrole) (Zie Figuur 4). Deze besturingselementen kunnen identificeren van de bronnen van verontreiniging en vergemakkelijken van doeltreffende corrigerende maatregelen op de Bank of in silico27,28,29,30. Negatieve controles zijn zorgvuldig geëvalueerd en gerapporteerd met de studie resultaten7.

Tot een minimum beperken van verontreiniging, ruimtelijke segregatie van experimentele activiteiten in een schone pre-PCR versterking gebied en na versterking gebied is belangrijk. Optimaal, de cleanroom heeft zowel een oppervlakte voor PCR master mix voorbereiding en een monster voorbereiding/toevoeging van meester Meng gebied, en een aparte dode lucht doos of een biologische veiligheid kabinet huisvesting toegewijde verbruiksartikelen kunnen nemen en kleine apparatuur die nodig zijn voor de Master mix voorbereiding. Het ontwerp in cleanroom is een systeem van positieve luchtstroom met hoog rendement deeltjes (HEPA) aanzuigfilter. Gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen is essentieel voor het behoud van een gecontroleerde, lage-microbiële omgeving omvat haarnetjes, Labjassen, handschoenen, en schoenovertrekken. Kits/reagentia en monsters worden idealiter opgeslagen in afzonderlijke speciale koelkasten vrieskasten. PCR setup wordt ook uitgevoerd in de cleanroom in aangewezen werkstations; duidelijke scheiding van primer voorraden en reagentia van geëxtraheerde DNA wordt gehandhaafd totdat monsters worden geladen op de geautomatiseerde pipetting platform. Zodra een PCR setup voltooid is, is de plaat overgebracht naar het gebied na versterking en geladen op een thermische cycler.

Het is belangrijk dat het beperken van de stroom van werkzaamheden uit schone gebieden na versterking gebieden; Er bestaat geen retrograde verkeer van reagentia, instrumenten of leveringen uit na versterking gebieden aan de schone omgeving. Personeel die een van de gebieden die na versterking hebt ingevoerd zijn uitgesloten van post naar de schone omgeving voor 24 uur (tot de volgende dag). Naast de bovenstaande overwegingen van de werkstroom, moet schoonmaken van de protocollen worden uitgevoerd in zowel schoon als na versterking gebieden om te minimaliseren van nucleïnezuur besmetting van werkoppervlakten en instrumentatie. Als fysieke barrières of aparte kamers niet mogelijk zijn, moeten alle inspanningen worden genomen om het werk in gebieden zo ver uit elkaar mogelijk.

Naast besmetting, microbiome studies uitgedaagd door gevoeligheid, variabiliteit en reproduceerbaarheid31. Deze protocoladressen deze kwesties door de integratie van een gedefinieerde bacteriële mock Gemeenschap die is geëxtraheerd, versterkt en sequenced samen met elke batch monsters (Zie figuur 4b). Dit besturingselement biedt een constante interne verwijzing die wordt geëvalueerd als de reproduceerbaarheid van de experimentele resultaten gegenereerd, en kan worden gebruikt voor het oplossen van problemen die zich voordoen. Bijvoorbeeld, kan de kwaliteit van het uitgepakte mock DNA voorzien in een metriek lysis van de effectieve monster en DNA-extractie, welke genomic DNA-besturingselementen missen. Kwaliteitscontrole van PCR waarbij voor de mock steekproef kan ook aangeven PCR efficiëntie en specificiteit. Bovendien, omdat de mock bestaat uit meerdere types van bacteriën, de relatieve gevoeligheid voor een verwerkte partij monsters kan worden afgeleid door een vertegenwoordiging van taxa in de resultaten van de volgorde voor de mock monster. Een ideale mock Gemeenschap zal evalueren de mogelijkheid om te detecteren van belangrijke bacteriële soorten in het compartiment wordt geanalyseerd, en dus de samenstelling van de mock Gemeenschap wellicht per studie verschillen. Zoals blijkt uit figuur 4a, er is aanzienlijke variabiliteit tussen voorbeeldresultaten sequencing, maar de reeks resultaten voor de bacteriële mock Gemeenschap is zeer reproduceerbaar (Zie figuur 4b).

Terwijl de mock Gemeenschap in Figuur 4 een unieke mix van 33 stammen van een combinatie van commercieel beschikbaar en lokale klinische isolaten is, is een commercieel beschikbare mock communautaire onlangs ontwikkelde32.

Hoewel de hier beschreven werkstroom wordt beperkt in zijn vermogen om globaal adres reproduceerbaarheid over verschillende microbiome studies, biedt maar wel een belangrijke experimentele aanpak waarmee onderzoekers te nemen passende experimentele besturingselementen en reproduceerbaarheid van de monitor binnen hun eigen resultaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We zouden graag bedanken Helty Adisetiyo, PhD en Shangxin Yang, PhD voor de ontwikkeling van het protocol. Algemene steun voor de internationale moeders Pediatric Adolescent AIDS klinische proeven groep (IMPAACT) werd verzorgd door de nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekten (NIAID) van de National Institutes of Health (NIH) onder de nummers van de Award UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) en UM1AI106716 (IMPAACT LC), met medefinanciering uit de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health en menselijke ontwikkeling (NICHD) en het National Institute of Mental Health (NIMH). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AllPrep RNA/DNA Mini Kit Qiagen 80204 DNA/RNA extraction kit
Eliminase Fisher Scientific 435532 RNase, DNase, DNA decontaminant
Thermo Mixer Fisher Scientific temperature-controlled vortexer
Buffer RLT plus Qiagen 1053393 guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689-25ML-F ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME Beads MP Biomedicals 116914050 bead tube
QIAgen TissueLyzer Qiagen 85300 automated sample disruptor adapter set
QIAshredder column Qiagen 79654
QIAgen RB tube manufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticware Qiagen 9001292 automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plus Applichem A7089 non-enzymatic decontamination solution
EB Buffer Qiagen 19086 elution buffer
QIAgility and related plasticware Qiagen 9001532 robotic liquid handler
PCR water MO BIO 17000-
5PRIME HotMasterMix Quantabio 2200400
Barcoded reverse primers Eurofin No Catalog #'s designed and ordered
96 well PCR plate USA scientific 1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticware Agilent G2964AA automated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation Agilent 5067-5585 Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit Zymo Research 50444470 PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32854 dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216
NanoDrop Thermo Fisher microvolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kit Illumina 15033624/15033626
MiSeq Illumina No Catalog #'s next generation sequencer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
  2. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
  3. Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
  4. Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
  5. Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
  6. Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
  7. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
  8. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
  9. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  10. Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
  11. Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
  12. Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
  13. Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
  14. Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
  15. Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
  16. Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
  17. Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
  18. Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
  19. Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
  20. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  21. Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
  22. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
  23. Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
  24. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
  25. Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
  26. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
  27. Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
  28. Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
  29. Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
  30. Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
  31. Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
  32. ATCC. Mock microbial communities. , Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017).

Tags

Immunologie en infecties probleem 133 16S ribosomaal RNA Microbiome Next-Generation Sequencing moedermelk menselijke melk lage biomassa
Een methode voor gerichte 16S sequentiebepaling van menselijke melkmonsters
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih,… More

Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih, S., Lee, D. J., Li, F., Aldrovandi, G. M. A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples. J. Vis. Exp. (133), e56974, doi:10.3791/56974 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter