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Immunology and Infection

मानव दूध नमूनों की लक्षित 16S अनुक्रमण के लिए एक विधि

Published: March 23, 2018 doi: 10.3791/56974
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, University of California at Los Angeles

Summary

एक अर्द्ध स्वचालित कार्यप्रवाह मानव दूध और अन्य कम बायोमास नमूना प्रकार से 16S rRNA के लक्षित अनुक्रमण के लिए प्रस्तुत किया है ।

Abstract

माइक्रोबियल समुदायों के अध्ययन अपेक्षाकृत सस्ती, तेजी से, और उच्च प्रवाह अनुक्रमण के विकास के साथ बड़े पैमाने पर हो गए हैं । हालांकि, इन सभी तकनीकों के साथ के रूप में, reproducible परिणाम एक प्रयोगशाला कार्यप्रवाह है कि उचित सावधानियों और नियंत्रण को शामिल पर निर्भर करते हैं । यह कम बायोमास के नमूनों के साथ विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जहां बैक्टीरिया का डीएनए भ्रामक परिणाम उत्पन्न कर सकता है । यह लेख एक अर्द्ध स्वचालित कार्यप्रवाह 16S राइबोसोमल आरएनए (rRNA) V4 क्षेत्र के लक्षित अनुक्रमण का उपयोग कर मानव स्तन दूध नमूनों से रोगाणुओं की पहचान करने के लिए एक कम-मध्य प्रवाह पैमाने पर विवरण । प्रोटोकॉल सहित पूरे दूध से नमूना तैयारी का वर्णन: नमूना lysis, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण, 16S rRNA जीन के V4 क्षेत्र के प्रवर्धन, और गुणवत्ता नियंत्रण उपायों के साथ पुस्तकालय तैयारी. महत्वपूर्ण बात, प्रोटोकॉल और चर्चा मुद्दों है कि तैयारी और उचित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण, पीसीआर अवरोधक हटाने, पर्यावरण द्वारा नमूना संदूषण, रिएजेंट, या सहित कम बायोमास नमूनों के विश्लेषण के लिए मुख्य है पर विचार प्रायोगिक सूत्रों, और प्रयोगात्मक सर्वोत्तम reproducibility सुनिश्चित करने के लिए डिजाइन प्रथाओं । जबकि प्रोटोकॉल के रूप में वर्णित मानव दूध के नमूनों के लिए विशिष्ट है, यह कई कम और उच्च बायोमास नमूना प्रकार, झाड़ू पर एकत्र नमूनों, जमे हुए स्वच्छ, या एक संरक्षण बफर में स्थिर सहित के लिए अनुकूलनीय है ।

Introduction

माइक्रोबियल समुदायों कि उपनिवेश मनुष्यों को गंभीर मानव स्वास्थ्य और रोग चयापचय को प्रभावित करने के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है, प्रतिरक्षा विकास, रोग के लिए संवेदनशीलता, और टीकाकरण और ड्रग थेरेपी के लिए प्रतिक्रियाएं1, 2. मानव स्वास्थ्य पर microbiota के प्रभाव को समझने के प्रयास वर्तमान में परिभाषित शारीरिक डिब्बों के साथ जुड़े रोगाणुओं की पहचान पर जोर (यानी, त्वचा, पेट, मौखिक, आदि), साथ ही साथ स्थानीयकृत साइटों के भीतर ये कंपार्टमेंट3,4. Underpinning इन खोजी प्रयासों तेजी से उद्भव और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) प्रौद्योगिकियों कि एक नमूना के माइक्रोबियल आनुवंशिक सामग्री (microbiome) के विश्लेषण के लिए एक व्यापक समानांतर मंच प्रदान की वृद्धि की पहुंच है । कई शारीरिक नमूनों के लिए, संबद्ध microbiome दोनों जटिल और प्रचुर मात्रा में है (यानी, मल), लेकिन, कुछ नमूनों के लिए, microbiome कम माइक्रोबियल बायोमास (यानी, मानव दूध, लोअर श्वसन तंत्र) द्वारा प्रतिनिधित्व किया जाता है जहां संवेदनशीलता, प्रयोगात्मक कलाकृतियों, और संभावित संदूषण प्रमुख मुद्दे बन जाते हैं । microbiome अध्ययन और उचित प्रयोगात्मक डिजाइन की आम चुनौतियों एकाधिक समीक्षा लेख5,6,7,8का विषय रहा है ।

प्रस्तुत करवायी rRNA 16S V4 क्षेत्र9 के लक्षित अनुक्रमण पर आधारित एक सुदृढ़ NGS प्रायोगिक पाइपलाइन है जो मानव दूध की microbiome को चिह्नित करने के लिए है । मानव दूध के Microbiome विश्लेषण न केवल एक स्वाभाविक कम माइक्रोबियल बायोमास10द्वारा जटिल है, लेकिन इसके अतिरिक्त मानव डीएनए पृष्ठभूमि के उच्च स्तर से11,12,13,14 और पीसीआर अवरोधकों के संभावित carryover15,16 में निकाले न्यूक्लिक एसिड । यह प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध निष्कर्षण किटों और अर्द्ध-स्वचालित प्लेटफ़ॉर्म पर निर्भर करता है जो नमूना तैयारी बैचेस में परिवर्तनशीलता को ंयूनतम करने में मदद कर सकते हैं । यह एक अच्छी तरह से परिभाषित बैक्टीरियल नकली समुदाय है कि नमूनों के साथ एक गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में संसाधित है प्रोटोकॉल में हर कदम को मांय और पाइपलाइन मजबूती के एक स्वतंत्र मीट्रिक प्रदान शामिल है । हालांकि के रूप में वर्णित प्रोटोकॉल मानव दूध के नमूनों के लिए विशिष्ट है, यह आसानी से मल, गुदा, योनि, त्वचा, areolar, और मौखिक झाड़ू सहित अंय नमूना प्रकार के लिए अनुकूलनीय है10,17, और के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में सेवा कर सकते है जो microbiome विश्लेषण प्रदर्शन की इच्छा शोधकर्ताओं ।

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Protocol

सभी प्रोटोकॉल चरणों के लिए, उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (पीपीई) पहना जाना चाहिए, और कड़े संदूषण रोकथाम दृष्टिकोणों को लिया जाना चाहिए । पूर्व प्रवर्धन कार्य क्षेत्रों से काम के प्रवाह के बाद प्रवर्धन कार्य क्षेत्रों के लिए नमूनों के संदूषण को कम करने के लिए निरीक्षण । उपयोग की जाने वाली सभी आपूर्ति बाँझ, RNase, DNase, डीएनए, और पायरोजेन से मुक्त हैं । सारे पिपेट टिप्स छान आहेत. प्रोटोकॉल चरणों का एक फ़्लोचार्ट प्रदान किया गया है (चित्र 1) ।

1. नमूना Lysis

नोट: नमूना lysis और न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण एक साफ कमरे के माहौल में एक डीएनए/जहां दोनों इंजीनियरिंग और प्रक्रियात्मक नियंत्रण के नमूने के लिए पर्यावरणीय जीवाणुओं की शुरूआत को कम करने के लिए जगह में है का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं ।

  1. कार्य क्षेत्र की तैयारी
    1. स्वच्छ सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) उचित सतह क्लीनर के साथ काम क्षेत्र किसी भी न्यूक्लिक एसिड संदूषण को समाप्त करने के लिए ।
    2. तापमान नियंत्रित भंवर पर बारी है, और यह 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट ।
  2. तैयार guanidinium thiocyanate lysis बफर (सामग्री की तालिका देखें)
    1. हाला के लिए lysis बफ़र की जांच करें । पुनः भंग 37 ° c पर वार्मिंग से हाला ।
    2. तैयार 600 µ l के साथ lysis बफर के 6 µ l β-mercaptoethanol (β-ME) प्रत्येक नमूने के लिए. प्रति नमूना एक अतिरिक्त 20% मात्रा पर विचार करें ।
  3. नमूना तैयारी
    1. अगर साबुत दूध जम जाए तो इसे बर्फ पर गल जाए । एक 15 मिलीलीटर या बीएससी में 5 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में पूरे दूध की 5 मिलीलीटर Aliquot और बर्फ पर रखें ।
    2. 5 मिलीलीटर दूध aliquot 10 मिनट के लिए 5,000 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर गोली कोशिकाओं को स्पिन ।
    3. फैट की लेयर निकालें, अब ट्यूब में ऊपर की लेयर, एक प्लास्टिक रंग या बड़े बोर पिपेट टिप के साथ लें ।
    4. गोली परेशान बिना, 100 µ एल के लिए छोड़कर सभी supernatant हटा दें ।
    5. बाँझ फॉस्फेट के 1 मिलीलीटर में reसस्पैंड द्वारा गोली धो खारा (पंजाब) ।
    6. एक 5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए बाँझ पंजाबियों की 1 मिलीलीटर जोड़कर 1 नकारात्मक नियंत्रण तैयार करते हैं ।
    7. एक साफ 1.5-एमएल केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए निलंबन स्थानांतरण, और 1 मिनट के लिए एक microcentrifuge में स्पिन ((आरटी) कमरे के तापमान पर 5,000 x जी) ।
    8. उपयोग एक 1,000 µ l बाँझ फ़िल्टर्ड पिपेट टिप पूरी supernatant/फैटी परत को त्यागने के लिए
    9. यदि एक ही दिन निकालने नहीं, स्नैप यह एक इथेनॉल/सूखी बर्फ के घोल में डाल द्वारा सेल गोली फ्रीज, और तुरंत यह करने के लिए स्थानांतरण-80 ° c फ्रीजर ।
  4. नमूना व्यवधान और homogenization (मनका-पिटाई)
    1. जोड़ें 600 µ एल के lysis बफर युक्त β-मुझे गोली करने के लिए, और एक मनका ट्यूब के निलंबन स्थानांतरण ।
    2. 12 के प्रत्येक निष्कर्षण बैच 10 नमूने हैं, 1 नकारात्मक नियंत्रण (ऊपर 3.7 कदम में तैयार), और 1 सकारात्मक नियंत्रण (अगले चरण में तैयार) ।
      1. lysis बफर और बैक्टीरियल नकली नमूने के 20 µ एल के साथ 1 सकारात्मक नियंत्रण तैयार (नकली समुदाय का इस्तेमाल किया एक एकाग्रता है, एक बार निकाला, लगभग 0.2 एनजी/µ एल के डीएनए की) ।
    3. भंवर सभी मनका ट्यूबों जोरदार के लिए 15 एस
    4. 700-800 rpm पर झटकों के साथ, 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर तापमान नियंत्रित भंवर पर हीट नमूने ।
    5. स्वचालित नमूना विघटनकारी एडेप्टर सेट में लोड ट्यूबों ।
    6. मनका 30 हर्ट्ज पर 1 मिनट के लिए मारो ।
    7. अनुकूलक सेट को जुदा और मैन्युअल रूप से उपकरण के सही रोबोट हाथ करने के लिए छोड़ दिया रोबोट हाथ से नमूना प्लेटों के साथ सेट अनुकूलक स्विच ।
    8. मनका 30 हर्ट्ज पर एक और 1 मिनट के लिए मारो ।
    9. १७,२०० x जी पर ट्यूब केंद्रापसारक, 25 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए ।
    10. एक 200 µ एल पिपेट के साथ supernatant के सभी निकालें, नमूना या मनका अवशिष्ट के नमूने के शीर्ष पर फैटी परत के किसी भी प्राप्त करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है, और एक homogenizer स्तंभ के लिए लागू होते हैं ।
    11. अधिकतम गति पर homogenizer कॉलम, १७,२०० x g, 25 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    12. डीएनए और आरएनए की शुद्धि के लिए स्वचालित साधन के साथ उपयोग के लिए एक 2-एमएल निर्माता के microcentrifuge ट्यूब के लिए eluate के 350 µ एल स्थानांतरण (किसी भी अन्य ट्यूब का उपयोग नहीं करते हैं). किसी भी अवशिष्ट फैटी परत हस्तांतरण नहीं सावधान रहना ।
    13. प्रवाह-थ्रू वॉल्यूम 350 µ l से कम है, तो lysis बफ़र के साथ जोड़ें β-मुझे एक अंतिम वॉल्यूम के लिए 350 µ l
    14. न्यूक्लिक एसिड आइसोलेशन स्वचालित डीएनए शुद्धि साधन का उपयोग कर, या पर फ्रीज-80 ° c के लिए आगे बढ़ने से पहले आरटी पर के नमूने 2 ज के लिए छोड़ दें ।
  5. सफाई कार्य क्षेत्र
    1. एक गैर एंजाइमी दूषण समाधान के साथ प्रयोग में सभी सतहों साफ, 10 मिनट के लिए छोड़ दो, तो 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे और सतह के नीचे पोंछ ।

2. अलग डीएनए/

  1. कार्य क्षेत्र की तैयारी
    1. हीट ब्लॉक पर बारी और 70 डिग्री सेल्सियस के लिए तापमान निर्धारित किया है ।
    2. तापमान नियंत्रित भंवर पर बारी और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए तापमान निर्धारित किया है ।
    3. 70 डिग्री सेल्सियस के लिए 50 मिलीलीटर ट्यूब में 10 मिमी Tris-सीएल, पीएच 8.5, युक्त रेफरेंस बफर (EB) को गर्म करें ।
    4. 2 मिलीलीटर ट्यूबों में 37 डिग्री सेल्सियस में जमे हुए नमूना lysates के 350 µ एल को गर्म करें जब तक पूरी तरह से किसी भी हाला (लगभग 10 मिनट) के बिना गल ।
  2. डीएनए शुद्धि
    1. भंवर और 2-एमएल ट्यूबों नमूना संक्षेप के साथ (10 एस के लिए 3000 x g) ।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्वचालित डीएनए/आरएनए शुद्धि साधन के लोडिंग चार्ट के बाद शेखर में 2 मिलीलीटर ट्यूबों डालें ।
    3. रोटर एडेप्टर प्राप्त करें और उन्हें नमूनों की संख्या के आधार पर ट्रे पर सेट करें.
    4. प्रत्येक रोटर एडेप्टर को नमूना की पहचान (ID) के आधार पर लेबल ।
    5. ढक्कन काट और डीएनए और आरएनए के लिए व्यक्तिगत स्पिन स्तंभों के किनारों को चिकनी ।
    6. रोटर एडेप्टर में संग्रह ट्यूब के बिना डीएनए स्पिन स्तंभ डालें । संग्रह ट्यूब छोड़ें ।
    7. लेबल 1.5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूबों, और रोटर एडेप्टर में डालें ।
    8. स्वचालित डीएनए/आरएनए शुद्धि साधन के लोडिंग चार्ट के बाद में रोटर एडेप्टर सेट करें ।
    9. डालें निर्माता के 1,000 µ एल फिल्टर-टिप रैक में युक्तियां ।
    10. (प्रति विशिष्ट मशीन प्रोटोकॉल निर्देश) नमूनों की संख्या के आधार पर एक 2 मिलीलीटर निर्माता के microcentrifuge ट्यूब के लिए RNase-मुफ्त पानी जोड़ें ।
    11. ट्यूब स्लॉट "microcentrifuge ट्यूब स्लॉट के एक" में ट्यूब डालें.
    12. किसी भी एजेंट है कि रिएजेंट बोतलों में छोड़ दिया है और 10 मिलीलीटर की एक ंयूनतम मात्रा के साथ भरें त्यागें ।
    13. एजेंट बोतल रैक (EB बोतल को छोड़कर) में रिएजेंट बोतलों डालें ।
    14. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब से गर्म EB को रिएजेंट बोतल स्थिति 6 में जोड़ें ।
    15. जांच 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों रोटर एडेप्टर में कसकर रखा जाता है ।
    16. उपकरण के ढक्कन बंद करें और चुनें: "आरएनए" → "निष्कर्षण किट" → "पशु, ऊतकों और कोशिकाओं" → "किट का नाम 350 µ एल भाग एक कस्टम डीएनए" → कम बायोमास नमूनों के लिए 100 µ एल (डिफ़ॉल्ट) या 50 µ एल को रेफरेंस वॉल्यूम संपादित करें → "प्रारंभ."
    17. जब पूरा हो, रोटर अनुकूलक बाहर निकालने के केंद्रापसारक और उंहें ट्रे पर जगह है ।
    18. रोटर एडेप्टर स्थिति 3 से डीएनए स्पिन स्तंभ छोड़ें ।
    19. रोटर एडेप्टर को न छोड़ें, आरएनए स्थिति 2 में है ।
    20. 1.5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूबों को 3 स्थान पर eluted डीएनए युक्त निकालें, और − 20 ° c में स्टोर करें ।
    21. किसी भी नमूने पर छोड़ दिया जाता है, अन्यथा त्यागना, शेखर और स्टोर से नमूना युक्त ट्यूबों − 20 ° c में ले लीजिए ।
    22. आरएनए के आगे शुद्धिकरण के लिए प्रोटोकॉल "किट का नाम 350 µ l part B आरएनए" के साथ जारी रखें.
    23. आरएनए शुद्धि लगभग 350 µ l प्रवाह के माध्यम से किया जाएगा कि रोटर एडेप्टर के बीच की स्थिति में है.
  3. आरएनए शुद्धि
    1. इसके संग्रह ट्यूब और ढक्कन के बिना रोटर एडेप्टर में आरएनए स्पिन कॉलम डालें ।
    2. लेबल नई 1.5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूबों और उंहें रोटर अनुकूलक में डालने के रूप में मैनुअल में संकेत दिया ।
    3. स्वचालित डीएनए/आरएनए शुद्धि साधन के लोडिंग चार्ट के बाद में रोटर एडेप्टर सेट करें ।
    4. उपकरण के ढक्कन बंद करें और चुनें: "आरएनए" → "निर्माता की किट" → "पशु, ऊतकों और कोशिकाओं" → "मानक भाग बी आरएनए" → "प्रारंभ करें".
    5. जब पूरा हो, रोटर अनुकूलक बाहर निकालने के केंद्रापसारक और उंहें ट्रे पर जगह है ।
    6. 3 स्थान से आरएनए स्पिन कॉलम त्यागें ।
    7. 1.5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूबों को निकालें जिसमें 30 µ l eluted आरएनए 3 स्थान पर है, और − 80 ° c पर स्टोर करें ।
    8. रिएजेंट बोतलें निकालें ।
    9. उचित खतरनाक अपशिष्ट चैनलों के माध्यम से रोटर अनुकूलक सामग्री के निपटान ।
  4. सफाई कार्य स्टेशन
    1. इस तरह के एजेंट रैक, ट्रे, और एक गैर एंजाइमी दूषण समाधान के साथ उपयोग में किसी भी अन्य सतह के रूप में सभी स्वचालित डीएनए/आरएनए शुद्धि साधन के सामान, स्प्रे 10 मिनट के लिए छोड़ दें और (DI) पानी के साथ कुल्ला, तो उन्हें सूखी ।
    2. केवल निर्माता के साथ स्वचालित उपकरण स्प्रे अनुमोदित गैर एंजाइमी दूषण समाधान, उपयोग में सभी सतहों के साथ साथ केंद्रापसारक के अंदर पोंछ, 10 मिनट के लिए छोड़ दो, और फिर 70% इथेनॉल के साथ पोंछ । प्रदूषित समाधानों के अन्य प्रकारों का उपयोग न करें क्योंकि वे साधन को क्षति पहुँचा सकते हैं.

3. लक्षित 16S पीसीआर सेट अप

नोट: 16S पीसीआर के लिए सेट अप साफ कमरे के भीतर स्थित एक निर्दिष्ट पूर्व प्रवर्धन कार्यक्षेत्र में किया जाता है । रिएजेंट और नमूने तैयार है और फिर एक तरल हेंडलर पर लोड करने के लिए तपसिल में प्रत्येक नमूने के लिए पीसीआर प्रदर्शन (30 नमूने, जो सच नमूने और निष्कर्षण सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं, प्लस तपसिल में 2 पीसीआर जल नियंत्रण, 96 की कुल के लिए संयुक्त नमूनों और नियंत्रण) । एक बार पीसीआर प्रतिक्रियाओं इकट्ठे और सील कर रहे हैं, नमूना प्लेट एक थर्मल साइकिल चालन के लिए एक पद प्रवर्धन क्षेत्र में स्थित करने के लिए स्थानांतरित किया जाता है ।

  1. कार्य क्षेत्र की तैयारी
    1. पीसीआर कार्यस्थान को साफ करे । स्प्रे सभी एक RNase, DNase, डीएनए decontaminant, DI पानी के बाद दो बार, और अंत में 70% इथेनॉल के साथ उपयोग में सतहों ।
    2. 16S पीसीआर वर्कशीट तैयार (देखें लक्षित 16S पीसीआर वर्कशीट) एक सटीक नमूना सूची के साथ, और प्रत्येक नमूने के लिए विभिंन बारकोड प्राइमरों आवंटित9। कार्यपत्रक और प्लेट मैप्स बाहर मुद्रित करें (प्लेट 1 देखें) ।
  2. पीसीआर मास्टर मिक्स वडा
    नोट: 16S प्राइमरी चयन विशेष अध्ययन के लिए ब्याज के क्षेत्र पर आधारित है, और अध्ययन या नमूना प्रकार से बदल सकते हैं । इसलिए, प्राइमरों आदेश देने से पहले, यह 16S rRNA के किस क्षेत्र की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है सबसे अच्छा विशेष अध्ययन के लिए ब्याज की रोगाणुओं को प्रवर्धित । इस प्रोटोकॉल के रूप में लिखा 16S V4 क्षेत्र के प्रवर्धन के लिए है । यदि विभिंन प्राइमरों/क्षेत्र चयनित हैं, तो थर्मल साइकिल चालन में एनीलिंग तापमान समायोजन की आवश्यकता हो सकती है ।
    1. सब कुछ तैयार करने के लिए पीसीआर कार्यस्थान में काम करें ।
    2. -20 डिग्री सेल्सियस से डीएनए नमूनों की 50-100 µ एल बाहर ले लो, और सभी एजेंट की जरूरत है, और बर्फ पर उन्हें गल. भंवर और संक्षेप में नीचे स्पिन ।
    3. प्राइमरों पूर्व कर रहे है 5 µ एम के काम एकाग्रता को पतला 20 µ एल की एक ंयूनतम मात्रा में ।
    4. कार्यपत्रक पर परिकलन के अनुसार केवल फॉरवर्ड प्राइमरी के साथ विशिष्ट 5 एमएल ट्यूब में पीसीआर मास्टर मिक्स तैयार करें ।
  3. स्वचालित पीसीआर सेटअप के लिए रोबोट तरल हेंडलर की तैयारी
    1. नमूनों के लिए, एक 32-well इंस्ट्रूमेंट का नमूना एडेप्टर ले, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार 96-well प्लेट मैप के अनुसार डीएनए नमूनों की 50-100 µ l को लोड करें ।
      1. प्रत्येक पीसीआर प्लेट के लिए, पीसीआर वॉटर के 30 µ l को एक साफ नमूना ट्यूब में रखकर 2 नेगेटिव कंट्रोल्स सेट करें ।
      2. खुली स्थिति में बंद टोपियां के साथ 32-अच्छी तरह से उपकरण नमूना अनुकूलक पर सभी नमूनों प्लेस ।
    2. रिवर्स प्राइमरों के लिए9
      1. एक समय में विशिष्ट बारकोड # एक के साथ प्रत्येक रिवर्स प्राइमर की टोपी निकालें (क्रॉस-दूषण से बचने के लिए बीच में दस्ताने बदलें) ।
      2. यंत्र के रिएजेंट एडेप्टर पर अधिकतम 32 प्राइमर रखें ।
    3. एक 96-well पीसीआर प्लेट बाहर ले जाओ और अध्ययन के नाम, नमूना संख्या, तिथि, और तकनीशियन के प्रथमाक्षर के साथ लेबल ।
    4. रोबोट तरल हैंडलर लोड हो रहा है
      1. स्थिति B1 में रिएजेंट एडेप्टर रखें । आदेश में एक बढ़त प्रभाव से बचने के लिए, ध्यान से पकड़ पक्ष के खिलाफ अनुकूलक के एक किनारे जगह है, और धीरे से दूसरे किनारे नीचे लाने के लिए । एडेप्टर के सभी कोनों पर पुश करने के लिए सुनिश्चित करें ।
      2. नमूना एडेप्टर स्थिति C1 में रखें । एडेप्टर के सभी कोनों पर पुश करने के लिए सुनिश्चित करें ।
      3. भंवर 5-एमएल मास्टर मिक्स, टोपी खोलने, और यह स्थिति में एक साधन के मास्टर मिक्स और रिएजेंट ब्लॉक पर जगह है ।
      4. 96-खैर इंस्ट्रूमेंट के ढलने पर पीसीआर प्लेट लगाएं जो हाफ स्कर्ट वाली पीसीआर प्लेट्स को होल्ड करने का इरादा रखती है ।
      5. चलाएं प्रारंभ करें और एक नई फ़ाइल के रूप में सहेजें ।
      6. संकेतों का पालन करें और प्रत्येक प्रॉम्प्ट चिह्नित करें: एक, युक्तियाँ उपलब्ध हैं, दो, अपशिष्ट बॉक्स उपलब्ध है, और तीन, प्रारंभ करें.
    5. चलाने के पूर्ण होने के बाद, सत्यापित करें कि त्रुटि संदेशों के लिए मशीन की जांच द्वारा कोई त्रुटियां थीं ।
    6. 12 या 8 पट्टी टोपियां, भंवर के साथ सख्ती से प्लेट सील, और एक 96 अच्छी तरह से प्लेट स्पिनर का उपयोग कर 1 मिनट के लिए नीचे स्पिन, और यह बर्फ पर या रेफ्रिजरेटर में जगह है ।
    7. रिवर्स प्राइमरों और नमूनों युक्त ट्यूब निकालें ।
    8. पोस्ट-प्रवर्धन कक्ष के लिए 96-अच्छी तरह से थाली ले लो और थर्मल साइकिल चालक और साइकिल पर प्लेट लोड थर्मल साइकिल शर्तों की तालिका के अनुसार ( तालिका 1देखें) ।

4. लक्षित 16S पोस्ट-पीसीआर गुणवत्ता नियंत्रण जेल ट्रो के लिए टेप आधारित मंच का उपयोग

नोट: पोस्ट-पीसीआर गुणवत्ता नियंत्रण (QC) और बाद में सभी कदम बाहर प्रयोगशाला के एक नामित पद प्रवर्धन क्षेत्र में किए जाते हैं । डीएनए एक स्वचालित डीएनए में विश्लेषण किया है/

  1. कार्य क्षेत्र की तैयारी
    1. एक RNase, DNase, डीएनए decontaminant, DI पानी के बाद दो बार, और अंत में 70% इथेनॉल के साथ उपयोग में सभी सतहों छिड़काव द्वारा कार्य केंद्र साफ ।
    2. सभी की आपूर्ति और उपकरणों की जरूरत इकट्ठा ।
  2. रिएजेंट तैयार करें
    1. 30 मिनट की एक ंयूनतम के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर तापमान नियंत्रित भंवर में नमूना बफर और सीढ़ी प्लेस ।
  3. जबकि रिएजेंट वार्मिंग कर रहे हैं, एक एकल ट्यूब में प्रत्येक नमूने के लिए 3 पीसीआर प्रतिकृतियां पूलिंग द्वारा पीसीआर नमूने तैयार
  4. साधन पर लोड नमूने ।
  5. संक्षेप में भंवर और परित पीसीआर उत्पाद के साथ ट्यूबों नीचे स्पिन ।
  6. आरटी में एक रैक पर है उपकरण 96 अच्छी तरह से थाली प्लेस और यह लेबल ।
  7. संक्षेप में भंवर और नीचे नमूना बफर और सीढ़ी स्पिन ।
  8. 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से 3 µ l नमूना बफर जोड़ें (कम से 53 µ एल की जरूरत है/
  9. नमूनों की एक भी संख्या भागो; नमूने की विषम संख्या है, तो 4 µ l नमूना बफ़र के लिए एक रिक्त अच्छी तरह से जोड़ें ।
  10. एक सीढ़ी के लिए सीढ़ी के 1 µ एल जोड़ें अच्छी तरह से ।
  11. मानचित्र के बाद, अपने नामित अच्छी तरह से परित पीसीआर उत्पाद के 1 µ एल जोड़ें ।
  12. पंनी सील के साथ कवर प्लेट
  13. भंवर 1 मिनट के लिए 2,000 rpm पर है उपकरण भंवरर और अनुकूलक का उपयोग कर थाली ।
  14. नीचे स्पिन ट्यूब के नीचे नमूना स्थिति के लिए, अगर वहां बुलबुले फिर से नीचे स्पिन रहे हैं ।
  15. सॉफ्टवेयर लांच ।
  16. स्क्रीन टेप लोड और साधन में युक्तियां लोड हो रहा है ।
  17. एक 96-well एडेप्टर के साथ अंश विश्लेषक में नमूने लोड ।
  18. नियंत्रक सॉफ़्टवेयर के साथ एक रन सेट करें ।
  19. यहां तक कि गिने कुओं का चयन करना सुनिश्चित करें ।
  20. नमूना id लिखें ।
  21. जांच करें कि स्क्रीन टेप के सभी कुओं ग्रे में प्रकाश डाला है ।
  22. सुनिश्चित करें कि विश्लेषक सभी पिपेट युक्तियों को पहचानता है ।
  23. प्रारंभ का चयन करें और परिणाम (अध्ययन नाम, नमूना संख्या, और दिनांक) को सहेजने के लिए कोई फ़ाइल नाम निर्दिष्ट ।
  24. अधिक विवरण के लिए निर्माता के निर्देश को देखें ।
  25. चलाने के बाद पूरा हो गया है, टिप, स्क्रीन टेप, और ट्यूबों त्यागें ।
  26. 16S पीक एनएम (V4 के लिए 315-450 bp के बीच) के लिए डेटा का विश्लेषण करें । इस चोटी चयनित प्राइमरों के आधार पर भिंन होगा ।

5. पुस्तकालय गणना, पूलिंग, साफ-अप और QC

  1. amplicon आकार और सभी नमूनों की molarity का निर्धारण करने के बाद, पूल पुस्तकालयों के लिए अंतिम वांछित मात्रा और एनएम को प्राप्त करने के लिए pooled पुस्तकालय (नमूना गणना देखें) ।
  2. साफ-सुथरा और पीसीआर उत्पादों के लिए एक सिलिका-झिल्ली-आधारित शुद्धि किट का उपयोग कर, निर्माता के प्रोटोकॉल ( सामग्री की तालिकादेखें) के अनुसार, पूलिंग लाइब्रेरी ध्यान केंद्रित करें ।
    1. Elute के साथ डीएनए को अंतिम मात्रा में 50 µ l
  3. एक fluorometer के लिए एक डबल असहाय डीएनए उच्च संवेदनशीलता किट का उपयोग करके तुरंत साफ पुस्तकालय की एकाग्रता को मापने, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ।
    1. कमजोर बफर प्लस डाई (1:100 कमजोर पड़ने) के 198 µ l के साथ परित और साफ पुस्तकालय के 2 µ एल पतला ।
    2. fluorometric डिवाइस से मापा मूल्य रिकॉर्ड और यह कमजोर पड़ने कारक के अनुसार परिवर्तित ।
  4. एकाग्रता पढ़ने (एनजी/µ एल) का उपयोग कर परित पुस्तकालय के लिए, समुद्री मील में पुस्तकालय molarity की गणना । एक microvolume spectrophotometer पर OD260/280 को मापने के लिए 1 µ l पतला पुस्तकालय का उपयोग करें ।
    नोट: 1.8-2.0 का एक मान पुस्तकालय की पर्याप्त शुद्धता को इंगित करता है ।
  5. अगली पीढ़ी अनुक्रमण के लिए तैयार जब तक अंतिम पुस्तकालय-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।

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Representative Results

प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत महत्वपूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण (QC) कदम सुनिश्चित करने के लिए कि डेटा प्रोटोकॉल संवेदनशीलता, विशिष्टता, और संदूषण नियंत्रण के लिए मिलने के मानक उत्पंन शामिल हैं । प्रोटोकॉल का पहला QC चरण 16S V4 क्षेत्र (चित्र 2) के पीसीआर प्रवर्धन का पालन करता है । प्रत्येक नमूने से पीसीआर उत्पाद के एक µ एल ट्रो द्वारा विश्लेषण किया गया था पुष्टि करने के लिए कि यह 315-450 bp की अपेक्षित आकार सीमा के भीतर था (चित्रा 2, लाल तीर) । कुछ मानव दूध के नमूनों विशिष्ट उत्पाद (चित्रा 2aकी कम मात्रा में उत्पन्न, लेन के साथ 3 और 9-11 की तुलना 4-8), उन नमूनों में निकाले माइक्रोबियल डीएनए के निम्न स्तर का सुझाव या निष्कर्षण के दौरान पीसीआर अवरोधकों के ले. नमूने के लिए जो 315-450 bp श्रेणी में उत्पाद के 2.0 एनएम से कम उत्पादन (चित्र 2a, लेन 7), पीसीआर अवरोधक सफाई एक कदम किट का उपयोग कर बाहर किया जाता है और नमूना फिर से परिलक्षित होता है । सफाई के बाद नमूना प्रवर्धन की वसूली के लिए सफलता दर लगभग 40% है । प्रत्येक नमूने के लिए विशिष्ट उत्पाद का Quantitation (चित्र b) sequencing के लिए नमूनों की समान दाढ़ पूलिंग के लिए इसकी आवश्यक मात्रा निर्धारित करने के लिए आवश्यक है । लक्षित अनुक्रमण के लिए एक परित पुस्तकालय आमतौर पर एक विशिष्ट पीसीआर उत्पाद (चित्रा 3) का प्रभुत्व है । यदि लायब्रेरी में गैर-विशिष्ट उत्पाद की एक महत्वपूर्ण मात्रा है, तो कार्यप्रवाह में एक जेल-शुद्धिकरण चरण जोड़ा जाना चाहिए ।

चित्र 2aमें प्रस्तुत उदाहरण में, बेहोश बैंड बफ़र नियंत्रण (BC; गलियाँ 2 और 12) और पीसीआर वॉटर नेगेटिव कंट्रोल (पीसी; लेन 1) के लिए मनाया जाता है, जो संभावित पर्यावरणीय या रिएजेंट दूषण का संकेत देता है । इस तरह के बैंड असामान्य नहीं हैं और आम तौर पर पीसीआर उत्पाद की कम मात्रा (अर्थात, < 1 एनएम) का प्रतिनिधित्व करते हैं और अनुक्रमण के दौरान कुछ पढ़े हुए काउंट्स (< 1, 000) का उत्पादन करते हैं । प्रतिनिधि अनुक्रमण परिणाम (चित्रा 4) इन नमूनों वास्तव में बहुत कम अनुक्रमण पढ़ें गिनती है कि पुष्टि करें (चित्र 4a, गलियाँ 1 और 11; चित्रा 4B, बफर और पीसीआर पानी गलियों) और, महत्वपूर्ण बात, नियंत्रण के नमूनों के लिए taxa संरचना मानव दूध के नमूनों से अलग है (चित्रा 4a; लेन की तुलना 1 और 11 लेन के साथ 2-10). नकारात्मक नियंत्रण में उच्च पढ़ें गिनती, एक साथ महत्वपूर्ण नियंत्रण और नमूनों के बीच taxa रचना में ओवरलैप के साथ, पार संदूषण और बेहतर संदूषण नियंत्रण के लिए की जरूरत है पता चलता है.

अनुक्रमण परिणाम (चित्रा 4) अनुक्रमण की संख्या में मानव दूध microbiome और परिवर्तनशीलता के साथ जुड़े taxa में उच्च विविधता का प्रदर्शन प्रत्येक नमूना (चित्र 4a, गलियाँ 2-10) के लिए पढ़ें मायने रखता है. इसके विपरीत, मानव दूध के नमूनों के साथ संसाधित किया गया था कि बैक्टीरियल नकली के लिए अनुक्रमण परिणाम taxa संरचना का प्रदर्शन और पिछले कार्यप्रवाह रन में नकली के लिए प्राप्त परिणामों के तुलनीय थे कि गिनती पढ़ें (चित्र 4a की तुलना करें , चित्रा 4B, मॉक लेन के साथ लेन 12) । मॉक लेन के लिए सुसंगत परिणाम सुझाव है कि मानव दूध के नमूनों के लिए मनाया परिवर्तनशीलता एक प्रामाणिक प्रयोगात्मक परिणाम है, और नहीं आंतरिक कार्यप्रवाह परिवर्तनशीलता के एक समारोह ।

Figure 1
चित्र 1: लक्षित 16S अनुक्रमण पाइपलाइन का प्रवाह चार्ट. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2:16S V4 amplicons की गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण. (A) 16S V4 amplicons की जेल छवि एक स्वचालित डीएनए/आरएनए अंश विश्लेषक का उपयोग करके ट्रो द्वारा हल की गई । Caporaso एट अल के अनुसार 16S V4 amplicons जनरेट किए गए थे । 9, और प्रत्येक पीसीआर उत्पाद के एक µ एल निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार उच्च संवेदनशीलता डीएनए एजेंट का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था । अधिकांश मानव दूध के नमूनों (गलियाँ 3-6 और 8-11) और बैक्टीरियल नकली (लेन 13) लगभग 400 बीपी (लाल तीर) की उंमीद आकार में एक प्राथमिक पीसीआर उत्पाद का उत्पादन किया । 7 लेन में मानव दूध नमूना विशिष्ट उत्पाद का एक महत्वपूर्ण राशि का उत्पादन करने में विफल रहा है और सफाई और फिर से प्रवर्धन के अधीन था । पीसीआर नकारात्मक नियंत्रण (पीसी, लेन 1), और lysis बफर नकारात्मक नियंत्रण (ई. पू., लेन 2 और 12) के लिए न्यूनतम उत्पाद का पता लगाया गया था विश्लेषण नमूनों में मौजूद ंयूनतम संक्रमण संकेत दिया । मेगावाट, आणविक भार मार्करों: ऊपरी लाल और निचली हरी सलाखों के प्रत्येक लेन में क्रमशः 1,500 बीपी और 25 बीपी आकार मार्करों, की पहचान । (ख) (क) में जेल से 3 लेन के शीर्ष Electropherogram । प्राथमिक पीसीआर उत्पाद लाल ऊर्ध्वाधर सलाखों के द्वारा परिभाषित चोटी क्षेत्र के भीतर गिर जाता है और शामिल 299-497 बीपी से आकार में लेकर एक औसत पीसीआर उत्पाद आकार 396 bp. गेटिंग के प्रत्याशित amplicon आकार से थोड़ा व्यापक सीमा पर किया जाता है (मैं n इस मामले 315-450 bp) पूरा नमूना पीक शामिल करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए । ऊपरी और निचली चोटियों क्रमशः 25 बीपी और 1,500 बीपी के टुकड़े आकार के साथ सहसंबंधी बनाना । नीचे: शिखर क्षेत्र के लिए आकार मानकों का सारांश चार्ट, पीक क्षेत्र के भीतर पीसीआर उत्पाद के एनजी/µ एल में एकाग्रता, और विशिष्ट पीसीआर उत्पाद के लिए एनएम में molarity । यह जानकारी तो प्रत्येक नमूने की कितनी एक बराबर दाढ़ लायब्रेरी में sequencing (नमूना परिकलन देखें) के लिए pooled किया जाएगा का परिकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: Electropherogram और केंद्रित sequencing लाइब्रेरी का एक संग्रह. अनुक्रम किया जा करने के लिए व्यक्तिगत नमूनों की बराबर दाढ़ मात्रा एक परित लाइब्रेरी में संयोजित किए गए थे । इसके बाद पुस्तकालय को साफ किया गया और एक सिलिका-झिल्ली आधारित पीसीआर क्लीन अप किट का उपयोग कर 50 µ एल की कुल मात्रा तक ध्यान दिया गया । अगली पीढ़ी sequencer पर अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय के अंतिम तैयारी निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित किया गया था । अतिरिक्त बैंड की मौजूदगी के बावजूद इस लाइब्रेरी का सफलतापूर्वक अनुक्रम किया गया । यदि अपेक्षित आकार सीमा से बाहर पीसीआर उत्पादों के बारे में चिंता का विषय है, निर्माता के प्रोटोकॉल एक जेल आकार चयन कदम के अलावा पता चलता है । इस QC चरण आमतौर पर नहीं किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण का मूल्यांकन. (क) नियंत्रण और मानव दूध के नमूनों के साथ एक निष्कर्षण बैच के बैक्टीरियल taxa के सापेक्ष बहुतायत । एक QC उपाय के रूप में, स्वचालित डीएनए पर लोड के रूप में प्रत्येक निष्कर्षण बैच की रचनाओं/आरएनए शुद्धि साधन तुरंत एक sequencing चलाने के बाद उत्पन्न कर रहे हैं. प्रत्येक नमूना पट्टी के अंतर्गत संख्याएँ संबंधित नमूने के लिए फ़िल्टर की गई reads की संख्या इंगित करती हैं. बफर नियंत्रण की रचनाओं मानव दूध के नमूनों की है कि से अलग हैं । (ख) बफर, नकली, और पीसीआर नियंत्रण में बैक्टीरियल taxa के सापेक्ष बहुतायत । पढ़ता है और संरचना की संख्या सभी नकारात्मक (बफर और पीसीआर पानी) और सकारात्मक (बैक्टीरियल नकली) नियंत्रण के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं । बफर और पानी की रचनाएँ बदलती रहती हैं, लेकिन नकली समुदाय काफी स्थिर रहता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

16S rRNA के लक्षित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया, microbiome लक्षण वर्णन18के लिए तेजी से तकनीक है । हालांकि, कई कारकों, सहित बैच प्रभाव, पर्यावरण संदूषण, नमूना पार-संदूषण, संवेदनशीलता, और reproducibility प्रतिकूल प्रयोगात्मक परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं और उनकी व्याख्या को मिला7,19 , 20. सबसे मजबूत 16S विश्लेषणों को सुविधाजनक बनाने के लिए, microbiome वर्कफ़्लोज़ में अच्छी प्रायोगिक डिजाइन, उपयुक्त नियंत्रणों का उपयोग, कार्यप्रवाह चरणों के स्थानिक पृथक्करण, और सर्वोत्तम प्रथाओं के अनुप्रयोग को शामिल करना आवश्यक है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल इन मापदंडों में से प्रत्येक शामिल है और ऊपर चुनौतियों का पता और विविध नमूनों के लिए एक 16S कार्यप्रवाह को लागू करने के लिए महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक उपकरण प्रदान करता है ।

अच्छा प्रायोगिक डिजाइन 16S microbiome विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है । यह उचित संग्रह और नमूनों का भंडारण, साथ ही 16S प्राइमरों के हित के क्षेत्र के लिए उपयुक्त चयन भी शामिल है । उदाहरण के लिए, V4 क्षेत्र (515F/806R) मानव दूध के लिए चुना जाता है क्योंकि यह Bifidobacterium, जो नवजात आंत microbiome21के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है की अच्छी प्रवर्धन है । अंय सूक्ष्म समूह (जैसे, 27F/338R, 515F/926R) अंय माइक्रोबियल समुदायों के अध्ययन के लिए और अधिक उपयुक्त हो सकता है । एक महत्वपूर्ण नोट है कि लक्षित 16S पीसीआर और अपेक्षित amplicon आकार के लिए एनीलिंग तापमान प्राइमरी चयन के आधार पर भिंन हो सकते हैं ।

अंय स्थान प्रोटोकॉल संशोधित किया जा सकता है कार्य प्रवाह में शामिल QC चरणों के परिणाम के आधार पर कर रहे हैं । जब या तो कोई या थोड़ा डीएनए लक्षित 16S पीसीआर प्रवर्धन कदम के बाद पता चला है समस्या निवारण के लिए कुछ विकल्प मौजूद हैं । 1) नमूना एक पीसीआर अवरोधक हटाने कदम के माध्यम से रखा जा सकता है । पीसीआर अवरोधक को हटाने के बाद एक एकल कदम निर्माता के प्रति प्रदर्शन किट का उपयोग करते हुए प्रवर्धन सफल रहा है समय के लगभग चालीस प्रतिशत, 2) अधिक निकाली डीएनए लक्षित 16S पीसीआर, या 3 के लिए जोड़ा जा सकता है) एक नया और संभावित बड़ा दूध की aliquot यदि उपलब्ध हो तो कार्रवाई की जा सकती है. यदि लाइब्रेरी की सिलिका-झिल्ली आधारित शुद्धिकरण के बाद अपेक्षित आकार सीमा से बाहर पीसीआर उत्पादों के बारे में चिंता है, तो जेल शुद्धिकरण चरण जोड़ा जा सकता है । अंत में, QC कदम अगर वहां संदूषण, जो नीचे विस्तार से चर्चा की है सबूत है निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । यदि महत्वपूर्ण संदूषण का पता लगाया है, तो जहां संदूषण शुरू की है पर निर्भर करता है, या तो पीसीआर दोहराया जा सकता है या यदि आवश्यक हो, नमूना फिर से निकाला जा सकता है । सौभाग्य से, अच्छा प्रयोगशाला प्रथाओं के साथ, इन दुर्लभ घटनाओं रहे हैं । अंत में, जबकि इस प्रोटोकॉल के लिए कम बायोमास नमूनों और विशेष रूप से मानव दूध के प्रवर्धन में निरंतर उजागर लिखा है, प्रोटोकॉल आसानी से मौखिक, मलाशय, योनि के प्रवर्धन के लिए संशोधित किया जा सकता है, और त्वचा झाड़ू या स्पंज के रूप में अच्छी तरह से मल । यदि अंय नमूना प्रकार चुना जाता है, तो विचार जो निष्कर्षण किट विशिष्ट नमूना प्रकार के लिए इष्टतम है दिया जाता है ।

किट, रिएजेंट, या sequencing रन के कारण बैच प्रभाव microbiome अध्ययन में परिवर्तनशीलता के महत्वपूर्ण स्रोत हैं । डीएनए निष्कर्षण किट, अन्य रिएजेंट के साथ साथ, बैक्टीरियल डीएनए के निम्न स्तर के अधिकारी, जो काफी20,22,23,24तक भिन्न हो सकते हैं. एक बड़ी परियोजना के लिए, किट, रिएजेंट का एक बहुत का उपयोग, किट संदूषण को कम करने के लिए डिज़ाइन किट का चयन7विश्लेषण सरल हो सकता है । दोनों विषयों और नियंत्रणों के नमूने साथ-साथ संसाधित किए जाते हैं । यह एक एकल अध्ययन के लिए सभी नमूने, दोनों विषय और नियंत्रण, एक एकल अनुक्रमण चलाने में शामिल किया जा सकता है अगर सबसे अच्छा है । नमूनों की एक बड़ी संख्या बैचेस में संसाधित किया जा करने के लिए हैं, तो विषय और नियंत्रण दोनों के प्रतिनिधि हैं जो नमूने प्रत्येक बैच में शामिल हैं और एक साथ संसाधित है । यह भी है कि उच्च बायोमास (यानी, मल) नमूनों द्वारा कम बायोमास के नमूनों (यानी, मानव दूध) के संदूषण को कम करने के लिए बैच प्रसंस्करण का आयोजन करने के लिए महत्वपूर्ण है । ऐसे मामलों में, प्रक्रिया कम बायोमास नमूना प्रकार पहले, और फिर एक ही अध्ययन के लिए उच्च बायोमास नमूने ।

कम बायोमास नमूने microbiome अध्ययन करने के लिए अद्वितीय चुनौतियों का सामना, पर्यावरण से संदूषण के रूप में, रिएजेंट, उपकरण, और शोधकर्ता यह मुश्किल कम बहुतायत में उपस्थित प्रामाणिक समुदाय के सदस्यों के बीच अंतर करने के लिए कर सकते हैं7 , 25 , 26 और उन है कि कृत्रिम रूप से प्रायोगिक प्रक्रिया19के माध्यम से नमूने के लिए पेश कर रहे हैं । कार्यप्रवाह यहां वर्णित महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक नकारात्मक नियंत्रण दोनों नमूना तैयारी चरण (बफ़र-केवल lysis नियंत्रण), और पीसीआर चरण (पीसीआर वॉटर कंट्रोल) (देखें चित्रा 4) पर शामिल है । ये नियंत्रण दूषित स्रोतों की पहचान करने और बेंच पर या silico27,28,29,30 मेंप्रभावी सुधारात्मक उपायों को सुगम बनाने में मदद करते हैं । नकारात्मक नियंत्रण ध्यान से मूल्यांकन और अध्ययन के परिणाम7के साथ रिपोर्ट कर रहे हैं ।

संदूषण को कम करने के लिए, एक साफ पूर्व में प्रयोगात्मक गतिविधियों के स्थानिक अलगाव-पीसीआर प्रवर्धन क्षेत्र और बाद प्रवर्धन क्षेत्र महत्वपूर्ण है । बेहतर, स्वच्छ कक्ष पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयारी के लिए एक क्षेत्र है और मास्टर मिक्स क्षेत्र के एक नमूना तैयारी/इसके अलावा एक अलग मृत हवा बॉक्स या एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट आवास समर्पित उपभोग्य सामग्रियों और छोटे उपकरणों के लिए आवश्यक शामिल कर सकते है मास्टर मिक्स वडा. स्वच्छ कमरे डिजाइन उच्च दक्षता हवा (हेपा) निस्पंदन के साथ एक सकारात्मक airflow प्रणाली शामिल हैं । व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग एक नियंत्रित, कम माइक्रोबियल वातावरण को बनाए रखने के लिए आवश्यक है, और hairnets, प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, और जूता कवर शामिल है । किट/एजेंट और नमूने आदर्श रूप से अलग समर्पित रेफ्रिजरेटर में संग्रहित/ पीसीआर सेटअप भी निर्दिष्ट कार्यस्थानों में साफ कमरे में किया जाता है; प्राइमर स्टॉक और निकाले डीएनए से रिएजेंट के स्पष्ट जुदाई बनाए रखा है जब तक नमूने स्वचालित pipetting मंच पर लोड कर रहे हैं । एक बार एक पीसीआर सेटअप पूरा हो गया है, थाली के बाद प्रवर्धन क्षेत्र में स्थानांतरित कर दिया और एक थर्मल साइकिल चालक पर लोड है ।

यह महत्वपूर्ण है के लिए स्वच्छ क्षेत्रों से काम गतिविधि के प्रवाह के बाद प्रवर्धन क्षेत्रों को प्रतिबंधित; रिएजेंटों, उपकरणों, या आपूर्ति की कोई प्रतिगामी आंदोलन के बाद से प्रवर्धन क्षेत्रों स्वच्छ क्षेत्र के लिए है । कर्मियों कि पद के किसी भी प्रवर्धन क्षेत्रों में प्रवेश से 24 घंटे के लिए स्वच्छ क्षेत्र में प्रवेश वर्जित है (अगले दिन तक) । उपरोक्त कार्यप्रवाह विचार के अलावा, सफाई प्रोटोकॉल काम सतहों और इंस्ट्रूमेंटेशन के न्यूक्लिक एसिड संदूषण को कम करने के लिए दोनों साफ और बाद में प्रवर्धन क्षेत्रों में लागू किया जाना चाहिए. यदि भौतिक अवरोध या पृथक कमरे संभव नहीं हैं, तो उन क्षेत्रों में कार्य को निर्धारित करने के लिए सभी प्रयास किए जाने चाहिए जहां तक संभव हो ।

संदूषण के अलावा, microbiome अध्ययन संवेदनशीलता, परिवर्तनशीलता, और reproducibility31द्वारा चुनौती दी है । इस प्रोटोकॉल एक परिभाषित बैक्टीरियल नकली समुदाय है कि निकाले, प्रवर्धित है, और नमूनों के प्रत्येक बैच के साथ अनुक्रम ( चित्रा 4bदेखें) को शामिल करके इन मुद्दों को संबोधित करते हैं । यह नियंत्रण एक निरंतर आंतरिक संदर्भ प्रदान करता है जो reproducibility द्वारा जेनरेट किए गए प्रायोगिक परिणामों का मूल्यांकन करती है और इससे उत्पन्न समस्याओं का निवारण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, निकाले गए नकली डीएनए की गुणवत्ता प्रभावी नमूना lysis और डीएनए निष्कर्षण, जो जीनोमिक डीएनए नियंत्रण याद आती है के लिए एक मीट्रिक प्रदान कर सकते हैं । मॉक सैंपल के लिए पीसीआर amplicons की क्वालिटी कंट्रोल पीसीआर दक्षता और विशिष्टता का भी संकेत दे सकती है । इसके अलावा, क्योंकि नकली कई बैक्टीरिया प्रकार शामिल हैं, नमूनों की एक प्रक्रिया बैच के लिए सापेक्ष संवेदनशीलता नकली नमूना के लिए अनुक्रमण परिणामों में taxa के प्रतिनिधित्व के द्वारा आस्थगित किया जा सकता है । एक आदर्श नकली समुदाय के डिब्बे में प्रमुख जीवाणु प्रजातियों का पता लगाने की क्षमता का मूल्यांकन होगा विश्लेषण किया जा रहा है, और इसलिए नकली समुदाय की संरचना को अध्ययन से भिंन की आवश्यकता हो सकती है । के रूप में चित्रा 4aमें दिखाया गया है, नमूना अनुक्रमण परिणामों के बीच काफी परिवर्तनशीलता है, लेकिन बैक्टीरियल नकली समुदाय के लिए अनुक्रम परिणाम अत्यधिक reproducible है ( चित्रा 4bदेखें).

जबकि चित्रा 4 में नकली समुदाय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और स्थानीय नैदानिक अलग, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नकली समुदाय का एक संयोजन से 33 उपभेदों का एक अनूठा मिश्रण है हाल ही में32विकसित किया गया है ।

हालांकि कार्यप्रवाह यहां वर्णित अपने को मोटे तौर पर विभिंन microbiome अध्ययन भर में reproducibility पता करने की क्षमता में सीमित है, यह एक महत्वपूर्ण प्रायोगिक दृष्टिकोण है कि शोधकर्ताओं ने उचित प्रयोगात्मक शामिल करने की अनुमति देता है प्रदान करता है नियंत्रण और अपने स्वयं के परिणामों के भीतर reproducibility निगरानी ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम प्रोटोकॉल के विकास के लिए Helty Adisetiyo, पीएचडी और Shangxin यांग, पीएचडी शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । अंतर्राष्ट्रीय मातृ बाल चिकित्सा किशोर एड्स नैदानिक परीक्षण समूह (IMPAACT) के लिए कुल मिलाकर राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोगों (NIAID) के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) पुरस्कार संख्या के अंतर्गत द्वारा प्रदान किया गया था UM1AI068632 (IMPAACT एलओसी), UM1AI068616 (IMPAACT एसडीएमसी) और UM1AI106716 (IMPAACT LC), सह-वित्त पोषण के साथ Eunice कैनेडी श्राइवर राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास संस्थान (niched) और राष्ट्रीय मानसिक स्वास्थ्य संस्थान (NIMH) । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि NIH के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AllPrep RNA/DNA Mini Kit Qiagen 80204 DNA/RNA extraction kit
Eliminase Fisher Scientific 435532 RNase, DNase, DNA decontaminant
Thermo Mixer Fisher Scientific temperature-controlled vortexer
Buffer RLT plus Qiagen 1053393 guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689-25ML-F ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME Beads MP Biomedicals 116914050 bead tube
QIAgen TissueLyzer Qiagen 85300 automated sample disruptor adapter set
QIAshredder column Qiagen 79654
QIAgen RB tube manufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticware Qiagen 9001292 automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plus Applichem A7089 non-enzymatic decontamination solution
EB Buffer Qiagen 19086 elution buffer
QIAgility and related plasticware Qiagen 9001532 robotic liquid handler
PCR water MO BIO 17000-
5PRIME HotMasterMix Quantabio 2200400
Barcoded reverse primers Eurofin No Catalog #'s designed and ordered
96 well PCR plate USA scientific 1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticware Agilent G2964AA automated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation Agilent 5067-5585 Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit Zymo Research 50444470 PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32854 dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216
NanoDrop Thermo Fisher microvolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kit Illumina 15033624/15033626
MiSeq Illumina No Catalog #'s next generation sequencer

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References

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Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih, S., Lee, D. J., Li, F., Aldrovandi, G. M. A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples. J. Vis. Exp. (133), e56974, doi:10.3791/56974 (2018).

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