Summary
반자동된 워크플로 인간 우유와 다른 낮은 바이오 매스 샘플 종류에서 16S rRNA의 타겟된 시퀀싱에 대 한 제공 됩니다.
Abstract
미생물 커뮤니티 연구는 상대적으로 신속, 저렴 하 고 높은 처리량 시퀀싱의 개발을 광범위 하 게 되었다. 그러나, 이러한 모든 기술에서와 마찬가지로 재현 결과 실험실 워크플로 통합 하는 적절 한 예방 조치 및 컨트롤에 따라 다릅니다. 이것은 특히 낮은 바이오 매스 샘플 중요 어디 세균 DNA 오염 잘못 된 결과 생성할 수 있습니다. 이 문서 낮은-에 중순-throughput 규모에 16S ribosomal RNA (rRNA) V4 지역의 타겟된 시퀀싱을 사용 하 여 인간 유 방 우유 샘플에서 미생물을 식별 하는 반자동된 워크플로 자세히 설명 합니다. 프로토콜 설명 전체 우유 등에서 샘플 준비: 세포, 핵 산 추출, 증폭, 16S rRNA 유전자 및 품질 관리 조치 라이브러리 준비 V4 영역의 샘플. 프로토콜 및 토론 준비와 적절 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤, PCR 반응 억제제 제거, 샘플 오염 환경, 시 약, 포함 하는 낮은 바이오 매스 샘플의 분석을 돌출 하는 문제를 고려 하는 중요 한 것은, 또는 실험 소스, 고 재현성을 보장 하도록 설계 된 실험 모범 사례. 프로토콜을 설명 하는 대로 인간 우유 샘플, 면봉, 깔끔한, 또는 보존 버퍼에 안정 냉동에 수집 된 샘플을 포함 한 수많은 낮은 및 높은 바이오 매스 샘플 종류에 적응은.
Introduction
인간 식민지 미생물 지역 사회는 인간의 건강과 신진 대사, 면역 발달, 질병 민감성과 예방 접종과 약물 치료1, 에 대 한 응답에 영향을 미치는 질병에 매우 중요 한 것으로 2. 현재 인간의 건강에는 microbiota의 영향을 이해 하는 노력 강조 뿐만 아니라 지역화 된 사이트 정의 해부학 구획 (즉, 피부, 창 자, 구두, 등), 관련 된 미생물의 식별 이러한 구획3,4. 이러한 조사 활동을 underpinning 급속 한 출현 및 샘플의 미생물 유전 콘텐츠 (미생물)의 분석에 대 한 대규모 병렬 플랫폼을 제공 하는 차세대 시퀀싱 (NGS) 기술의 증가 접근성입니다. 많은 생리 샘플, 관련 된 미생물은 복잡 하 고 풍부한 (즉,의 자), 하지만, 일부 샘플은 미생물 어디 낮은 미생물 바이오 매스 (즉, 인간의 우유, 낮은 호흡기)로 표현 됩니다 감도, 실험적인 인공 물, 및 가능한 오염 될 주요 문제. 미생물 연구와 적절 한 실험적인 디자인의 공통 과제 여러 검토 기사5,6,,78의 대상이 되었습니다.
여기에 소개 강력한 NGS 실험 파이프라인 기반으로 rRNA 16S V4 지역9 인간 우유의 미생물 특성의 타겟된 시퀀싱 합니다. 인간 우유의 미생물 분석은 복잡 하지는 본질적으로 낮은 미생물 바이오 매스10여만 하지만 또한 높은 인간 DNA의 레벨11,12,,1314 배경 및 잠재적인 carryover PCR 억제제15,16 추출 된 핵 산의. 이 프로토콜은 상용 추출 키트와 샘플 준비 일괄 처리를 통해 변화를 최소화 하는 것을 도울 수 있는 반자동된 플랫폼에 의존 합니다. 그것은 프로토콜의 각 단계를 확인 하 고 파이프라인 견고성의 독립적인 통계를 제공 하는 품질 관리로 샘플 함께 처리 되는 잘 정의 된 세균성 모의 사회 통합. 로 프로토콜 인간의 우유 샘플에는 설명의 자, 직장, 질, 피부, 나, 그리고 구강 면봉10,17를 포함 하 여 다른 샘플 형식에 쉽게 적응할 수 이며 시작 지점으로 사용할 수 있습니다. 미생물 분석을 수행 하고자 연구원입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 프로토콜 단계에 대 한 적절 한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 해야 합니다, 그리고 엄격한 오염 예방 방법을 수행 해야 합니다. 샘플의 오염을 최소화 하기 위해 후 증폭 작업 영역에 영역을 작동 하는 사전 증폭에서 작품의 흐름을 관찰 합니다. 사용 하는 모든 공급은 살 균, RNase, DNase, DNA, pyrogen의 무료 이다. 모든 피 펫 팁 필터링 됩니다. 프로토콜 단계의 순서도 (그림 1)를 제공 됩니다.
1. 샘플 세포
참고: 샘플 세포 및 핵 산 추출 클린 룸 환경에서 DNA/RNA 추출 키트를 사용 하 여 엔지니어링 및 절차적 컨트롤 샘플에 환경 박테리아의 도입을 최소화 하에서는 수행 됩니다.
-
작업 영역 준비
- 깨끗 한 biosafety 내각 (BSC) 핵 산 오염을 제거 하기 위해 적절 한 표면 청소기 영역을 작동 합니다.
- 온도 제어 vortexer, 설정 하 고 37 ° c.에 설정
-
Guanidinium 안산 세포의 용 해 버퍼를 준비 (재료의 표 참조)
- 침전 물에 대 한 세포의 용 해 버퍼를 확인 합니다. 37 ° c.에서 온난 하 여 다시 분해 침전
- 각 샘플에 대 한 6 µ L β-mercaptoethanol (β-ME)와 세포의 용 해 버퍼의 600 µ L를 준비 합니다. 샘플 당 추가 20% 볼륨을 고려 하십시오.
-
샘플 준비
- 전체 우유, 냉동 얼음에 녹여. Aliquot 5 mL 전체 15 mL 또는 BSC에 5 mL 무 균 튜브에 우유 하 고 얼음에 그것을 유지.
- 작은 셀을 4 ° C에서 5000 x g에서 10 분 동안 aliquot 5 mL 우유를 회전 합니다.
- 지방 층을 제거, 튜브, 플라스틱 주걱 또는 큰에 상위 계층 피 펫 팁을 지루하게 하는 지금.
- 방해 없이 펠 릿, 100 µ L 제외한 모든 상쾌한을 제거 합니다.
- 워시 1 mL의 멸 균 인산 염에 resuspending에 의해 펠 릿 버퍼링 식 염 수 (PBS).
- 5 mL 튜브를 무 균 PBS의 1 mL을 추가 하 여 1 부정적인 제어를 준비 합니다.
- 원심 분리기 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 정지를 전송 하 고 1 분 (실 온 (RT)에서 5000 x g)에 대 한 microcentrifuge에 스핀.
- 1000 µ L 살 균 필터링 된 피 펫 팁을 사용 하 여 전체 상쾌한/지방산 레이어 삭제.
- 같은 날, 스냅인를 추출 하지 고정 셀 에탄올/드라이 아이스 슬러리에 넣어 작은 하 고 즉시-80 ° C 냉동 고로 전송.
-
샘플 중단 및 균질 (구슬-구타)
- Β-ME는 펠 릿을 포함 하는 세포의 용 해 버퍼의 600 µ L을 추가 하 고 비드 튜브에 정지를 전송.
- 12의 각 추출 배치 10 샘플, 1 부정적인 제어 (위의 단계 3.7에서에서 준비), 그리고 1 긍정적인 제어 (다음 단계에서 준비)에 포함 되어 있습니다.
- 세포의 용 해 버퍼와 20 µ L 세균성 모의 샘플 (사용 모의 공동체는, 한 번 추출의 농도 DNA의 약 0.2 ng / µ L)의 1 긍정적인 제어를 준비 합니다.
- 와 동 모든 15에 대 한 적극적으로 튜브 비드 s.
- 700-800 rpm에서 떨고와 10 분 동안 37 ° C에서 온도 제어 vortexer에 열 샘플.
- 자동화 샘플 방해 어댑터 집합으로 튜브를 로드 합니다.
- 구슬 30 Hz에서 1 분이 겼 다.
- 어댑터 세트를 분해 하 고 악기의 오른쪽 로봇 팔을 왼쪽된 로봇 팔에서 샘플 접시 세트 어댑터를 수동으로 전환.
- 구슬 30 Hz에서 다른 1 분이 겼 다.
- 25 ° c.에 3 분 동안 17200 x g에서 원심 분리기 튜브
- 200 µ L 피 펫, 샘플 또는 상단에 지방 층의 샘플의 하단에 잔여 고 균질 화기 열에 적용 하지 않도록 주의 되 고와 함께 상쾌한의 모든을 제거 합니다.
- 최대 속도, 25 ° c.에 3 분 동안 17200 x g에서 원심 분리기 균질 화기 열
- (다른 튜브를 사용 하지 마십시오) DNA와 RNA의 정화에 대 한 자동화 된 악기와 함께 사용 하기 위해 2 mL 제조업체의 microcentrifuge 튜브에 eluate의 350 µ L를 전송. 조심 하지 어떤 잔여 지방 층을 전송 합니다.
- 흐름을 통해 볼륨 보다 350 µ L 이면 350 µ L의 최종 볼륨을 β-ME와 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다.
- 샘플 실시간 진행 하기 전에 최대 2 h에 대 한 자동화 된 DNA 정화 악기를 사용 하 여 핵 산 격리를 두거나-80 ° c.에 고정
-
작업 영역을 청소
- 깨끗 한 모든 표면에 비-효소 오염 제거 솔루션을 사용, 10 분 동안 다음 70% 에탄올 스프레이 두고 닦아 표면.
2. DNA/RNA 분리
-
작업 영역 준비
- 열 블록 설정 하 고 설정 온도 70 ° c
- 온도 제어 vortexer 설정 하 고 설정 온도 37 ° c
- 워밍업-10 mM Tris-Cl, pH 8.5, 70 ° c 50 mL 튜브에 들어 있는 차입 버퍼 (EB)
- 워밍업-350 µ L까지 완전히 37 ° C에서 2 mL 튜브에 냉동된 샘플 lysates의 어떤 침전 (약 10 분) 없이 해 동.
-
DNA 정화
- 소용돌이 원심 분리기 2 mL 튜브 샘플 짧게 (3000 x g 10 s).
- 다음 자동된 DNA/RNA 정화 악기의 로드 차트 제조 업체의 지시 당 셰이 커에 2 mL 튜브를 삽입 합니다.
- 로 터 어댑터를 얻을 하 고 샘플의 수에 따라 용지함에 그들을 설정 합니다.
- 각로 터 어댑터 샘플의 식별 (ID)에 따라 분류.
- 뚜껑을 잘라내어 DNA와 RNA에 대 한 개별 스핀 열 가장자리를 매끄럽게.
- 로 터 어댑터에 컬렉션 튜브 없이 DNA 스핀 열을 삽입 합니다. 컬렉션 튜브를 삭제 합니다.
- 라벨 1.5 mL 컬렉션 튜브, 고로 터 어댑터에 삽입 합니다.
- 다음 자동된 DNA/RNA 정화 악기의 로드 차트 원심 분리기에로 터 어댑터를 설정 합니다.
- 제조업체의 1000 µ L 필터-팁 팁 랙에 삽입 합니다.
- (특정 컴퓨터 프로토콜 명령) 당 샘플 수에 따라 2 mL 제조업체의 microcentrifuge 튜브에 RNase 무료 물을 추가 합니다.
- Microcentrifuge 튜브 슬롯의 튜브 슬롯 "A"에 튜브를 삽입 합니다.
- 시 약 병에 10 mL의 최소 볼륨으로 채우기 남은 모든 시 약을 삭제 합니다.
- 시 약 병 랙 (EB 병)을 제외 하 고 시 약 병을 삽입 합니다.
- 시 약 병 위치 6에 50 mL 튜브에서 따뜻한 EB를 추가 합니다.
- 1.5 mL 튜브로 터 어댑터에 단단히 배치 됩니다 확인 하십시오.
- 악기의 뚜껑을 닫고 선택: "RNA" → "추출 키트" → "동물, 조직 및 세포" → "키트의 이름 350 µ L 부분 A 사용자 정의 DNA" → 편집 차입 볼륨 100 µ L (기본값) 또는 낮은 바이오 매스 샘플 → 50 µ L을 "시작."
- 완료 되 면 회전자는 원심 분리기에서 어댑터를 제거 하 고 용지함에 넣어.
- 로 터 어댑터 위치 3에서에서 DNA 스핀 열을 삭제 합니다.
- 로 터 어댑터 삭제 하지 마십시오, RNA는 위치 2에.
- 3의 위치에 eluted DNA를 포함 하는 1.5 mL 컬렉션 튜브를 제거 하 고 −20 ° C에 저장
- 모든 샘플은 남아, 그렇지 않으면 삭제 하는 경우 뿌리와 −20 ° C가 게에서 포함 하는 샘플 튜브를 수집 합니다.
- "키트의 이름 350 µ L 부분 B RNA" 추가 RNA의 정화에 대 한 프로토콜을 계속.
- RNA 정화는 약 350 µ L 자형 회전자 어댑터의 중간 위치에에서 수행 됩니다.
-
RNA 정화
- 로 터 어댑터에 컬렉션 튜브와 뚜껑 없이 RNA 스핀 열을 삽입 합니다.
- 새로운 1.5 mL 컬렉션 튜브 라벨을 설명서에 표시 된 대로 터 어댑터에 그들을 삽입 합니다.
- 다음 자동된 DNA/RNA 정화 악기의 로드 차트 원심 분리기에로 터 어댑터를 설정 합니다.
- 악기의 뚜껑을 닫고 선택: "RNA" → "제조업체의 키트" → "동물, 조직 및 세포" → "표준 부품 B RNA" → "시작."
- 완료 되 면, 회전자는 원심 분리기에서 어댑터를 제거 하 고 용지함에 넣어.
- 위치 3에서에서 RNA 스핀 열을 삭제 합니다.
- 위치 3에서 30 µ L eluted RNA를 포함 하는 1.5 mL 컬렉션 튜브를 제거 하 고 −80 ° C에 저장
- 시 약 병을 제거 합니다.
- 유해 폐기물을 적절 한 채널을 통해 회전자 어댑터 내용을 삭제 합니다.
-
깨끗 한 작업 역
- 모든 자동화 된 DNA/RNA 정화 악기의 액세서리, 시 약 선반, 쟁반, 및 다른 표면에 같은 비-효소 오염 제거 솔루션을 사용, 10 분 동안 두고 린스 스프레이 (디) 저온 다음 그들이 말리 면.
- 스프레이 자동된 악기 제조업체에 비-효소 오염 솔루션 승인, 사용 중인 모든 표면 함께 원심 분리기의 내부를 닦아, 10 분, 두고 70% 에탄올으로 닦아. 그들은 악기를 손상 시킬 수 있습니다 오염 솔루션의 다른 종류를 사용 하지 마십시오.
3. 타겟된 16S PCR 설치
참고: 16 PCR에 대 한 설정 클린 룸 내에 있는 지정 된 사전 증폭 작업 영역에서 수행 됩니다. 시 약 및 샘플은 준비 하 고 3 (30 샘플, 3 중, 96의 총에 진정한 샘플 및 추출 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 플러스 2 PCR 물 컨트롤을 포함 하는 중에 각 샘플에 대 한 PCR을 수행 하는 액체 처리기에 로드 결합 된 샘플 및 컨트롤)입니다. PCR 반응 조립 및 봉인, 일단 샘플 접시 사이클링 후 증폭 지역에 위치한 열 cycler에 전송 됩니다.
-
작업 영역 준비
- PCR 워크스테이션을 청소. 스프레이 RNase, DNase, DNA와 함께 사용에서 모든 표면 decontaminant, 뒤 디 물에 두 번, 그리고 마지막으로 70% 에탄올.
- 16S PCR 워크시트 준비 (타겟 16S PCR 워크시트 참조) 정확한 샘플 목록 및 각 샘플9할당 다른 바코드 뇌관. 인쇄 워크시트 및 플레이트 지도 (접시 1 참조).
-
PCR 마스터 믹스 준비
참고: 16 뇌관 선택 특정 연구에 대 한 관심 영역에 따라 그리고 연구 또는 샘플 형식에 의해 변경 될 수 있습니다. 따라서, 주문 하기 전에 프라이 머, 그것은 특정 연구에 대 한 관심의 미생물을 증폭 하는 최고의 16S rRNA의 어떤 영역을 확인 하는 것이 중요. 로 작성 된이 프로토콜 16 V4 영역의 확대입니다. 다른 프라이 머/지역을 선택한 경우 열 사이클링에 어 닐 링 온도 조정을 해야 합니다.- 모든 것을 준비 하는 PCR 워크스테이션에서 작동 합니다.
- -20 ° C에서 DNA 샘플의 50-100 µ L 및 필요한 모든 시 약을 꺼내와 얼음에 녹여. 소용돌이 짧게 스핀 다운.
- 뇌관은 미리 20 µ L의 최소 볼륨에서 5 µ M의 작업 농도에 희석 됩니다.
- 워크시트에서 계산에 따르면 앞으로 뇌관만 특정 5 mL 튜브에 PCR 마스터 믹스를 준비 합니다.
-
로봇을 이용한 액체 처리기 자동화 된 PCR 설치 준비
- 샘플에 대 한 32-그럼 악기의 샘플 어댑터를 꺼내 하 고 제조업체의 지침에 따라 96 잘 접시 지도 따라 DNA 샘플의 50-100 µ L를 로드 합니다.
- 각 PCR 접시, 깨끗 한 샘플 튜브에 물이 PCR의 30 µ L를 배치 하 여 2 부정적인 컨트롤을 설정 합니다.
- 모든 샘플 32 잘 악기의 샘플 어댑터에 뚜껑 열린 위치에서 잠금 넣습니다.
- 반전 뇌관9
- 특정 바코드와 각 역 뇌관의 모자를 제거 # ' 1 번 (교차 오염을 방지 하는 사이 변화 장갑)에.
- 악기의 시 약 어댑터에 최대 32 뇌관을 놓습니다.
- 96-잘 PCR 접시 밖으로가 고 연구 이름, 시료 번호, 날짜, 및 기술자의 이니셜 라벨.
- 로봇을 이용한 액체 처리기 로드
- 위치 지 하 1 층에에서 시 어댑터를 넣습니다. 가장자리 효과 방지 하기 위해 신중 하 게 그립 쪽에 대 한 어댑터의 한쪽 가장자리 놓고 천천히 다른 가장자리를 내리게 합니다. 어댑터의 모든 모서리를 눌러 있는지 확인 하십시오.
- 위치 c 1에서 샘플 어댑터를 놓습니다. 어댑터의 모든 모서리를 눌러 있는지 확인 하십시오.
- 소용돌이 5 mL 마스터 믹스, 뚜껑을 열고 하 고 악기의 마스터 믹스 및 시 약 블록에 위치 A에 그것을 배치.
- 반 치마를 입은 PCR 접시를 위한 96-잘 악기의 어댑터에 PCR 접시를 놓습니다.
- 실행을 시작 하 고 새 파일로 저장 합니다.
- 나타나는 메시지에 따라 그리고 각 프롬프트를 표시 하는 확인: 1, 팁을 사용할 수 있습니다, 2, 폐기물 상자는 사용할 수, 그리고 3, 시작.
- 실행 완료 되 면 확인 오류 메시지에 대 한 컴퓨터를 검사 하 여 오류가 있었습니다.
- 적극적으로, 12 또는 8 스트립 모자, 소용돌이와 접시를 봉인 하 고 96 잘 접시 회전자를 사용 하 여 1 분 동안 스핀 다운 얼음 이나 냉장고에 그것을 배치.
- 반전 뇌관 및 샘플 튜브를 제거 합니다.
- 후 증폭 방에 96 잘 접시를 받아 고 열 순환 조건 ( 표 1참조)의 표에 따라 주기 고 열 cycler에 접시를 로드 합니다.
- 샘플에 대 한 32-그럼 악기의 샘플 어댑터를 꺼내 하 고 제조업체의 지침에 따라 96 잘 접시 지도 따라 DNA 샘플의 50-100 µ L를 로드 합니다.
4. 타겟된 16S 포스트 PCR 품질 관리 젤 전기 이동 법을 위한 테이프 기반 플랫폼을 사용 하 여
참고: 포스트 PCR 품질 관리 (QC) 및 모든 후속 단계는 실시 실험실의 지정 된 후 증폭 지역에서. DNA는 자동화 된 DNA/RNA 조각 분석기에서 분석 된다.
-
작업 영역 준비
- 살포 사용 RNase, DNase, DNA에에서 모든 표면 decontaminant, 뒤 디 물에 두 번, 그리고 마지막으로 70% 에탄올으로 워크스테이션을 청소.
- 모든 공급 및 필요한 장비를 수집 합니다.
-
시 약 준비
- 최소 30 분의 25 ° C에서 온도 제어 vortexer에서 샘플 버퍼와 사다리를 배치 합니다.
- 시 약은 워밍업 하는 동안 단일 관으로 각 샘플에 대 한 3 PCR 복제를 풀링 하 여 PCR 샘플 준비
- 악기에는 샘플을 로드 합니다.
- 짧게 소용돌이 고 풀링된 PCR 제품 튜브 아래로 회전.
- RT에서 선반에 악기의 96 잘 접시를 놓고 그것을 분류 합니다.
- 짧게 소용돌이 스핀 다운 샘플 버퍼 및 사다리.
- 96 잘 접시 (필요 이상 53 µ L/화면 테이프)의 각 음에 3 µ L 견본 버퍼를 추가 합니다.
- 샘플;는 짝수 실행 샘플 수가 홀수인 경우는 빈 우물에 샘플 버퍼의 4 µ L를 추가 합니다.
- 사다리를 사다리의 1 µ L를 잘 추가 합니다.
- 그것의 지정 풀링된 PCR 제품의 1 µ L를 추가 하는 다음 지도, 잘.
- 커버 호 일 씰 플레이트
- 소용돌이 1 분 2000 rpm에서 악기의 vortexer와 어댑터를 사용 하는 접시.
- 다시 경우 튜브의 하단에 샘플 아래로 회전 급강하 거품 위치까지 회전 합니다.
- 소프트웨어를 시작 합니다.
- 에 스크린 테이프와 로드 팁을 로드 합니다.
- 96-잘 어댑터와 조각 분석기에 샘플을 로드 합니다.
- 컨트롤러 소프트웨어와 함께 실행을 설정 합니다.
- 심지어 번호 우물을 선택 되었는지 확인 합니다.
- 샘플 Id를 작성 합니다.
- 확인 화면 테이프의 모든 우물 회색으로 강조 표시 됩니다.
- 분석기는 모든 피 펫 팁을 인식 하는지 확인 합니다.
- 시작을 선택 하 고 (샘플 번호, 이름과 날짜 연구) 결과를 저장할 파일 이름을 지정 합니다.
- 자세한 내용은 제조업체의 설명서를 참조 하십시오.
- 실행 완료 되 면, 팁, 화면 테이프, 및 튜브를 삭제 합니다.
- 16S 피크 nM (v4 315-450 bp) 사이 대 한 데이터를 분석 합니다. 이 피크는 뇌관 선택에 따라 달라 집니다.
5. 라이브러리 계산, 풀링, 정리 및 품질 관리
- 결정 후 amplicon 크기와 모든 샘플의 몰, 수영장 최종 원하는 볼륨 및 nM 풀링된 라이브러리 라이브러리 (샘플 계산 참조).
- 정리 및 집중 실리 카 멤브레인 기반 정화를 사용 하 여 풀링된 라이브러리 PCR 제품, 제조 업체의에 따르면 키트 ( 재료의 표참조) 프로토콜 합니다.
- 50 µ L의 최종 볼륨 DNA elute
- Double을 사용 하 여 즉시 청소 라이브러리의 농도 측정 제조 업체의 프로토콜에 따라 DNA 높은 감도 fluorometer 킷 좌초.
- 198 µ L 희석 버퍼 플러스 염료 (1: 100 희석)의 함께 풀링된 및 청소 라이브러리의 2 µ L를 희석.
- Fluorometric 장치에서 측정 된 값을 기록 하 고 희석 비율에 따라 변환.
- 농도 (ng / µ L) 풀링된 라이브러리에 대 한 읽기를 사용 하 여 라이브러리 몰 nM에서 계산 합니다. 1 µ L undiluted 라이브러리를 사용 하 여 측정 하는 microvolume 분 광 광도 계에 OD260/280.
참고: 값이 1.8-2.0 라이브러리의 적절 한 순도 나타냅니다. - 다음 세대 시퀀싱에 대 한 준비까지-20 ° C에서 최종 라이브러리를 저장 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
여기에 제시 된 프로토콜 데이터 생성 충족 프로토콜 감도, 특이성, 및 오염 제어에 대 한 벤치 마크 되도록 중요 한 품질 관리 (QC) 조치를 포함 합니다. 프로토콜의 QC 첫걸음 16 v 4 지역 (그림 2)의 PCR 증폭을 다음과 같습니다. 각 샘플에서 PCR 제품의 1 개의 µ L 315-450 bp (그림 2, 빨간 화살표)의 예상된 크기 범위 내에서 그것은 확인을 위해 전기 이동 법으로 분석 했다. 인간의 우유 샘플 특정 제품의 낮은 금액을 생성 (그림 2A, 3, 9-11 레인 비교 레인 4-8), 추출 하는 동안 그 샘플, 또는 PCR 억제제의 이성 미생물 DNA를 추출 하는 중 저급의 제안. 2.0 보다는 더 적은 생성 하는 샘플에 대 한 PCR 억제제 정리 315-450 혈압 범위 (그림 2A, 7 레인), 제품의 nM는 수행-단일 단계 키트를 사용 하 여 및 샘플은 다시 증폭. 샘플 증폭 후 정리는 약 40%의 복구에 대 한 성공 요금. 각 샘플 (그림 2B)에 대 한 특정 제품의 정량 시퀀싱에 대 한 샘플의 풀링 같은 어 금 니에 대 한 필요한 볼륨을 결정 하기 위한 필수적입니다. 타겟 시퀀싱 풀링된 라이브러리는 일반적으로 특정 PCR 제품 (그림 3)에 의해 지배 됩니다. 상당한 양의 일반적인 제품 라이브러리에 있는 경우에, 젤 정화 단계를 워크플로에 추가 되어야 합니다.
그림 2A에 표시 하는 예제에서는 희미 한 밴드 버퍼 컨트롤에 대 한 관찰 된다 (BC; 레인 2와 12) 및 부정적인 제어 (PC, 레인 1), 물이 PCR 나타내는 가능한 환경 또는 시 약의 오염. 이러한 밴드 흔히 되지 않습니다 및 일반적으로 PCR 제품의 낮은 금액을 나타냅니다 (즉, < 1 nM) 시퀀싱 하는 동안 몇 가지 읽기 수를 생성 하 고 (< 1000). 이러한 샘플 카운트 (그림 4A, 1, 11; 차선을 읽고 매우 낮은 시퀀싱 할 실제로 대표 시퀀싱 결과 (그림 4) 확인 그림 4B, 버퍼 및 PCR 물 차선) 이며, 중요 한 것은, taxa 구성 컨트롤 샘플에 대 한 인간의 우유 샘플 다릅니다 (그림 4A; 비교 레인 1과 11 레인 2-10). 컨트롤 및 샘플, 사이 taxa 구성에 상당한 겹치는 함께 부정적인 컨트롤에서 높은 읽기 건의 교차 오염을 향상 된 오염 통제를 위한 필요를 건의 한다.
시퀀싱 결과 (그림 4)는 인간 우유 미생물과 관련 된 taxa에 있는 높은 다양성을 설명 하 고 시퀀싱의 수에서 변화 각 샘플 (그림 4A, 차선 2-10)에 대 한 수 읽기. 반면, 인간의 우유 샘플 함께 처리 된 모의 세균에 대 한 시퀀싱 결과 taxa 구성 시연 및 이전 워크플로 실행 (비교 그림 4A에서에서 모의 대 한 얻은 결과를 비교 했다 수 읽기 , 그림 4B, 모의 레인과 12 레인). 모의 레인에 대 한 일관 된 결과 인간 우유 샘플에 대 한 관찰 된 변화 이며 본격적인 실험 결과 기본 워크플로 가변성의 작동 하지 것이 좋습니다.
그림 1: 타겟 16S 시퀀싱 파이프라인의 플로우 차트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 품질 관리 분석 16S V4 amplicons. (A) 16S V4 amplicons의 젤 이미지 자동된 DNA/RNA 조각 분석기를 사용 하 여 전기 이동 법으로 해결. 16S V4 amplicons Caporaso 그 외 여러분 에 따르면 생성 된 9, 그리고 각 PCR 제품의 1 개의 µ L 높은 감도 DNA 시 약 제조업체의 지침에 따라 사용 하 여 분석 했다. 가장 인간의 우유 샘플 (레인 3-6, 8-11) 및 세균성 모의 (레인 13) 약 400의 예상된 크기에 기본 PCR 제품 생산 bp (빨간색 화살표). 인간의 우유 샘플 레인 7에 특정 제품의 상당한 금액을 생산 실패 하 고 정리 및 다시 증폭 했다. 최소한의 제품 (PC, 레인 1) PCR 부정적인 제어에 대 한 검색 되었습니다 그리고 세포의 용 해 버퍼 부정적인 컨트롤 (BC, 차선 2와 12) 최소한의 오염 분석된 샘플에 표시 된. MW, 분자량 마커: 위 빨간색과 낮은 녹색 막대가 식별은 1500 bp 및 25 bp 크기 마커, 각 차선에 각각. (B) (A)에서 젤에서 3 레인의 상단 Electropherogram. 기본 PCR 제품 빨간색 수직 막대에 의해 정의 된 피크 지역 내 고 조각 299-497 혈압 평균 PCR 제품 크기 396의 결과에서 크기에 이르기까지 구성 bp. Gating (i 예상된 amplicon 크기 보다 약간 더 넓은 범위에 이루어집니다 n이 경우 315-450 bp) 전체 샘플 피크 포함 해야. 위와 더 낮은 봉우리 25의 조각 크기와 상관 bp와 1500 bp, 각각. 하단: 피크 지역, 지역 내에서 피크, PCR 제품의 ng / µ L에서 농도 특정 PCR 제품에 대 한 nM에서 몰에 대 한 크기 매개 변수를 요약 하는 차트. 이 정보는 다음 얼마나 많은 계산 하는 데 사용 됩니다 각 샘플의 시퀀싱에 대 한 동등한 어 금 니 라이브러리에 풀링된 것입니다 (참조 샘플 계산). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 풀링된 및 집중 시퀀싱 라이브러리의 Electropherogram. 시퀀싱 할 개별 샘플의 동일 어 금 니 금액 풀링된 도서관으로 결합 했다. 라이브러리는 다음 청소 하 고 키트 청소 실리 카 멤브레인 기반 PCR를 사용 하 여 50 µ L의 총 볼륨에 집중. 다음 세대 시퀀서에 시퀀싱을 위한 도서관의 최종 준비 제조 업체의 프로토콜에 따라 실시 됐다. 이 라이브러리는 성공적으로 추가 밴드의 존재에도 불구 하 고 시퀀싱 됩니다. PCR 제품 예상된 크기 범위에 대 한 우려가 있는 경우에, 제조 업체의 프로토콜 제안 젤 크기 선택 단계를 추가 합니다. 이 품질 관리 단계는 일반적으로 수행 되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 부정과 긍정적인 컨트롤의 평가. (A) 컨트롤 및 인간의 우유 샘플 추출 배치의 세균성 taxa의 상대 나타났는데. 품질 측정으로 각 추출 일괄 자동된 DNA/RNA 정화 악기에 로드의 시퀀싱 실행 직후 생성 됩니다. 각 샘플 바 아래 숫자는 해당 샘플에 대 한 필터링 된 읽기 수를 나타냅니다. 버퍼 컨트롤의 작곡은 인간의 우유 샘플의 다릅니다. (B) 버퍼, 모의 그리고 PCR 컨트롤에 세균성 taxa의 상대 나타났는데. 수 읽기와 구성의 모든 부정적인 (버퍼와 PCR 물)와 긍정적인 (모의 박테리아) 컨트롤에 대 한 평가 됩니다. 버퍼의 물 작곡 다르지만 모의 커뮤니티 매우 안정적으로 유지 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
16S rRNA의 타겟된 다음-세대 시퀀싱 미생물 특성화18에 대 한 널리 사용 되 고, 급속 한 기술입니다. 그러나, 일괄 처리 효과, 환경 오염, 샘플 교차 오염을, 감도, 재현성 등 많은 요인 수 부정적인 실험 결과 영향을 하 고 그들의 해석7,19 혼동 , 20. 가장 강력한 16S 분석을 용이 하 게에 미생물 워크플로 좋은 실험 디자인, 적절 한 컨트롤의 사용, 워크플로 단계의 공간 분리 및 최상의 방법의 응용 프로그램을 통합 해야 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 이러한 매개 변수 각각의 통합 하 고 위의 문제를 해결 하 고 다양 한 샘플에 대 한 16 워크플로 구현 하는 중요 한 실험 도구를 제공 합니다.
좋은 실험 디자인은 16S 미생물 분석을 위한 중요 합니다. 이 적절 한 컬렉션 샘플의 스토리지와 관심 영역에 대 한 적절 한 16S 뇌관의 선택을 포함 됩니다. 예를 들어 v 4 지역 (515F/806R) 좋은 증폭 Bifidobacterium, 신생아 본질적인 미생물21의 개발에 중요 한 역할을 있기 때문에 인간의 우유 선택 됩니다. 다른 뇌관 세트 (예를 들어, 27F/338R, 515F/926R)는 다른 미생물 커뮤니티의 연구에 대 한 더 적절 한 수 있습니다. 중요 한 노트는는 대상된 16 기에 대 한 온도 어 닐 링 PCR 및 예상된 amplicon 크기 뇌관의 선택에 따라 달라질 수 있습니다.
다른 장소를 프로토콜을 수정할 수 있습니다 작업 흐름에 통합 품질 관리 단계의 결과 기반으로 합니다. 몇 가지 옵션 중 "없음" 또는 "작은 DNA 대상된 16S PCR 증폭 단계에 따라 발견 되 면 문제 해결을 위해 존재 한다. PCR 반응 억제제 제거 단계 1) 샘플을 넣어 수 있습니다. 제조 업체의 프로토콜 당 단일 단계 키트를 사용 하 여 다음 PCR 억제제 제거 수행 증폭은 약 40 %의 시간, 2 성공적인) 더 추출 DNA에 추가할 수 있습니다 대상된 16 PCR, 또는 3) 새 및 잠재적으로 더 큰 사용 가능한 경우에 우유의 약 수를 처리할 수 있습니다. PCR 제품 라이브러리의 실리 카 멤브레인 기반 정화 다음 예상된 크기 범위에 대 한 우려가 있는 경우에, 젤 정화 단계를 추가할 수 있습니다. 마지막으로, 품질 관리 단계는 아래에 자세히 설명 되어 오염의 증거 인지 확인 하려면 중요 합니다. 중요 한 오염 감지 되 면 다음 오염 도입에 따라 어느 PCR 반복 될 수 있다 또는 필요한 경우 샘플 다시 추출 하실 수 있습니다. 다행히도, 좋은 연구실 관행, 이들은 드문 이벤트입니다. 마지막으로,이 프로토콜을 낮은 바이오 매스 샘플 및 특히 인간 우유의 증폭에 주의 강조 하기 위해 작성 하는 동안 프로토콜 쉽게 수정할 수 있습니다의 자 뿐만 아니라 구두, 직장, 질, 그리고 피부 면봉 또는 스폰지의 증폭에 대 한. 다른 샘플 형식을 선택 하는 경우 다음 고려 된 추출 장비는 특정 샘플 유형에 대 한 최적의 주어 집니다.
키트, 시 약, 또는 시퀀싱 실행 일괄 처리 효과 미생물 연구에 있는 가변성의 중요 한 소스입니다. DNA 추출 키트, 다른 약 함께 많은20,22,,2324로 실질적으로 다를 수 있습니다 세균 DNA의 낮은 수준을 있습니다. 단일 많이 키트, 시 약를 사용 하 여 대형 프로젝트에 대 한 분석7단순화 수 있습니다 선택 키트 키트 오염을 최소화 하도록 설계 되었습니다. 과목과 컨트롤의 샘플은 병행 하 여 처리 됩니다. 그것은 최고의 단일 연구를 위해 모든 샘플 모두 적용 하는 경우 및 제어, 단일 시퀀싱 실행으로 통합 될 수 있다. 많은 수의 샘플 하는 경우 일괄에서 처리, 과목과 컨트롤의 대표 샘플은 각 일괄 처리에 포함 하 고 함께 처리. 그것은 또한 높은 바이오 매스 (즉, 대변)을 샘플에 의해 낮은 바이오 매스 샘플 (즉, 인간의 우유)의 오염을 최소화 하기 위해 일괄 처리를 구성 하는 것이 중요. 이러한 경우, 동일한 연구에 대 한 낮은 바이오 매스 샘플 종류 첫 번째, 그리고 다음 높은 바이오 매스 샘플을 처리 합니다.
낮은 바이오 매스 샘플 오염 환경, 시 약, 기기, 미생물 연구, 독특한 도전 포즈와 연구원 하기 어려울 수 있습니다 그것은 낮은 풍부7 에 본격적인 커뮤니티 회원 구분 , 25 , 26 그리고 그는 인위적으로 실험 과정19통해 샘플 소개. 여기에 설명 된 워크플로 통합 샘플 준비 단계 (버퍼 전용 세포 제어), 그리고 PCR 단계 (PCR 물 제어)에서 중요 한 실험적인 부정적인 컨트롤 (참조 그림 4). 이러한 컨트롤 오염 소스를 식별 하 고 벤치 또는 철에27,,2829,30에 효과적인 시정 조치를 촉진 하는 데 도움이. 네거티브 컨트롤은 신중 하 게 평가 하 고 연구 결과7보고.
오염 최소화, 깨끗 한 이전 PCR 증폭 영역과 후 증폭 영역으로 실험 활동의 공간 분리가 중요 합니다. PCR 마스터 믹스 준비와 마스터의 샘플 준비/추가 혼합 지역, 별도 죽은 공기 상자 또는 주택 전용된 소모품 생물 안전 캐비닛을 통합할 수 있습니다 그리고 작은 장비에 필요한 최적의 클린 룸 모두 면적을가지고 마스터 믹스 준비입니다. 클린 룸 디자인 고효율 미 립 자 공기 (HEPA) 필터와 긍정적인 공기 흐름 시스템을 통합합니다. 개인 보호 장비의 사용 제어, 낮은 미생물 환경을 유지 하 게 근본적 이다 하 고 포함 하는 hairnets, 실험실 코트, 장갑, 신발 커버. 장비/시 약 및 샘플 이상적으로 별도 전용된 냉장고/냉동 고에 저장 됩니다. 또한 지정 된 워크스테이션; 클린 룸에서 실시는 PCR 설치 추출 된 DNA에서 뇌관 주식 및 시 약의 명확한 분리 샘플 자동된 pipetting 플랫폼에 로드 될 때까지 유지 됩니다. PCR 설치 완료 되 면, 접시 후 증폭 영역 전송 이며 열 cycler에 로드 합니다.
후 증폭 영역; 깨끗 한 지역에서 작품 활동의 흐름을 제한 하는 것이 중요 하다 시 약, 장비, 또는 공급 후 증폭 영역에서 깨끗 한 영역을의 역행 운동이입니다. 후 증폭 영역 중 하나를 입력 한 직원 (다음 날)까지 24 시간 동안 깨끗 한 지역 항목에서 금지 됩니다. 위의 워크플로 고려 사항, 뿐만 아니라 프로토콜 청소는 작업 표면 및 계측의 핵 산 오염을 최소화 하기 위해 깨끗 한 및 후 증폭 영역에서 구현 되어야 합니다. 물리적 장벽 또는 별도 룸은 불가능, 모든 노력으로 멀리 떨어져 가능한 분야에서 일을 설정로 이동 해야 합니다.
오염, 뿐만 아니라 미생물 연구는 감도, 가변성, 및 재현성31에 의해 도전을 했습니다. 이 프로토콜 주소 추출 되는 정의 된 세균성 모의 지역 사회를 통합 하 여 이러한 문제 증폭, 그리고 함께 샘플 ( 그림 4b참조)의 각 일괄 처리 시퀀스. 이 컨트롤 생성, 실험 결과의 재현성을 평가 하는 일정 한 내부 기준 전압을 제공 하 고 발생 하는 문제를 해결 하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어 추출된 모의 DNA의 품질 효과적인 샘플 세포 및 DNA 추출, genomic DNA 컨트롤 미스에 대 한 통계를 제공할 수 있습니다. PCR amplicons 모의 샘플의 품질 관리 PCR 효율 및 특이성을 나타낼 수도 있습니다. 또한, mock 구성 여러 박테리아 종류, 모의 샘플에 대 한 시퀀싱 결과에 taxa의 표현으로이 샘플의 처리 된 일괄 처리에 대 한 상대 감도 유추 수 있습니다. 이상적인 모의 커뮤니티 분석 되 고 구획에 주요 세균성 종을 감지 하는 능력을 평가할 것입니다 하 고 따라서 모의 커뮤니티의 구성 연구를 할 수 있습니다. 그림 4a같이 샘플 시퀀싱 결과, 상당한 가변성이 이지만 세균 모의 커뮤니티에 대 한 시퀀스 결과가 높은 재현성 ( 그림 4b참조).
그림 4에서 모의 커뮤니티 상업적으로 사용할 수 있으며 로컬 임상 격리의 조합에서 33 긴장의 독특한 혼합물 이다, 하는 동안 상용 모의 커뮤니티는 개발된32되었습니다 최근에.
여기서 설명 하는 워크플로 다른 미생물 연구에 걸쳐 주소 재현성 광범위 하 게 하는 기능에 제한 됩니다, 그것은 중요 한 실험적인 접근 수 있도록 통합 하 연구원은 적절 한 실험 제공 제어 및 그들의 자신의 결과 내에서 모니터 재현 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 프로토콜의 개발에 대 한 Helty Adisetiyo, 박사 Shangxin 양 박사를 감사 하 고 싶습니다. 전반적인 지원에 대 한는 국제 모성 소아 청소년 에이즈 임상 실험 그룹 (IMPAACT) 국립 연구소의 알레르기와 감염 증 (NIAID)의 국립 보건원의 건강 (NIH) 보너스 번호 아래에서 제공한 UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC)와 UM1AI106716 (IMPAACT 액정), 아동 건강과 인간 발달 (NICHD)의 유 니스 케네디 슈 라이버 국립 연구소와 국립 연구소의 정신 건강 (NIMH)에서 공동 자금. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 NIH의 공식 의견을 대표 하지 않는다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AllPrep RNA/DNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction kit |
| Eliminase | Fisher Scientific | 435532 | RNase, DNase, DNA decontaminant |
| Thermo Mixer | Fisher Scientific | temperature-controlled vortexer | |
| Buffer RLT plus | Qiagen | 1053393 | guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds |
| LME Beads | MP Biomedicals | 116914050 | bead tube |
| QIAgen TissueLyzer | Qiagen | 85300 | automated sample disruptor adapter set |
| QIAshredder column | Qiagen | 79654 | |
| QIAgen RB tube | manufacturer's microcentrifuge tube in kit | ||
| QIAcube and related plasticware | Qiagen | 9001292 | automated DNA/RNA purification instrument |
| DNA exitus plus | Applichem | A7089 | non-enzymatic decontamination solution |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | elution buffer |
| QIAgility and related plasticware | Qiagen | 9001532 | robotic liquid handler |
| PCR water | MO BIO | 17000- | |
| 5PRIME HotMasterMix | Quantabio | 2200400 | |
| Barcoded reverse primers | Eurofin | No Catalog #'s | designed and ordered |
| 96 well PCR plate | USA scientific | 1402-9708 | |
| Tapestation 2200 and related plasticware | Agilent | G2964AA | automated DNA/RNA fragment analyzer |
| D1000 reagents for Tapestation | Agilent | 5067-5585 | Sample buffer and ladder are part of this kit |
| OneStep PCR Inhibitor Removal Kit | Zymo Research | 50444470 | PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit. |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher | microvolume spectrophotometer | |
| MiSeq 300 V2 kit | Illumina | 15033624/15033626 | |
| MiSeq | Illumina | No Catalog #'s | next generation sequencer |
References
- Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
- Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
- Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
- Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
- Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
- Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
- Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
- Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
- Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
- Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
- Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
- Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
- Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
- Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
- Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
- Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
- Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
- Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
- Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
- Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
- Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
- Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
- Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
- Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
- Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
- Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
- Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
- ATCC. Mock microbial communities. , Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017).
