Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En metode for målrettet 16S sekvensering av morsmelk prøver

Published: March 23, 2018 doi: 10.3791/56974
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, University of California at Los Angeles

Summary

En semi-automatisert arbeidsflyt er presentert for målrettet sekvensering av 16S rRNA fra morsmelk og andre lav-biomasse prøven.

Abstract

Studier av mikrobielle samfunn har blitt utbredt med utviklingen av relativt billig, rask og høy gjennomstrømning sekvensering. Men som med alle disse teknologiene, avhenger reproduserbare resultatene en laboratorium arbeidsflyt som inkorporerer forsiktighetsregler og kontroller. Dette er spesielt viktig med lav biomasse eksempler der forurensende bakteriell DNA kan generere misvisende resultater. Denne artikkelen omhandler en semi-automatisert arbeidsflyt for å identifisere mikrober fra menneskelig bryst melk prøver med målrettet sekvensering av regionen 16S ribosomal RNA (rRNA) V4 på en lav og middels throughput skala. Protokollen beskriver eksempel forberedelse helmelk inkluderer: sample lysis, nukleinsyre utvinning, forsterkning av regionen V4 16S rRNA genet og biblioteket forberedelser med kvalitet kontrolltiltak. Viktigere, protokollen og diskusjon vurdere problemer som er fremtredende til forberedelse og analyse av lav-biomasse prøver inkludert aktuelle positive og negative kontroller, PCR hemmer fjerning, prøve forurensning av miljømessige, reagens, eller eksperimentell kilder og eksperimentelle rutiner for å sikre reproduserbarhet. Mens som er spesifikke for morsmelk prøver er det tilpasses mange lav og høy biomasse eksempel typer, inkludert samlet på vattpinner, frosset ryddig eller stabilisert i en bevaring buffer.

Introduction

De mikrobielle samfunnene som kolonisere mennesker antas å være kritisk viktig for menneskers helse og sykdom som påvirker metabolismen, immun utvikling, mottakelighet for sykdom, og svar til vaksinasjon og stoffet terapi1, 2. innsats for å forstå innflytelsen av bakterieflora på helse nå understreke identifikasjon av mikrober forbundet med definerte anatomiske rom (dvs., hud, gut, muntlig, etc.), samt lokaliserte områder innenfor rom3,4. Underbygger dette undersøkende arbeidet er rask fremveksten og økt tilgjengelighet av neste generasjons sekvensering (NGS) teknologier som gir et massivt parallelle plattform for analyse av mikrobiell genetisk innholdet (microbiome) av en prøve. For mange fysiologiske prøver, den tilknyttede microbiome er både komplisert og rikelig (dvs., avføring), men for noen prøver, microbiome er representert ved lav mikrobiell biomasse (dvs., morsmelk, nedre luftveier) der følsomhet, eksperimentelle gjenstander og mulig smitte bli store problemer. Felles utfordringer microbiome studier og riktig eksperimentell design har vært gjenstand for flere gjennomgang artikkel5,6,7,8.

Presenteres her er en robust NGS eksperimentelle rørledning basert på målrettet sekvensering av rRNA 16S V4 regionen9 å karakterisere microbiome for human melk. Microbiome analyse av morsmelk er komplisert ikke bare som en iboende lav mikrobiell biomasse10, men i tillegg av høye nivåer av menneskelig DNA bakgrunn11,12,13,14 og potensielle carryover PCR hemmere15,16 i utdraget nukleinsyre. Denne protokollen er avhengig av kommersielt tilgjengelig utvinning kits og semi-automatisert plattformer som reduserer variasjon over eksempel forberedelse bunker. Det har et veldefinert bakteriell narr samfunn som behandles sammen med eksempler som en kvalitet kontroll å validere hvert trinn i protokollen og gi en selvstendig beregning av rørledningen robusthet. Selv om protokollen som beskrevet er spesifikke for morsmelk prøvene, det er lett tilpasses andre eksempel typer inkludert avføring, rektal, vaginal, hud, areolar og muntlig vattpinner10,17, og kan tjene som et utgangspunkt for forskere som ønsker å utføre microbiome analyserer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

For alle protokollen trinnene, riktig personlig verneutstyr (PVU) må brukes, og strenge forurensning forebygging tilnærminger skal tas. Observere flyt av arbeid fra før forsterkning arbeidsområder til etter forsterkning arbeidsområder å redusere forurensning av eksempler. Alle rekvisita brukt er sterilt, gratis RNase, DNase, DNA og pyrogen. Alle pipette-spisser filtreres. Et flytskjema protokollen trinnene tilbys (figur 1).

1. sample Lysis

Merk: Utvalg lyse og nukleinsyre utvinning er utført med en DNA/RNA utvinning kit i en ren-rom miljø der både engineering og fremgangsmåter for å minimere innføring av miljømessige bakterier til prøvene.

  1. Arbeid område forberedelse
    1. Ren arbeidsområdet biosikkerhet kabinettet (BSC) med riktige overflaten renere å eliminere alle nukleinsyre forurensning.
    2. Slå på den tempererte vortexer, og sett den til 37 ° C.
  2. Forberede guanidinium thiocyanate lyseringsbuffer (se tabell for materiale)
    1. Sjekk lyseringsbuffer for precipitates. Nytt oppløse precipitates ved oppvarming på 37 ° C.
    2. Klargjør 600 µL av lyseringsbuffer med 6 µL β-mercaptoethanol (β-ME) for hvert utvalg. Vurdere en ekstra 20% volum per prøve.
  3. Eksempel forberedelse
    1. Hvis hele melk er frosset, tine det på is. Aliquot 5 mL av hele melk i en 15-mL eller en 5-mL steril rør i BSC og holde det på is.
    2. Spinne 5-mL milk aliquot i 10 min 5000 x g på 4 ° C pellets celler.
    3. Fjerne fett laget, nå det øverste laget i røret, med en plast slikkepott eller stor bar pipette tips.
    4. Uten å forstyrre pellet, fjerne alle nedbryting unntatt 100 µL.
    5. Vask pellet av resuspending i 1 mL steril fosfat bufret saltoppløsning (PBS).
    6. Forberede 1 negativ kontroll ved å legge til 1 mL steril PBS en 5-mL tube.
    7. Overføre suspensjon slik rent 1.5-mL sentrifuge og spinne i en microcentrifuge for 1 min (5000 x g ved romtemperatur (RT)).
    8. Bruk et 1000 µL sterilt filtrerte pipette tips for å kaste hele nedbryting/fatty laget.
    9. Hvis ikke utpakking samme dag, knips fryse cellen pellets ved at den en etanol/tørr is slurry og øyeblikkelig overføre det til-80 ° C fryseren.
  4. Eksempel avbrudd og homogenisering (perle-juling)
    1. Legg 600 µL av lyseringsbuffer inneholder β-meg å pellet, og overføre suspensjon slik perle.
    2. Hver utvinning satsvise 12 inneholder 10 prøver, 1 negativ kontroll (forberedt i trinn 3.7 ovenfor) og 1 positiv kontroll (forberedt i neste trinn).
      1. Forberede 1 positiv kontroll lyseringsbuffer og 20 µL av bakteriell narr utvalget (mock samfunnet brukes har en konsentrasjon, en gang ut, av ca 0.2 ng/µL av DNA).
    3. Vortex alle perle rør kraftig for 15 s.
    4. Varme prøver på temperaturkontrollert vortexer ved 37 ° C i 10 min, med skjelvende på 700-800 rpm.
    5. Legg rør i automatiserte disruptor kortet eksempelsettet.
    6. Perle slo 1 min på 30 Hz.
    7. Demonter adapteren settet og manuelt bytte adapteren sett med eksempel plater fra venstre robotarmen rett robotarmen av instrumentet.
    8. Perle slo en annen 1 min på 30 Hz.
    9. Sentrifuger rør på 17,200 x g, for 3 min på 25 ° C.
    10. Fjern alle nedbryting med en 200 µL pipette, være forsiktig med å få noen av fet laget på toppen av prøven eller perlen gjenværende nederst i utvalget, og gjelder for en homogenizer kolonne.
    11. Sentrifuger homogenizer kolonner med maksimal hastighet, 17,200 x g, for 3 min på 25 ° C.
    12. Overføre 350 µL av eluate til en 2-mL produsentens microcentrifuge tube for bruk med automatisert instrumentet for rensing av DNA og RNA (ikke bruker noen andre rør). Vær forsiktig med å overføre eventuelle gjenværende fet lag.
    13. Hvis gjennomflytsenhet volumet er mindre enn 350 µL, legge lyseringsbuffer med β-ME til et endelig antall 350 µL.
    14. La prøvene på RT for opptil 2 timer før du fortsetter til nukleinsyre isolasjon bruk av automatiserte DNA rensing instrumentet, eller fryse på-80 ° C.
  5. Rengjøring arbeidsområdet
    1. Ren alle flater i bruk med en ikke-enzymatisk dekontaminering løsning, la stå i 10 min, så spray med 70% etanol og tørk overflaten.

2. isolere DNA/RNA

  1. Arbeid område forberedelse
    1. Slå på varmen blokken og sett temperaturen 70 ° C.
    2. Slå på den tempererte vortexer og sett temperaturen 37 ° C.
    3. Varm opp elueringsbufferen (EB) som inneholder 10 mM Tris-Cl, pH 8.5, en 50-mL tube til 70 ° C.
    4. Varm opp 350 µL av frosne utvalg lysates i 2 mL rør på 37 ° C før helt tint uten noen utløse (ca 10 min).
  2. DNA rensing
    1. Vortex og sentrifuger 2-mL rør med prøve kort (3000 x g for 10 s).
    2. Sett inn 2 mL rør i shaker etter automatisert DNA/RNA rensing instrumentets lasting diagram, henhold til produsentens anvisninger.
    3. Få rotoren adaptere og satt dem opp på skuffen basert på antall utdrag.
    4. Label hver rotoren adapter basert på den prøven identifikasjon (ID).
    5. Avskåret lokkene og glatt kantene på individuelle spinn kolonner for DNA og RNA.
    6. Sett inn kolonnen DNA spinn uten samling rør i rotoren adapteren. Kast samling røret.
    7. Etiketten 1,5 mL samling rør, og sett inn rotoren adaptere.
    8. Angi rotoren adaptere i sentrifugen etter automatisert DNA/RNA rensing instrumentets lasting diagram.
    9. Inn produsentens 1000 µL filter-tips tips stativer.
    10. Legge til RNase-fritt vann til en 2-mL produsentens microcentrifuge tube basert på antall prøver (per maskin protokollen instruksjoner).
    11. Sett røret i åpning "A" microcentrifuge tube spor.
    12. Kast eventuelle reagens som er igjen i reagensflaskene og fyll med en minimum mengde 10 mL.
    13. Reagensflasker inn reagens flasken holderen (unntatt EB flaske).
    14. Legge til varm EB fra en 50-mL tube reagens flaske plasseringen 6.
    15. Sjekk 1,5 mL rør plasseres tett i rotoren adaptere.
    16. Lukk instrumentets lokket og velg: "RNA" → "utvinning kit" → "Dyr, vev og celler" → "kit navn 350 µL del A Custom DNA" → Rediger elueringsrør volum 100 µL (standard) eller 50 µL for lav biomasse prøver → "Start."
    17. Når fullført, Fjern rotoren adaptere ut av centrifuge og plassere dem på brettet.
    18. Kast kolonnen DNA spinn fra rotoren adapter posisjon 3.
    19. Kast ikke rotoren adaptere, RNA i posisjon 2.
    20. Fjern 1,5 mL samling rør som inneholder elut DNA ved posisjon 3, og lagre i −20 ° C.
    21. Samle prøven inneholder rør fra shaker og butikken i −20 ° C, hvis noen eksempel står over, ellers Forkast.
    22. Fortsett med "kit navn 350 µL del B RNA" for ytterligere rensing av RNA-protokollen.
    23. RNA rensingen gjøres fra den ca 350 µL gjennomflytsenhet i midtstilling av rotoren adaptere.
  3. RNA rensing
    1. Sett inn rotoren adapteren RNA spinn kolonnen uten sin samling rør og lokk.
    2. Merke nye 1,5 mL samling rør og sette dem inn i rotoren adapter som angitt i håndboken.
    3. Angi rotoren adaptere i sentrifugen etter automatisert DNA/RNA rensing instrumentets lasting diagram.
    4. Lukk instrumentets lokket og velg: "RNA" → "Produsentens Kit" → "Dyr, vev og celler" → "Standard del B RNA" → "Start".
    5. Når fullført, Fjern rotoren adaptere ut av centrifuge og plassere dem på brettet.
    6. Kast RNA spinn kolonnen fra stilling 3.
    7. Fjern 1,5 mL samling rør som inneholder 30 µL elut RNA ved posisjon 3, og lagre på −80 ° C.
    8. Fjerne reagensflaskene.
    9. Kast rotoren adapter innholdet gjennom riktig spesialavfall kanaler.
  4. Rent arbeidsstasjon
    1. Spray automatisert DNA/RNA rensing instrumentets tilbehør, som reagens stativer, brett og alle andre overflaten i bruk med en ikke-enzymatisk dekontaminering løsning, la stå i 10 min og skyll med vaskebuffer (DI) vann og la det tørke.
    2. Spray automatisert apparatet bare produsenten godkjent ikke-enzymatisk dekontaminering løsning, tørk inn siden av sentrifuge med alle flater i bruk, la stå i 10 min og tørk med 70% etanol. Ikke bruk andre typer dekontaminering løsninger som de kan skade apparatet.

3. målrettet 16S PCR oppsett

Merk: Opplegget for 16S PCR er gjennomført i en utpekt pre forsterkning arbeidsområde ligger den rent-rom. Reagenser og prøver er forberedt og deretter lastet opp på en flytende hånd til å utføre PCR for hvert utvalg i tre eksemplarer (30 prøver, som inneholder ekte eksempler og utvinning positive og negative kontroller, pluss 2 PCR vann kontroller i tre eksemplarer, totalt 96 kombinert prøver og kontroller). Når PCR reaksjonene er samlet og forseglet, er prøve platen overført til en termisk cycler ligger i en post forsterkning for sykling.

  1. Arbeid område forberedelse
    1. Rengjør PCR arbeidsstasjonen. Spray alle flater i bruk med en RNase, DNase, DNA decontaminant, etterfulgt av Ionisert vann to ganger, og endelig 70% etanol.
    2. Forberede 16S PCR regnearket (se målrettet 16S PCR regneark) med en riktig utvalg liste og tildele ulike barcoded primere for hver eksempel9. Skrive ut regnearket og plate kartene (se Plate 1).
  2. PCR master blanding forberedelse
    Merk: 16S primer utvalg er basert på området av interesse for studien, og kan endres av studien eller prøven. Derfor før bestilling primere, er det viktig å bekrefte området av 16S rRNA beste forsterker mikrober av interesse for studien. Denne protokollen som skrevet er forsterkning av regionen 16S V4. Hvis forskjellige primere/region er valgt, så krever annealing temperaturen i termisk sykling justering.
    1. Arbeid i PCR arbeidsstasjonen å forberede alt.
    2. Ta ut 50-100 µL av DNA-prøver fra 20 ° C, og alle reagenser som trengs, og tiner dem på isen. Vortex og kort spinne ned.
    3. Primerne er pre utvannet til arbeider konsentrasjonen av 5 µM i et minimum volum på 20 µL.
    4. Klargjør PCR master blandingen i bestemte 5 mL tube med bare frem primer etter beregning på regnearket.
  3. Forbereder robot flytende behandlingsprogrammet for automatisert PCR-oppsett
    1. For eksempler, ta ut en 32-vel instrumentets eksempel adapter og laste 50-100 µL av DNA-prøver vist på 96-brønns plate kartet i henhold til produsentens instruksjoner.
      1. For hver PCR plate, definere 2 negative kontroller ved å plassere 30 µL PCR vann i en ren eksempel rør.
      2. Plassere alle prøvene på 32-vel instrumentets eksempel adapter med caps låst i åpen posisjon.
    2. For omvendt primere9
      1. Fjerne hetten av hver omvendt primer med bestemt strekkode # 's en om gangen (endre hansker i mellom å unngå kryss-kontaminering).
      2. Plass maksimalt 32 primere på instrumentets reagens adapter.
    3. Ta ut en 96-brønns PCR platen og Merk den med studie navn, prøve nummer, dato og tekniker initialer.
    4. Lasting robot flytende behandleren
      1. Plassere reagens adapteren i posisjon B1. For å unngå en kant effekt, forsiktig plassere en av kantene på adapteren mot siden grep, og sakte nedlegge den andre kanten. Sørg for å presse på alle hjørner av adaptere.
      2. Plass prøven adapteren i posisjon C1. Sørg for å presse på alle hjørner av adaptere.
      3. Vortex 5-mL master mix, åpne lokket, og plasser den i posisjon et i instrumentets master mix og reagens kvartal.
      4. Plass PCR platen på 96-brønns instrumentets adapter som er ment å holde halv skirted PCR-plater.
      5. Start Kjør, og lagre som en ny fil.
      6. Følg instruksjonene og haken hver gang: en, er tips, to, avfall-boksen er tilgjengelig, og tre, start.
    5. Etter kjøringen er fullført, kan du kontrollere det er ingen feil ved å kontrollere maskinen for feilmeldinger.
    6. Forsegle platen med 12 eller 8 stripe caps, vortex kraftig, Nedspinning for 1 min bruker en 96-brønns plate spinner og plassere den på isen eller i kjøleskapet.
    7. Fjerne rør som inneholder omvendt primere og eksempler.
    8. Ta 96-brønns platen etter forsterkning rommet og laste platen på termisk cycler og syklus i henhold til tabellen termisk-sykling betingelser (se tabell 1).

4. mål 16S innlegget PCR kvalitetskontroll bruker Tape-basert plattform for Gel geleelektroforese

Merk: Post PCR kvalitetskontroll (QC) og alle påfølgende trinnene utføres i et angitt etter forsterkning i laboratoriet. DNA er analysert i en automatisert DNA/RNA fragment analyserer.

  1. Arbeid område forberedelse
    1. Rengjør arbeidsstasjonen ved sprøyting alle flater i bruk med en RNase, DNase, DNA decontaminant, etterfulgt av Ionisert vann to ganger, og endelig 70% etanol.
    2. Samle alle forsyninger og utstyr som trengs.
  2. Forberede reagenser
    1. Plasser prøven buffer og stige i temperaturstyrte vortexer ved 25 ° C i minst 30 min.
  3. Mens reagensene er oppvarming, forberede PCR prøver ved pooling 3 PCR gjentak for hver prøve inn i et enkelt rør
  4. Laste inn eksempler på apparatet.
  5. Kort vortex og rotere ned rør med grupperte PCR-produkt.
  6. Plasser instrumentets 96-brønns platen på et stativ på RT og merke.
  7. Kort vortex og spinn ned eksempel buffer og stige.
  8. Tilsett 3 µL eksempel buffer hver brønn av 96 godt plate (trenger minst 53 µL/skjerm tape).
  9. Kjøre et likt antall prøver; Hvis det er ulikt antall eksempler, legge 4 µL eksempel bufferen til en tom godt.
  10. Legge til 1 µL av stigen i en stige også.
  11. Følgende kartet, legge 1 µL av grupperte PCR produkt til den utpekte også.
  12. Dekkramme med folie segl
  13. Vortex platen bruker instrumentets vortexer og adapter på 2000 rpm for 1 min.
  14. Spinne ned posisjonen prøven på bunnen av røret, hvis det er bobler spinn ned igjen.
  15. Start programvaren.
  16. Legg tape og lasting skjermtips i instrumentet.
  17. Legg prøver i fragment analysatoren med en 96-brønns adapter.
  18. Definere en kjører med programvaren.
  19. Pass på å velge selv nummererte brønner.
  20. Skrive eksempel IDer.
  21. Kontroller at alle brønnene av skjermen tape er uthevet i grått.
  22. Kontroller at analyserer gjenkjenner alle pipette-spisser.
  23. Velg start og angi et filnavn for å lagre resultatene (studere navn, prøve tall og dato).
  24. Se produsentens instruksjoner for mer informasjon.
  25. Etter fullført, forkaste tips, skjermen bånd og rør.
  26. Analysere data for 16S peak nM (mellom 315-450 bp for V4). Denne toppen varierer avhengig primerne valgt.

5. biblioteket beregning, Pooling, rydde opp, og QC

  1. Etter fastsettelsen amplicon størrelse og molarity av alle prøver, basseng bibliotekene for å oppnå den endelige ønsket volum og nM for grupperte biblioteket (se eksempel beregning).
  2. Opprydding og konsentrere gruppert biblioteket bruker en silica-membranbasert rensing kit for PCR produkter, ifølge produsentens protokollen (se Tabell for materiale).
    1. Elute DNA med et siste volum på 50 µL.
  3. Måle konsentrasjonen av renset biblioteket umiddelbart ved hjelp av en double-strandet DNA høy følsomhet kit for en fluorometer, i henhold til produsentens protokollen.
    1. Fortynne 2 µL av grupperte og renset biblioteket med 198 µL fortynning buffer pluss fargestoff (1: 100 fortynning).
    2. Registrere målt fra fluorometric enheten og konvertere den i henhold til fortynningsfaktoren.
  4. Bruker konsentrasjonen lesing (ng/µL) for grupperte biblioteket, beregne biblioteket molarity i nM. Bruk 1 µL ufortynnet bibliotek å måle OD260/280 på et microvolume spektrofotometer.
    Merk: Verdien 1,8-2,0 angir tilstrekkelig renhet av biblioteket.
  5. Lagre siste biblioteket på 20 ° C til du er klar for neste generasjons sekvensering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen presenteres her inneholder viktig kvalitetskontroll (QC) trinn for å sikre at data generert møte benchmarks for protokollen sensitivitet og spesifisitet forurensning kontroll. Protokollen QC steg følger PCR forsterkning av 16S V4 regionen (figur 2). En µL av PCR produktet fra hver prøve ble analysert av geleelektroforese å bekrefte at det var innen forventet størrelse 315-450 bp (figur 2, rød pil). Eksempler morsmelk generert lavere mengder bestemt produkt (figur 2A, sammenligne baner 3 og 9-11 med kjørefelt 4-8), foreslå enten lave nivåer av utdraget mikrobiell DNA i disse prøvene eller bære-over for PCR hemmere under utvinning. For prøver som produserer mindre enn 2.0 nM produkt i 315-450 bp området (figur 2A, lane 7), PCR hemmer opprydding er båret ut ved hjelp av en enkelt trinn kit og prøven er nytt forsterket. Suksess priser for utvinning av prøven forsterkning etter rengjøring er ca 40%. Kvantifisering av bestemt produkt for hver prøve (figur 2B) er avgjørende for å bestemme nødvendige volumet for lik molar samkjøring av prøver for sekvenser. Et gruppert bibliotek for målrettet sekvensering er vanligvis dominert av et bestemt PCR produkt (Figur 3). Hvis det er en betydelig mengde ikke-spesifikke produktet i biblioteket, bør litt gel-rensing legges til arbeidsflyten.

I eksemplet i figur 2Asvak band observeres for bufferen kontroller (BC; baner 2 og 12) og PCR vann negativ kontroll (PC, lane 1), som angir mulig miljømessige eller reagens forurensning. Band er ikke uvanlig og vanligvis representerer lave mengder PCR produkt (dvs.< 1 nM) og gi noen Les teller under sekvensering (< 1000). Representant sekvensering resultater (Figur 4) bekrefte at disse prøvene faktisk har svært lav sekvensering lese teller (figur 4A, baner 1 og 11; Figur 4B, Buffer og PCR vann baner) og, viktigst, taxa sammensetningen for kontroll prøvene er forskjellig fra morsmelk prøvene (figur 4A; sammenligne baner 1 og 11 med baner 2-10). Høy Les teller i negativ kontrollene med betydelig overlapping i taxa komposisjon mellom kontroller og prøver, foreslår kryssforurensning og behovet for bedre forurensningskontroll.

Sekvensering resultatene (Figur 4) viser høy diversitet i taxa forbundet med morsmelk microbiome og variasjon av sekvensering lese teller hvert utvalg (figur 4A, baner 2-10). Derimot sekvensering resultatene for bakteriell narr som ble behandlet med morsmelk prøvene viste taxa komposisjon og lese teller som var sammenlignes med resultatene for falske i forrige arbeidsflyten kjører (sammenligne figur 4A , lane 12 med figur 4B, mock baner). De konsekvente resultatene for uekte kjørefelt foreslår at observert variasjon for morsmelk prøvene er et autentisk eksperimentelle resultat, og ikke en funksjon av iboende arbeidsflyt variasjon.

Figure 1
Figur 1: flytdiagram for målrettet 16S sekvensering rørledningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: kvalitetskontroll analyse av 16S V4 amplicons. (A) Gel bilde av 16S V4 amplicons løses ved geleelektroforese bruker en automatisert DNA/RNA fragment analyserer. 16S V4 amplicons ble generert etter Caporaso et al. 9og en µL av hvert PCR-produkt ble analysert med høy følsomhet DNA reagenser i henhold til produsentens retningslinjer. De fleste mennesker melk prøver (baner 3-6 og 8-11) og de bakterielle falske (lane 13) produsert en primær PCR produkt på den forventede størrelsen på ca 400 bp (rød pil). Morsmelk prøven i lane 7 kunne produsere en betydelig mengde bestemt produkt og ble opprydding og re forsterkning. Minimal produktet ble oppdaget for PCR negative kontrollen (PC, lane 1), og lyse buffer negative kontroller (F.Kr, baner 2 og 12) angitt minimal forurensing i de analyserte prøvene. MW molekylvekt markører: øvre rød og nedre grønne stolper identifisere 1 500 bp og 25 bp størrelse markører, i hver fil. (B) topp Electropherogram av lane 3 fra gel i (A). Primære PCR produktet faller innenfor topp-området som er definert av de røde, loddrette streker og består av fragmenter varierer i størrelse fra 299-497 bp som resulterer i en gjennomsnittlig PCR produktet størrelse på 396 bp. Gating er gjort på et litt større utvalg enn forventet amplicon størrelsen (i n dette tilfellet 315-450 bp) skal sørge for å inkludere hele prøven toppen. Øvre og nedre toppene korrelerer med fragment størrelser 25 bp og 1500 bp, henholdsvis. Bunnen: diagrammet oppsummerer størrelse parameterne for peak regionen, konsentrasjonen i ng/µL av PCR produktet i peak regionen og molarity i nM for det bestemte PCR-produktet. Denne informasjonen brukes deretter til å beregne hvor mye av hvert utvalg vil være samlet i en lik molar bibliotek for sekvensering (se eksempel beregning). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Electropherogram av en gruppert og konsentrert sekvensering bibliotek. Lik molar mengder personlige prøver som ble sekvensert var kombinert i et gruppert bibliotek. Biblioteket var så renset og konsentrert til et totalt volum på 50 µL bruker en silica-membranbasert PCR rydde opp kit. Siste forberedelse av biblioteket for sekvensering på neste generasjon sequenceren ble gjennomført i henhold til produsentens protokollen. Dette biblioteket var vellykket rekkefølge til tross for tilstedeværelsen av flere band. Hvis det er en bekymring om PCR produkter utenfor den forventede størrelsen, antyder produsentens protokollen tillegg av en gel størrelse utvalg trinn. Dette QC trinnet utføres vanligvis ikke. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: evaluering av negative og positive kontroller. (A) Relative abundances av bakteriell taxa i en utvinning batch med kontroller og morsmelk prøver. Som QC mål genereres komposisjoner av hvert utvinning parti som lastet på automatiserte DNA/RNA rensing apparatet umiddelbart etter en sekvensering kjøre. Tall under hver utvalget bar angir antall filtrerte leser for respektive prøven. Komposisjonene til buffer kontrollene er distinkt fra den i morsmelk prøvene. (B) Relative abundances av bakteriell taxa i bufferen, uekte og PCR kontroller. Leser og komposisjon evalueres for alle negative (buffer og PCR vann) og positiv (bakteriell narr) kontroller. Komposisjoner av bufferen og vann varierer, men narr samfunnet er ganske stabilt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målrettet neste generasjons sekvensering av 16S rRNA er en mye brukt, rask teknikk for microbiome karakterisering18. Men kan mange faktorer, inkludert satsvise effekter, miljøforurensning, prøve kryssforurensning, følsomhet og reproduserbarhet negativt påvirke eksperimentelle resultater og forvirre deres tolkning7,19 , 20. til beste rette robust 16S analyser, microbiome arbeidsflyter må innarbeide gode eksperimentell design, bruk av egnede kontroller, segregering av Arbeidsflyttrinn, og anvendelse av beste praksis. Protokollen beskrevet her har hver av disse parameterne og inneholder viktig eksperimentelle verktøy over utfordringene og implementere en 16S arbeidsflyt for mangfoldig eksempler.

God eksperimentell design er avgjørende for 16S microbiome analyserer. Dette inkluderer riktig innsamling og oppbevaring av prøver og utvalg av 16S primere passer for regionen rundt. For eksempel er V4 regionen (515F/806R) valgt for morsmelk fordi den har gode forsterkningen av Bifidobacterium, som spiller en viktig rolle i utviklingen av neonatal gut microbiome21. Andre primer sett (f.eks, 27F/338R, 515F/926R) kan være mer passende for studier av andre mikrobielle samfunn. Viktig merknad er at den annealing temperatur for det målrettede 16S PCR og forventet amplicon størrelsen kan variere basert på primer utvalg.

Andre steder protokollen kan endres basert på resultatene av QC trinn i arbeidsflyten. Det finnes noen alternativer for feilsøking når enten ingen eller liten DNA oppdages etter målrettet 16S PCR forsterkning trinn. 1) prøven kan settes gjennom en PCR hemmer fjerning trinn. Forsterkning følgende PCR hemmer fjerning ved hjelp av en enkelt trinn kit utført per produsentens protokollen er vellykket ca førti prosent av tiden, 2) mer utdraget DNA kan legges til den målrettede 16S PCR, eller 3) en ny og potensielt større aliquot melk kan behandles hvis tilgjengelig. Hvis det er en bekymring om PCR produkter utenfor den forventede størrelsen etter silika-membranbasert rensing av biblioteket, kan du legge litt gel rensing. Endelig er QC trinnene avgjørende for å avgjøre om det er bevis for forurensning, som er diskutert i detalj nedenfor. Hvis betydelige forurensning oppdages, avhengig av hvor forurensning er introdusert, enten PCR kan gjentas, eller eventuelt prøven kan være nytt utdraget. Heldigvis, med god laboratorium praksis, dette er sjeldne hendelser. Til slutt, mens denne protokollen er skrevet for å fremheve advarsler i forsterkningen på lav biomasse eksempler og spesielt morsmelk, protokollen enkelt kan modifiseres for forsterkning, endetarmen, vaginal, og hud vattpinner eller svamper, samt krakk. Hvis andre eksempel typer blir valgt, er så vurdering gitt som utvinning kits er optimal for den bestemte utvalg.

Satsvise effektene skyldes kits, reagenser, sekvensering kjører er viktige kilder til variasjon i microbiome studier. DNA utvinning kits, sammen med andre reagenser, har lave nivåer av bakteriell DNA, som kan variere betydelig fra mange20,22,23,24. For et stort prosjekt, bruker en enkelt rekke kits, reagenser, kan velge kits for å minimere kit forurensning forenkle analyse7. Eksempler på både fag og kontroller behandles side ved side. Det er best hvis alle prøvene for en enkelt studie, begge underlagt kontroll og kan inkluderes i en enkelt sekvensering kjøre. Hvis et stort antall eksempler som skal behandles satsvis, eksempler som representant for både fag og kontroller inngår i hver gruppe og behandlet sammen. Det er også viktig å organisere satsvis behandling for å redusere forurensning av lav-biomasse prøver (dvs., morsmelk) av prøver som er høy biomasse (dvs., avføring). I slike tilfeller kan du behandle lav biomasse eksempel typer først, og høy biomasse samples for samme studien.

Lav biomasse prøver utgjør unike utfordringer for microbiome studier, som forurensning fra miljøet, reagenser, instrumenter og forskeren kan gjøre det vanskelig å skille mellom autentisk medlemmer i lav overflod7 , 25 , 26 og de som er kunstig introdusert til utvalget gjennom eksperimentell prosessen19. Arbeidsflyten beskrevet her inneholder viktige eksperimentelle negative kontroller på både det prøven forberedelse trinnet (buffer-bare lysis kontroll), og den PCR (PCR vann kontroll) (se Figur 4). Disse kontrollene å identifisere forurensning kilder og rette effektive korrigerende tiltak på den benken eller i sili27,28,29,30. Negative kontroller er nøye vurdert og rapportert med studien resultater7.

Minimere forurensning, segregering av eksperimentelle aktiviteter i en ren pre-PCR forsterkning og etter forsterkning område er viktig. Optimalt, clean rommet har både et område for PCR master blanding forberedelse og et utvalg forberedelse/tillegg Master blande området, og kan inkludere en separat dead air eller biologiske sikkerhetskabinett regjering boliger dedikert forbruksvarer og små utstyr nødvendig for den Master blanding forberedelse. Rent design har en positiv luftstrømmen system med høy effektivitet particulate luft (HEPA) filtrering. Bruk av personlig verneutstyr er avgjørende for å opprettholde en kontrollert, lav-mikrobiell miljø, og inkluderer hairnets, labfrakker, hansker, og skoovertrekk. Kits/reagenser og prøver, ideelt lagres i separate dedikert kjøleskap/fryser. PCR-oppsettet gjøres også på clean rommet i utpekte arbeidsstasjoner; klart skille primer aksjer og reagenser fra utdraget DNA opprettholdes inntil prøver er lastet på automatiserte pipettering plattformen. Når et PCR-installasjonen er fullført, er platen overført til modulen stolpe forsterkning og lastet inn en termisk cycler.

Det er viktig å begrense strømmen av arbeidsaktivitet fra rene områder etter forsterkning områder; Det er ingen retrograd bevegelse reagenser, instrumenter eller forsyninger fra etter forsterkning områder til ren området. Personell har angitt noe av arealene opp etter forsterkning blokkeres fra oppføringen til ren området i 24 timer (inntil neste dag). I tillegg til de ovennevnte arbeidsflyt hensyn, må rengjøring protokollene implementeres både rene og etter forsterkning områder å minimere nukleinsyre forurensning av arbeidsflater og instrumentering. Hvis fysiske barrierer eller separate rom ikke er mulig, må alle tiltak tas å sette opp arbeidet i områder så langt fra hverandre som mulig.

I tillegg til forurensning, er microbiome studier utfordret av følsomhet, variasjon og reproduserbarhet31. Denne protokollen løser disse problemene ved å innlemme et definert bakteriell narr samfunn som er pakket ut, forsterket, og sekvensielt med hvert parti av prøvene (se figur 4b). Denne kontrollen gir en konstant intern referanse som evalueres reproduserbarhet av eksperimentelle resultatene som genereres, og kan brukes til å feilsøke problemer som oppstår. Kvaliteten på utdraget narr DNA kan for eksempel gi en beregning for effektiv utvalg lyse og DNA utvinning, som genomisk DNA kontroller savner. Kvalitetskontroll av PCR amplicons for uekte prøven kan også indikere PCR effektivitet og spesifisitet. Videre fordi falske omfatter flere bakterier typer, kan relativt sensitiviteten behandlet flere av prøver være avledet av representasjon av taxa i sekvensering resultatene for uekte prøven. En ideell falske samfunnet vil vurdere muligheten til å oppdage viktige bakteriell arter i rommet blir analysert, og derfor sammensetningen av uekte samfunnet må varierer etter studien. Som vist i figur 4a, det er betydelig variasjon blant eksempel sekvensering resultater, men sekvens resultatene for bakteriell narr samfunnet er svært reproduserbare (se figur 4b).

Mens den uekte gruppen i Figur 4 er en unik blanding av 33 stammer fra en kombinasjon av kommersielt tilgjengelig og lokale kliniske isolater, har et kommersielt tilgjengelig narr samfunn nylig blitt utviklet32.

Selv om arbeidsflyten beskrevet her er begrenset i sin evne til å bredt adresse reproduserbarhet over forskjellige microbiome studier, gir det en viktig eksperimentelle tilnærming som tillater forskere å innlemme aktuelle eksperimentelle Kontroller og skjermen reproduserbarhet innenfor sine egne resultater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Helty Adisetiyo, PhD og Shangxin Yang, PhD for utvikling av protokollen. Generell støtte for internasjonale mors Pediatric ungdom AIDS kliniske forsøk gruppe (IMPAACT) ble gitt av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (NIAID) av den National Institutes of Health (NIH) under prisen tall UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) og UM1AI106716 (IMPAACT lb), med co-finansiering fra Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) og National Institute of Mental Health (NIMH). Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AllPrep RNA/DNA Mini Kit Qiagen 80204 DNA/RNA extraction kit
Eliminase Fisher Scientific 435532 RNase, DNase, DNA decontaminant
Thermo Mixer Fisher Scientific temperature-controlled vortexer
Buffer RLT plus Qiagen 1053393 guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689-25ML-F ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME Beads MP Biomedicals 116914050 bead tube
QIAgen TissueLyzer Qiagen 85300 automated sample disruptor adapter set
QIAshredder column Qiagen 79654
QIAgen RB tube manufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticware Qiagen 9001292 automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plus Applichem A7089 non-enzymatic decontamination solution
EB Buffer Qiagen 19086 elution buffer
QIAgility and related plasticware Qiagen 9001532 robotic liquid handler
PCR water MO BIO 17000-
5PRIME HotMasterMix Quantabio 2200400
Barcoded reverse primers Eurofin No Catalog #'s designed and ordered
96 well PCR plate USA scientific 1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticware Agilent G2964AA automated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation Agilent 5067-5585 Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit Zymo Research 50444470 PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32854 dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216
NanoDrop Thermo Fisher microvolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kit Illumina 15033624/15033626
MiSeq Illumina No Catalog #'s next generation sequencer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
  2. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
  3. Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
  4. Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
  5. Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
  6. Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
  7. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
  8. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
  9. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  10. Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
  11. Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
  12. Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
  13. Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
  14. Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
  15. Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
  16. Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
  17. Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
  18. Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
  19. Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
  20. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  21. Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
  22. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
  23. Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
  24. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
  25. Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
  26. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
  27. Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
  28. Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
  29. Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
  30. Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
  31. Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
  32. ATCC. Mock microbial communities. , Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 133 16S Ribosomal RNA Microbiome neste generasjons sekvensering morsmelk morsmelk lav biomasse
En metode for målrettet 16S sekvensering av morsmelk prøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih,… More

Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih, S., Lee, D. J., Li, F., Aldrovandi, G. M. A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples. J. Vis. Exp. (133), e56974, doi:10.3791/56974 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter