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Immunology and Infection

Un metodo per il sequenziamento del 16S mirato di campioni di latte umano

Published: March 23, 2018 doi: 10.3791/56974
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, University of California at Los Angeles

Summary

Un flusso di lavoro semi-automatizzato è presentato per mirati sequenziamento del 16S rRNA da latte umano e altri tipi di campioni di basso-biomassa.

Abstract

Studi delle comunità microbiche sono diventati diffusi con lo sviluppo di sequenziamento relativamente poco costoso, rapido e di alta. Tuttavia, come con tutte queste tecnologie, risultati riproducibili dipendono da un flusso di lavoro di laboratorio che incorpora controlli e precauzioni appropriate. Ciò è particolarmente importante con i campioni di basso-biomassa dove la contaminazione di DNA batterico può generare risultati fuorvianti. Questo articolo descrive in dettaglio un semi-automatico del flusso di lavoro per identificare i microbi da campioni di latte materno umano mediante sequenziamento mirato della regione 16S RNA ribosomiale (rRNA) V4 su una scala di basso - medio throughput. Il protocollo descrive la preparazione del campione da latte intero compreso: campione Lisi, estrazione di acidi nucleici, amplificazione della regione V4 del gene del rRNA 16S e preparazione di libreria con misure di controllo di qualità. D'importanza, il protocollo e la discussione considerare questioni che sono salienti per la preparazione e l'analisi di campioni di basso-biomassa tra cui adeguati controlli positivi e negativi, rimozione di inibitore PCR, contaminazione del campione di ambientale, reagente, o fonti sperimentali e progettati per garantire la riproducibilità sperimentale procedure consigliate. Mentre il protocollo come descritto è specifico di campioni di latte umano, è adattabile a numerosi tipi di campioni di biomassa bassa e alta, compresi i campioni raccolti su tamponi, congelati pura, o stabilizzato in un buffer di conservazione.

Introduction

Le comunità microbiche che colonizzano gli esseri umani sono credute per essere estremamente importante per la salute umana e la malattia che influenzano il metabolismo, lo sviluppo immune, suscettibilità alla malattia e le risposte alla vaccinazione e farmaco terapia1, 2. gli sforzi per comprendere l'influenza del microbiota sulla salute umana attualmente sottolineano l'identificazione di microbi associati definite compartimenti anatomici (cioè, pelle, intestino, orale, ecc.), così come siti localizzati all'interno questi scomparti3,4. Alla base di questi sforzi investigativi è il rapido emergere e la maggiore accessibilità delle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) che forniscono una piattaforma massicciamente parallela per l'analisi del contenuto genetico microbico (microbiome) di un campione. Per molti campioni fisiologici, il microbioma associato è complessa e abbondante (cioè, sgabello), ma, per alcuni campioni, il microbioma è rappresentato dalla biomassa microbica bassa (cioè, latte umano, delle vie respiratorie inferiori) dove sensibilità, manufatti sperimentali e possibili contaminazioni diventano grossi problemi. Le sfide comuni del microbioma studi e appropriato disegno sperimentale sono stati oggetto di più recensione articoli5,6,7,8.

Presentato qui è una robusta pipeline NGS sperimentale basata su mirata sequenza del rRNA 16S V4 regione9 per caratterizzare il microbioma del latte umano. Microbioma analisi del latte umano sono complicato non solo da una biomassa microbica intrinsecamente bassa10, ma inoltre da alta livelli di DNA umano di base11,12,13,14 e riporto potenziale di PCR inibitori15,16 in estratti dell'acido nucleico. Questo protocollo si basa su piattaforme semi-automatizzate che consentono di ridurre la variabilità in batch di preparazione del campione e kit di estrazione disponibile in commercio. Esso incorpora una ben definita comunità batterica finta che viene elaborata insieme agli esempi come un controllo di qualità per convalidare ogni passaggio nel protocollo e fornire una metrica indipendente della robustezza della pipeline. Sebbene il protocollo come descritto è specifico per i campioni di latte umano, è facilmente adattabile ad altri tipi di campione tra cui sgabello, rettale, vaginale, pelle, tamponi areolare e orale10,17e può servire come punto di partenza per i ricercatori che desiderano eseguono analisi microbioma.

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Protocol

Per tutti i passaggi di protocollo, dispositivi di protezione personale (PPE) devono essere indossati e approcci di prevenzione contaminazione rigorosi devono essere prese. Osservare il flusso di lavoro da pre-amplificazione aree di aree di lavoro di post-amplificazione per minimizzare la contaminazione dei campioni di lavoro. Tutte le forniture utilizzate sono sterili, libero della RNasi, DNasi, DNA e pirogeni. Tutti i puntali vengono filtrati. Un diagramma di flusso dei passaggi del protocollo è fornito (Figura 1).

1. lisi del campione

Nota: Lisi del campione ed estrazione di acidi nucleici vengono eseguite utilizzando un kit di estrazione di DNA/RNA in un ambiente pulito dove sia procedurali che ingegneria dei controlli sono in atto per ridurre al minimo l'introduzione di batteri ambientali ai campioni.

  1. Preparazione dell'area di lavoro
    1. Pulire l'armadio di sicurezza biologica (BSC) lavora zona con detergente appropriato superficie per eliminare eventuali contaminazioni di acido nucleico.
    2. Accendere il Vortex a temperatura controllata e impostarlo a 37 ° C.
  2. Preparare il tampone di lisi tiocianato di guanidinium (Vedi tabella materiali)
    1. Controllare il buffer di lisi per precipitati. Ri-sciogliere precipitati dal riscaldamento a 37 ° C.
    2. Preparare 600 µ l di tampone di lisi con 6 µ l β-mercaptoetanolo (β-ME) per ogni campione. Si consideri un volume di 20% supplementare per campione.
  3. Preparazione del campione
    1. Se il latte intero è congelato, scongelare su ghiaccio. Aliquotare 5ml di intero latte in un 15 mL o in una provetta sterile 5 mL in BSC e tenerlo sul ghiaccio.
    2. Girare il latte 5 mL aliquota per 10 min a 5.000 x g a 4 ° C per agglomerare le cellule.
    3. Rimuovere lo strato di grasso, ora lo strato superiore del tubo, con una spatola di plastica o grande foro punta della pipetta.
    4. Senza disturbare il pellet, rimuovere tutto il supernatante ad eccezione di 100 µ l.
    5. Lavare la pallina di risospensione in 1 mL di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS).
    6. Preparare 1 controllo negativo aggiungendo 1 mL di PBS sterile in una provetta 5 mL.
    7. Trasferire la sospensione in una provetta pulita 1,5 mL centrifuga e spin in una microcentrifuga per 1 min (a temperatura ambiente (TA) fino a 5.000 x g).
    8. Per scartare l'intero livello di surnatante/grassi, usare una punta di pipetta sterile filtrata 1.000 µ l.
    9. Se non estraendo lo stesso giorno, snap congela la cella a pellet inserendolo in un etanolo/a secco ghiaccio semiliquido e trasferire immediatamente al congelatore-80 ° C.
  4. Rottura del campione e l'omogeneizzazione (tallone-battente)
    1. Aggiungere 600 µ l di tampone di lisi contenente β-ME al pellet e trasferire la sospensione in una provetta di tallone.
    2. Ogni lotto di estrazione di 12 contiene 10 campioni, 1 controllo negativo (preparata al punto 3.7 sopra) e 1 controllo positivo (preparato nel passaggio successivo).
      1. Preparare 1 controllo positivo con buffer di lisi e 20 µ l del campione finto batterico (la comunità finta utilizzata ha una concentrazione, una volta estratta, di circa 0,2 ng / µ l di DNA).
    3. Vortice tutti perlina tubi energicamente per 15 s.
    4. Riscaldare i campioni sul Vortex termostatato a 37 ° C per 10 min, con agitazione a 700-800 giri/min.
    5. Caricare il set di adattatori di apparecchiature automatiche disruptor tubi.
    6. Tallone battere per 1 min a 30 Hz.
    7. Smontare il set di adattatori e passare manualmente la scheda impostata con le piastre di campione dal braccio robotico di sinistra del braccio robotico destra dello strumento.
    8. Tallone battere per un altro 1 min a 30 Hz.
    9. Provette per centrifuga a 17.200 x g, per 3 min a 25 ° C.
    10. Rimuovere tutti il surnatante con una pipetta 200 µ l, facendo attenzione a non ottenere qualsiasi dello strato di grasso nella parte superiore del campione o il tallone residua nella parte inferiore del campione e si applicano a una colonna di omogeneizzatore.
    11. Colonne di omogeneizzatore centrifuga alla massima velocità, 17.200 x g per 3 min a 25 ° C.
    12. Trasferire 350 µ l di eluato microcentrifuga di un produttore di 2 mL per uso con lo strumento automatizzato per la purificazione di DNA e RNA (non usare qualsiasi altro tubo). Fare attenzione a non trasferire qualsiasi strato residuo di grasso.
    13. Se il volume di flusso continuo è a meno di 350 µ l, aggiungere tampone di lisi con β-ME ad un volume finale di 350 µ l.
    14. I campioni di lasciare RT per fino a 2 h prima di procedere all'isolamento dell'acido nucleico utilizzando lo strumento di purificazione automatizzato del DNA, o congelare a-80 ° C.
  5. Area di lavoro di pulizia
    1. Pulire tutte le superfici in utilizzano con una soluzione di decontaminazione non enzimatici, lasciano per 10 min, poi spruzzare con etanolo al 70% e pulire la superficie.

2. isolare il DNA/RNA

  1. Preparazione dell'area di lavoro
    1. Attivare il blocco di calore e regolare la temperatura di 70 ° C.
    2. Accendere il Vortex a temperatura controllata e impostare la temperatura a 37 ° C.
    3. Scaldare il buffer di eluizione (EB) contenente 10 mM Tris-Cl, pH 8.5, in un tubo da 50 mL a 70 ° C.
    4. Scaldare 350 µ l di campione congelato lisati in provette da 2 mL a 37 ° C fino a quando completamente scongelato senza alcun precipitato (circa 10 min).
  2. Purificazione del DNA
    1. Vortex e centrifugare le provette 2 mL con campione brevemente (3000 x g per 10 s).
    2. Inserire 2 mL provette nello shaker seguendo il grafico del carico di strumento automatizzato per la purificazione del DNA/RNA, secondo le istruzioni del produttore.
    3. Ottenere i rotore adattatori e impostarle sul vassoio in base al numero di campioni.
    4. Etichettare ogni adattatore rotore basata sull'identificazione del campione (ID).
    5. Tagliare i coperchi e lisciare i bordi delle colonne singole spin per DNA e RNA.
    6. Inserire la colonna di spin di DNA senza il tubo di raccolta nell'adattatore del rotore. Gettare la provetta di raccolta.
    7. Etichetta 1,5 mL provette per la raccolta e inserire gli adattatori del rotore.
    8. Set adattatori per rotore nella centrifuga seguendo il grafico carico di strumento automatizzato per la purificazione del DNA/RNA.
    9. Inserire 1.000 µ l-puntali del produttore con filtro in rack di punta.
    10. Aggiungere acqua RNAsi-libera al tubo del microcentrifuge del costruttore 2 mL dipenda dal numero di campioni (per istruzioni di macchina specifico protocollo).
    11. Inserire il tubo nella fessura del tubo "A" di slot di tubo del microcentrifuge.
    12. Scartare qualsiasi reagente che è rimasto in flaconi di reagente e riempire con un volume minimo di 10 mL.
    13. Il portabottiglie di reagente (tranne bottiglia EB), inserire i flaconi dei reagenti.
    14. Aggiungere EB caldo da un tubo da 50 mL per la posizione di bottiglia del Reagente 6.
    15. Verifica provette da 1,5 mL sono collocate strettamente negli adattatori del rotore.
    16. Chiudere il coperchio dello strumento e selezionare: "RNA" → "estrazione kit" → "Animale, tessuti e cellule" → "del kit nome 350 µ l parte A Custom DNA" → modificare Volume di eluizione per 100 µ l (impostazione predefinita) o 50 µ l per biomassa basso campioni → "Start".
    17. Al termine, rimuovere gli adattatori rotore fuori la centrifuga e metterli sul vassoio.
    18. Scartare la colonna di spin di DNA dalla posizione del rotore adattatore 3.
    19. Non gettare gli adattatori del rotore, il RNA è in posizione 2.
    20. Rimuovere i tubi di raccolta 1,5 mL contenente DNA eluito nella posizione 3 e memorizzare in − 20 ° C.
    21. Raccogliere campione contenente tubi da shaker e negozio a − 20 ° C, se qualsiasi campione è lasciato sopra, altrimenti scartare.
    22. Continuare con il protocollo "del kit nome 350 µ l parte B RNA" per ulteriore purificazione del RNA.
    23. Purificazione RNA sarà fatto dai circa 350 µ l flusso continuo che è in posizione centrale di adattatori del rotore.
  3. Purificazione di RNA
    1. Inserire la colonna di spin di RNA privo di coperchio e tubo di raccolta nell'adattatore del rotore.
    2. Etichetta del nuovo 1,5 mL provette per la raccolta e inserirli nell'adattatore del rotore, come indicato nel manuale.
    3. Impostare gli adattatori del rotore nella centrifuga seguendo il grafico carico di strumento automatizzato per la purificazione del DNA/RNA.
    4. Chiudere il coperchio dello strumento e selezionare: "RNA" → "Kit del produttore" → "Animale, tessuti e cellule" → "Standard parte B RNA" → "Start".
    5. Al termine, rimuovere gli adattatori rotore fuori la centrifuga e metterli sul vassoio.
    6. Scartare la colonna spin RNA dalla posizione 3.
    7. Provette da 1,5 mL contenente 30 µ l eluiti RNA alla posizione 3 di rimuovere e conservare a − 80 ° C.
    8. Rimuovere i flaconi dei reagenti.
    9. Smaltire i contenuti di adattatore di rotore attraverso i canali appropriati rifiuti pericolosi.
  4. Postazione di lavoro pulita
    1. Spray accessori tutti automatizzato del DNA/RNA purificazione dello strumento, quali cremagliere del reagente, vassoio e qualsiasi altra superficie in uso con una soluzione di decontaminazione non enzimatici, lasciano per 10 min e risciacquare con acqua deionizzata (DI), poi lasciarli asciugare.
    2. Spruzzo strumento automatizzato con solo produttore approvato soluzione di decontaminazione non enzimatici, pulire l'interno della centrifuga insieme a tutte le superfici in uso, lasciare per 10 min e poi pulire con etanolo al 70%. Non utilizzare altri tipi di soluzioni di decontaminazione, poichè possono danneggiare lo strumento.

3. mirati 16S PCR set-up

Nota: Il set-up per la PCR 16S avviene in un'area di lavoro pre-amplificazione designato che si trova all'interno della camera bianca. I reagenti ed i campioni sono preparati e quindi caricati su un gestore liquido per eseguire la PCR per ciascun campione in triplice copia (30 campioni, sono veri campioni e controlli positivi e negativi di estrazione, più 2 PCR acqua controlli in triplice copia, per un totale di 96 combinato di campioni e controlli). Una volta che le reazioni di PCR sono assemblate e sigillate, piatto del campione viene trasferito un termociclatore situato in una zona di post-amplificazione per il ciclismo.

  1. Preparazione dell'area di lavoro
    1. Pulire la workstation PCR. Spruzzo che tutte le superfici in uso con un DNA di RNasi, DNasi, decontaminante, seguita da acqua DI due volte, e, infine, etanolo al 70%.
    2. Preparare il foglio di lavoro di PCR 16S (vedere il foglio di lavoro di Targeted 16S PCR) con un elenco di esempi precisi e primer con codici a barre diversi assegna a ciascun campione9. Stampare il foglio di lavoro e le mappe di piastra (Vedi Tavola 1).
  2. Preparazione della master mix PCR
    Nota: selezione dell'iniettore 16S si basa sulla regione di interesse per lo studio particolare e può cambiare dal tipo studio o campione. Pertanto, prima di ordinare il primer, è importante confermare quale area del rRNA 16S migliori amplifica i microbi di interesse per lo studio particolare. Questo protocollo come scritto è per l'amplificazione della regione 16S V4. Se vengono selezionata diversa primer/regione, quindi la temperatura di annealing nel ciclismo termica potrebbe richiedere la modifica.
    1. Lavorare nella workstation PCR per preparare tutto.
    2. Prendere 50-100 µ l di campioni di DNA da-20 ° C e tutti i reagenti necessari e li scongelare su ghiaccio. Vortice e brevemente rotazione verso il basso.
    3. I primers sono pre-diluiti alla concentrazione di lavoro di 5 µM in un volume minimo di 20 µ l.
    4. Preparare il mix master di PCR nel tubo 5ml specifici con solo il primer in avanti secondo il calcolo del foglio di lavoro.
  3. Preparando il manipolatore robotizzato liquido per l'installazione automatica di PCR
    1. Per i campioni, prendere fuori adattatore campione di uno strumento di 32-pozzo e caricare 50-100 µ l di campioni di DNA secondo la mappa di piastra a 96 pozzetti secondo le istruzioni del produttore.
      1. Per ogni piatto PCR, impostare 2 controlli negativi inserendo 30 µ l di acqua PCR in una provetta pulita.
      2. Posto tutti i campioni su adattatore campione dello strumento 32-pozzo con tappi bloccati in posizione aperta.
    2. Per iniettori d'inversione9
      1. Rimuovere il tappo di ogni primer reverse con codice a barre specifico # s uno alla volta (cambiare i guanti in mezzo per evitare la contaminazione incrociata).
      2. Inserire un massimo di 32 primer sull'adattatore Reagente dello strumento.
    3. Prendete una piastra PCR a 96 pozzetti ed etichettarlo con Studio nome, numero di campioni, data e le iniziali del tecnico.
    4. Il gestore di liquido robotico di caricamento
      1. Posizionare l'adattatore reagente B1. Al fine di evitare un effetto contorno, posizionare un bordo dell'adattatore contro il lato di presa e portare lentamente l'altro bordo. Assicurarsi di inserire tutti gli angoli di adattatori.
      2. Inserire l'adattatore di campione in posizione C1. Assicurarsi di inserire tutti gli angoli di adattatori.
      3. Vortice il mix master 5 mL, aprire il tappo e inserirlo nella posizione al blocco dello strumento matrice mix e reagente.
      4. Posizionare la piastra PCR su adattatore 96 pozzetti dello strumento che è destinato a contenere metà costeggiava piastre PCR.
      5. Avviare l'esecuzione e salvare come nuovo file.
      6. Seguire le istruzioni e spunta ogni prompt: uno, i consigli sono disponibili, due, scatola degli scarti è disponibile, e tre, iniziare.
    5. Dopo che viene completata l'esecuzione, verificare che non siano presenti errori controllando la macchina per i messaggi di errore.
    6. Sigillare la piastra con i 12 o strip 8 tappi, vortice vigorosamente e spin giù per 1 min utilizzando un filatore piastra a 96 pozzetti e posizionarlo sul ghiaccio o in frigorifero.
    7. Rimuovere le provette contenenti i campioni e iniettori d'inversione.
    8. Prendere la piastra a 96 pozzetti per la camera di post-amplificazione e caricare la piastra sul termociclatore e ciclo in base alla tabella delle condizioni termiche-ciclismo (Vedi tabella 1).

4. controllo di qualità Post-PCR 16S mirate utilizzando la piattaforma basata su nastro per elettroforesi del Gel

Nota: Post-PCR (controllo qualità) e tutti i passaggi successivi vengono eseguiti in una determinata area di post-amplificazione del laboratorio. Il DNA viene analizzato in un analizzatore automatico del frammento del DNA/RNA.

  1. Preparazione dell'area di lavoro
    1. Pulire la workstation spruzzando che decontaminante tutte le superfici in uso con RNAsi, DNasi, DNA, seguita da acqua DI due volte, e, infine, etanolo al 70%.
    2. Raccogliere tutte le forniture e le attrezzature necessarie.
  2. Preparare i reagenti
    1. Tampone del campione posto e scaletta nel Vortex a temperatura controllata a 25 ° C per un minimo di 30 min.
  3. Mentre i reagenti si scaldano, preparazione di campioni PCR mettendo in comune i 3 repliche PCR per ogni campione in un singolo tubo
  4. Caricare i campioni sullo strumento.
  5. Brevemente vortex e centrifugare tubi con pool prodotto di PCR.
  6. Posizionare la piastra a 96 pozzetti dello strumento su una cremagliera a RT ed etichettarlo.
  7. Brevemente vortice e spin giù il buffer del campione e la scaletta.
  8. Aggiungere 3 µ l di tampone di campione in ciascun pozzetto della piastra ben 96 (necessità almeno 53 µ l/schermo nastro).
  9. Eseguire un numero pari di campioni; Se c'è un numero dispari di campioni, è possibile aggiungere 4 µ l di sample buffer in un pozzetto vuoto.
  10. Aggiungere 1 µ l di scaletta per una scaletta ben.
  11. Seguendo la mappa, aggiungere 1 µ l di prodotto PCR riunita al suo designato bene.
  12. Piastra di copertura con sigillo
  13. Vortice la piastra utilizzando lo strumento Vortex e adattatore a 2.000 giri/min per 1 min.
  14. Girare fino a posizione l'esempio nella parte inferiore del tubo, se ci sono bolle spin giù di nuovo.
  15. Avviare il software.
  16. Caricare la schermata di caricamento e nastro suggerimenti nello strumento.
  17. Caricare i campioni nell'analizzatore frammento con un adattatore di 96 pozzetti.
  18. Impostare una corsa con il software del controller.
  19. Assicurarsi di selezionare anche numerati pozzi.
  20. Scrivere ID campione.
  21. Verifica che tutti i pozzi del nastro schermo sono evidenziati in grigio.
  22. Assicurarsi che l'analizzatore riconosce tutte le punte di pipetta.
  23. Selezionare avvia e specificare un nome file per salvare i risultati (Studio nome, numero del campione e data).
  24. Riferimento alle istruzioni del produttore per maggiori dettagli.
  25. Dopo che viene completata l'esecuzione, scartare punta, nastro schermo e tubi.
  26. Analizzare i dati per nM picco 16S (tra 315-450 bp per V4). Questo picco variano a seconda i primers selezionati.

5. Biblioteca calcolo, pool, Clean-up e QC

  1. Dopo aver determinato la dimensione amplicone e molarità di tutti i campioni, le librerie per raggiungere il volume desiderato finale e nM per la libreria di pool della piscina (Vedi esempio di calcolo).
  2. Clean-up e concentrato la libreria pool utilizzando una purificazione basati su silice-membrana kit per i prodotti PCR, secondo il produttore di protocollo (Vedi Tabella materiali).
    1. Eluire il DNA con un volume finale di 50 µ l.
  3. Misurare la concentrazione della biblioteca pulita immediatamente utilizzando un kit di alta sensibilità DNA incagliato doppio per un fluorimetro, secondo il protocollo del produttore.
    1. Diluire 2 µ l della biblioteca in pool e pulita con 198 µ l di tampone di diluizione plus tintura (diluizione 1: 100).
    2. Registrare il valore misurato dal dispositivo fluorometrica e convertirlo secondo il fattore di diluizione.
  4. Usando la concentrazione (ng / µ l) di lettura per la libreria di pool, calcolare la molarità di biblioteca in nM. Utilizzare 1 µ l non diluito libreria per misurare la OD260/280 su uno spettrofotometro di microvolume.
    Nota: Un valore di 1.8-2.0 indica purezza adeguata della biblioteca.
  5. Archiviare la libreria finale a-20 ° C fino al momento per il sequenziamento di nuova generazione.

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Representative Results

Il protocollo presentato qui include passaggi importante controllo qualità (QC) per assicurarsi che il soddisfare di dati generati i valori di riferimento per il controllo di sensibilità, specificità e contaminazione di protocollo. Primo passo QC del protocollo segue l'amplificazione di PCR della regione 16S V4 (Figura 2). Un µ l del prodotto PCR di ogni campione è stato analizzato tramite l'elettroforesi per confermare che era all'interno della gamma di dimensione prevista di 315-450 bp (Figura 2, freccia rossa). Alcuni campioni di latte umano generato minori quantità di prodotto specifico (Figura 2A, corsie di confrontare 3 e 9-11 con corsie 4-8), suggerendo o bassi livelli di estratti DNA microbico in quei campioni, o riporto di inibitori della PCR durante l'estrazione. Per i campioni che producono meno di 2.0 nM di prodotto della gamma di bp 315-450 (Figura 2A, corsia 7), pulizia di inibitore PCR è effettuata utilizzando un kit singolo passaggio e il campione è ri-amplificato. Tassi di successo per il recupero dell'amplificazione del campione dopo la pulitura è circa il 40%. Quantificazione del prodotto specifico per ogni campione (Figura 2B) è essenziale per determinare il volume richiesto per il pool di molare uguale di campioni per il sequenziamento. Una libreria in pool per il sequenziamento mirato è solitamente dominata da uno specifico prodotto PCR (Figura 3). Se c'è una notevole quantità di prodotto non specifici nella libreria, un passaggio di purificazione del gel dovrebbe aggiungersi al flusso di lavoro.

Nell'esempio presentato in Figura 2A, fasce deboli sono osservati per i controlli tampone (BC; corsie 2 e 12) e la PCR dell'acqua di controllo negativo (PC; corsia 1), che indica la possibile contaminazione ambientale o reagente. Tali bande non sono rare e rappresentano in genere basse quantità di prodotto di PCR (cioè, < 1 nM) e produrre qualche lettura conta durante la sequenziazione (< 1.000). Risultati rappresentativi sequenziamento (Figura 4) confermano che questi campioni hanno davvero molto basso sequenziamento leggere conteggi (Figura 4A, corsie 1 e 11; Figura 4B, Buffer e PCR acqua corsie) e, soprattutto, la composizione di taxa per i campioni di controllo è distinta dai campioni di latte umano (Figura 4A; confronta corsie 1 e 11 con corsie 2-10). Lettura alta conta in controlli negativi, insieme a sovrapposizione significativa nella composizione di taxa tra controlli e campioni, suggerisce la contaminazione incrociata e la necessità per il controllo della contaminazione migliorata.

Risultati di sequenziamento (Figura 4) dimostrano elevata diversità nei taxa associato il microbioma umano latte e variabilità del numero di sequenziamento leggere conteggi per ogni campione (Figura 4A, corsie 2-10). Al contrario, i risultati di sequenziamento per il finto batterico che è stato elaborato insieme ai campioni di latte umano dimostrato composizione taxa e leggere i conteggi che erano paragonabili ai risultati ottenuti per la simulazione in precedenti esecuzioni di flusso di lavoro (confrontare Figura 4A , lane 12 con Figura 4B, finte corsie). I risultati coerenti per le corsie finte suggeriscono che la variabilità osservata per i campioni di latte umano è un autentico risultato sperimentale e non è una funzione della variabilità intrinseca del flusso di lavoro.

Figure 1
Figura 1: diagramma di flusso della Pipeline di sequenziamento del 16S Targeted. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: analisi di controllo di qualità degli ampliconi V4 16S. (A) immagine di Gel di 16S V4 ampliconi risolta tramite l'elettroforesi utilizzando un analizzatore automatico del frammento del DNA/RNA. 16s V4 ampliconi sono stati generati secondo Caporaso et al. 9e un µ l di ciascun prodotto PCR è stato analizzato usando alta sensibilità DNA reagenti secondo le linee guida del produttore. Campioni di latte più umano (corsie 3-6 e 8-11) e il mock batterico (vicolo 13) prodotto un prodotto primario di PCR la dimensione prevista di circa 400 bp (freccia rossa). Il campione di latte umano in corsia 7 non è riuscito a produrre una notevole quantità di prodotto specifico e fu oggetto di pulitura e ri-amplificazione. Minima di prodotto è stata rilevata per il controllo negativo di PCR (PC, lane 1), e controlli negativi buffer di lisi (BC, corsie 2 e 12) indicato minima contaminazione presente nei campioni analizzati. MW, marcatori di peso molecolare: superiore rosso e inferiore verde bar identificare i 1.500 bp e 25 bp dimensione marcatori, rispettivamente, in ogni corsia. (B) Top elettroferogramma di lane 3 dal gel in (A). Il prodotto PCR primario cade all'interno della regione di picco definita dalle barre verticali rosse e comprende frammenti che variano nel formato da 299-497 bp risultante in una dimensione media di prodotto PCR di 396 BP. Gating è fatto su una gamma leggermente più ampio rispetto alla dimensione amplicone previsto (i n questo caso 315-450 bp) per essere sicuri di includere il picco dell'intero campione. Le cime superiori e inferiori correlano con le dimensioni del frammento di 25 bp e 1.500 bp, rispettivamente. Inferiore: grafico che riassume i parametri di dimensione per la regione di picco, la concentrazione in ng / µ l del prodotto della PCR all'interno della regione di picco e la molarità in nM per il prodotto PCR specifico. Queste informazioni vengono poi utilizzate per calcolare quanto di ogni campione verrà essere riuniti in una libreria di molare uguale per il sequenziamento (Vedi esempio di calcolo). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: elettroferogramma di una libreria di sequenziamento in pool e concentrato. Uguali quantità molare di singoli campioni da sequenziare sono stati combinati in una libreria in pool. La biblioteca era poi pulita e concentrata in un volume totale di 50 µ l utilizzando una PCR basati su silice-membrana ripulire kit. Preparazione finale della libreria per il sequenziamento del sequenziatore di generazione successiva è stata condotta secondo il protocollo del produttore. Questa libreria è stata sequenziata con successo nonostante la presenza di bande supplementari. Se c'è una preoccupazione per i prodotti di PCR compreso nell'intervallo di dimensione prevista, il protocollo del produttore suggerisce l'aggiunta di una fase di selezione dimensione gel. Questo passaggio QC non viene solitamente eseguita. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: valutazione dei controlli positivi e negativi. (A) abbondanze Relative di taxa batterica di un lotto di estrazione con controlli e campioni di latte umano. Come misura di QC, composizioni di ogni lotto di estrazione come caricato sullo strumento di purificazione di DNA/RNA automatizzato vengono generati immediatamente dopo una corsa di sequenziamento. I numeri sotto ogni barra di campione indicano il numero di letture filtrate per il rispettivo campione. Le composizioni dei controlli tampone sono distinte da quello dei campioni di latte umano. (B) abbondanze Relative di taxa batterici in buffer, derisione e controlli PCR. Numero di letture e composizione è valutato per tutti negativo (buffer e acqua PCR) e i controlli positivo (batterico finto). Le composizioni del buffer e acqua variano, ma la comunità finta rimane abbastanza stabile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Mirato nuova generazione sequenziamento del 16S rRNA è una tecnica ampiamente usata, rapid per microbiome caratterizzazione18. Tuttavia, molti fattori, tra cui effetti di batch, contaminazione ambientale, cross-contaminazione del campione, sensibilità e riproducibilità negativamente possono influenzare i risultati sperimentali e confondere loro interpretazione7,19 , 20. per meglio facilitare 16S robusta analisi, microbiome i flussi di lavoro devono essere muniti di buon disegno sperimentale, l'uso di adeguati controlli, la segregazione spaziale dei passaggi del flusso di lavoro e l'applicazione delle migliori pratiche. Il protocollo descritto qui incorpora ciascuno di questi parametri e fornisce importanti strumenti sperimentali per affrontare le sfide di cui sopra e implementare un flusso di lavoro 16S per diversi campioni.

Buon disegno sperimentale è critica per analisi microbiome 16S. Questo include la corretta raccolta e conservazione dei campioni, nonché la selezione di 16S primer appropriato per la regione di interesse. Ad esempio, l'area di V4 (515F/806R) è selezionata per il latte umano perché ha buona amplificazione di Bifidobacterium, che svolge un ruolo importante nello sviluppo del microbioma intestinale neonatale21. Altri set di primer (ad es., 27F/338R, 515F/926R) potrebbe essere più appropriato per gli studi di altre comunità microbica. Una nota importante è che la temperatura per il 16S mirati di ricottura PCR e la dimensione amplicone previsto varia in base alla selezione dell'iniettore.

Altri posti che può essere modificato il protocollo si basano sui risultati dei passaggi QC incorporati del flusso di lavoro. Alcune opzioni esistono per risolvere i problemi quando non o poco DNA viene rilevato dopo la fase di amplificazione di PCR 16S mirati. 1) il campione può essere messo attraverso una fase di rimozione dell'inibitore PCR. Amplificazione seguente rimozione di inibitore PCR utilizzando un kit unico passaggio eseguita secondo il protocollo del produttore ha esito positivo circa il quaranta per cento del tempo, 2) più estratti DNA può essere aggiunto a 16S mirati PCR, o 3) una nuova e potenzialmente più grande aliquota di latte possa essere trattato se disponibile. Se c'è una preoccupazione per i prodotti di PCR compreso nell'intervallo di dimensione prevista dopo la purificazione basati su silice-membrana della biblioteca, una fase di purificazione del gel può essere aggiunto. Infine, i passaggi QC sono fondamentali per determinare se vi è evidenza di contaminazione, che è discussa dettagliatamente qui sotto. Se viene rilevata una contaminazione significativa, quindi a seconda di dove la contaminazione è stato introdotto, sia la PCR può essere ripetuta o se necessario, il campione può essere ri-Estratto. Fortunatamente, con buone pratiche di laboratorio, questi sono eventi rari. Infine, mentre il presente protocollo è scritta per evidenziare avvertimenti nell'amplificazione dei campioni di biomassa bassa e in particolare il latte umano, il protocollo può essere facilmente modificato per l'amplificazione di tamponi orali, rettali, vaginali e pelle o spugne così come sgabello. Se vengono scelti altri tipi di campioni, quindi in considerazione a cui sono ottimali per il tipo di campionamento specifici kit di estrazione.

Effetti di batch a causa di kit, reagenti o sequenziamento corre sono importanti fonti di variabilità nel microbiome studi. Kit di estrazione del DNA, insieme ad altri reagenti, possiedono bassi livelli di DNA batterico, che possono variare notevolmente da sacco20,22,23,24. Per un progetto di grandi dimensioni, utilizzando un singolo lotto di kit di reagenti, selezionando kit progettato per minimizzare la contaminazione di kit può semplificare analisi7. Campioni di soggetti sia controlli vengono elaborati fianco a fianco. È meglio se tutti i campioni per un singolo studio, entrambi soggetti e di controllo, può essere incorporato in una singola sequenza eseguita. Se un gran numero di campioni devono essere elaborati in batch, campioni rappresentativi di soggetti sia controlli inclusi in ogni batch ed elaborati insieme. È anche importante organizzare elaborazione batch per ridurre al minimo la contaminazione dei campioni di basso-biomassa (cioè, latte materno) di campioni che sono alta biomassa (cioè, sgabello). In tali casi, elaborare biomassa basso campione tipi prima e quindi alta biomassa campioni per lo studio stesso.

Campioni di biomassa bassa pongono sfide uniche agli studi microbiome, come la contaminazione dall'ambiente, reagenti, strumenti, e il ricercatore può rendere difficile distinguere tra membri di autentica comunità presenti in abbondanza bassa7 , 25 , 26 e quelli che vengono introdotti artificialmente per il campione attraverso il processo sperimentale19. Il flusso di lavoro descritto qui incorpora controlli negativi sperimentali importanti sia il passaggio di preparazione del campione (controllo solo buffer di lisi), e il passo PCR (controllo acqua PCR) (vedere Figura 4). Questi controlli aiutano a identificare le fonti di contaminazione e facilitare efficaci misure correttive sulla panca o in silico27,28,29,30. Controlli negativi sono attentamente valutati e segnalati con i risultati di Studio7.

Per minimizzare la contaminazione, segregazione spaziale delle attività sperimentali in un area di amplificazione pulita pre-PCR e la zona di post-amplificazione è importante. In modo ottimale, la camera pulita ha sia un'area per PCR mix master preparazione e una preparazione/aggiunta di campione di master mix di zona e può incorporare un separato dead air box o un armadio di sicurezza biologica alloggiamento dedicati consumabili e piccole attrezzature necessari per la preparazione di mix master. Il design della camera pulita incorpora un sistema di flusso d'aria positivo con filtrazione del particolato aria (HEPA) ad alta efficienza. Uso di dispositivi di protezione individuale è essenziale per mantenere un ambiente controllato e basso-microbica e include le retine per capelli, camici da laboratorio, guanti, e copriscarpe. Kit/reagenti e campioni idealmente sono memorizzati in congelatori dedicati separati. Installazione di PCR avviene anche nella camera pulita in postazioni di lavoro designati; netta separazione degli stock di primer e reagenti da DNA estratto viene mantenuta fino a quando i campioni vengono caricati sulla piattaforma pipettaggio automatizzata. Una volta completato un programma di installazione di PCR, la piastra è trasferita alla zona di post-amplificazione e caricata su un termociclatore.

È importante limitare il flusso di lavoro attività da aree pulite alle zone di post-amplificazione; non c'è nessun movimento retrogrado di reagenti, strumenti o forniture dalle zone di post-amplificazione per l'area pulita. Personale che sono entrati in uno dei settori di post-amplificazione sono impedito di entrata alla zona pulita per 24 ore (fino al giorno successivo). Oltre a queste considerazioni del flusso di lavoro, protocolli di pulizia deve essere implementato nelle aree pulite e post-amplificazione per minimizzare la contaminazione dell'acido nucleico di superfici di lavoro e strumentazione. Se le barriere fisiche o stanze separate non sono possibili, è necessario adottare tutti gli sforzi per impostare il lavoro nelle aree più lontano possibile.

Oltre alla contaminazione, microbiome studi sono sfidati da sensibilità, variabilità e riproducibilità31. Questo protocollo indirizzi questi problemi incorporando una definita comunità batterica finta che viene estratto, amplificato ed ordinato insieme a ciascun lotto di campioni (Vedi Figura 4b). Questo controllo fornisce un costante riferimento interno che valuta la riproducibilità dei risultati sperimentali generati e può essere utilizzato per risolvere i problemi che si presentano. Ad esempio, la qualità del DNA Estratto finto può fornire una metrica per lisi effettiva del campione ed estrazione del DNA, quali controlli di DNA genomici non perdere. Controllo di qualità degli ampliconi PCR per il finto campione può anche indicare la specificità ed efficienza PCR. Inoltre, poiché la simulazione comprende più tipi di batteri, la sensibilità relativa per un batch elaborato dei campioni possa essere dedotte mediante la rappresentazione di taxa nei risultati di sequenziamento per il finto campione. Un ideale comunitario finto valuterà la capacità di rilevare le principali specie batteriche nel vano analizzato, e quindi la composizione della Comunità finta potrebbe essere necessario variare da studio. Come mostrato in Figura 4a, c'è una considerevole variabilità tra i risultati del sequenziamento del campione, ma i risultati di sequenza per la comunità batterica finto è altamente riproducibili (Vedi Figura 4b).

Mentre la comunità finta nella Figura 4 è una miscela unica di 33 ceppi da una combinazione di isolati clinici disponibili in commercio e locale, una comunità di finta disponibile in commercio è stato recentemente sviluppato32.

Sebbene il flusso di lavoro descritto qui è limitato nella sua capacità di riproducibilità di indirizzo largamente attraverso gli studi differenti microbiome, fornisce un importante approccio sperimentale che permette ai ricercatori di incorporare appropriato sperimentale controlli e riproducibilità di monitor all'interno i propri risultati.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare Helty Adisetiyo, PhD e Shangxin Yang, dottorato di ricerca per lo sviluppo del protocollo. Supporto globale per l'International materno pediatrica adolescenziale AIDS clinico prove gruppo (IMPAACT) è stato fornito dal National Institute of Allergy e Infectious Diseases (NIAID) dei National Institutes of Health (NIH) sotto numeri del premio UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) e UM1AI106716 (LC IMPAACT), con il co-finanziamento il Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) e l'Istituto nazionale di salute mentale (NIMH). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AllPrep RNA/DNA Mini Kit Qiagen 80204 DNA/RNA extraction kit
Eliminase Fisher Scientific 435532 RNase, DNase, DNA decontaminant
Thermo Mixer Fisher Scientific temperature-controlled vortexer
Buffer RLT plus Qiagen 1053393 guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689-25ML-F ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME Beads MP Biomedicals 116914050 bead tube
QIAgen TissueLyzer Qiagen 85300 automated sample disruptor adapter set
QIAshredder column Qiagen 79654
QIAgen RB tube manufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticware Qiagen 9001292 automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plus Applichem A7089 non-enzymatic decontamination solution
EB Buffer Qiagen 19086 elution buffer
QIAgility and related plasticware Qiagen 9001532 robotic liquid handler
PCR water MO BIO 17000-
5PRIME HotMasterMix Quantabio 2200400
Barcoded reverse primers Eurofin No Catalog #'s designed and ordered
96 well PCR plate USA scientific 1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticware Agilent G2964AA automated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation Agilent 5067-5585 Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit Zymo Research 50444470 PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32854 dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216
NanoDrop Thermo Fisher microvolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kit Illumina 15033624/15033626
MiSeq Illumina No Catalog #'s next generation sequencer

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References

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Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih, S., Lee, D. J., Li, F., Aldrovandi, G. M. A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples. J. Vis. Exp. (133), e56974, doi:10.3791/56974 (2018).

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