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Immunology and Infection

Un método de secuenciación de 16S específica de las muestras de leche humana

Published: March 23, 2018 doi: 10.3791/56974
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, University of California at Los Angeles

Summary

Se presenta un flujo de trabajo semi-automático para específica secuenciación de 16S rRNA de la leche humana y otros tipos de biomasa, bajo muestra.

Abstract

Estudios de comunidades microbianas se han generalizado con el desarrollo de la secuencia relativamente barato, rápido y alto rendimiento. Sin embargo, al igual que con todas estas tecnologías, la reproducibilidad depende de un flujo de trabajo de laboratorio que incorpora controles y precauciones apropiadas. Esto es particularmente importante con las muestras de baja biomasa donde contaminantes ADN bacteriano pueden generar resultados engañosos. Este artículo detalla un flujo de trabajo semi automatizado para identificar microbios de las muestras de leche materna humana utilizando secuenciación específica de la región de V4 de ARN ribosómico (ARNr) 16S en una escala de bajo a medio throughput. El protocolo describe la preparación de las muestras de leche entera, incluyendo: lisis, extracción de ácidos nucleicos, la amplificación de la región V4 del gene del rRNA 16S y preparación de la biblioteca con las medidas de control de calidad de la muestra. Lo importante, el protocolo y la discusión consideran cuestiones que son salientes a la preparación y análisis de muestras de baja biomasa incluyendo controles positivos y negativos adecuados, eliminación de inhibidor de la polimerización en cadena, contaminación de las muestras ambiental, reactivo, o fuentes experimentales y experimentales mejores prácticas destinadas a garantizar la reproducibilidad. Mientras que el protocolo como se describe es específico para las muestras de leche humana, es adaptable a numerosos tipos de muestras de biomasa de baja y alta, incluyendo las muestras recogidas en torundas, congelados aseado o estabilizado en un buffer de conservación.

Introduction

Las comunidades microbianas que colonizan seres humanos se creen que son críticamente importantes para la salud y la enfermedad que influyen en el metabolismo, desarrollo inmune, susceptibilidad a la enfermedad y las respuestas a la vacunación y medicamentos terapia1, 2. esfuerzos para comprender la influencia de la microbiota en la salud humana en la actualidad destacan la identificación de los microbios asociados con compartimentos anatómicos definidos (es decir, piel, intestinal, oral, etc.), así como de sitios localizados dentro de Estos compartimentos3,4. Estos esfuerzos de investigación que se basa es la rápida aparición y mayor accesibilidad de tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) que proporcionan una plataforma masiva y en paralelo para el análisis del contenido genético microbiano (microbioma) de una muestra. Para muchos las muestras fisiológicas, el microbioma asociado es complejo y abundante (es decir, heces), pero, para algunas muestras, el microbioma está representada por la baja biomasa microbiana (es decir, leche humana, tracto respiratorio inferior) donde sensibilidad, artefactos experimentales y posible contaminación se convierten en cuestiones importantes. Los desafíos comunes de microbioma estudios y el diseño experimental apropiado han sido objeto de varios artículos de revisión5,6,de7,8.

Presentados en este documento es una tubería experimental robusta de NGS en base específica secuenciación del rRNA 16S V4 región9 para caracterizar el microbioma de la leche humana. Análisis de microbioma de la leche humana son complicado no sólo por una de biomasa microbiana inherentemente baja10, pero además por altos niveles de ADN humano fondo11,12,13,14 y potencial remanente de PCR inhibidores15,16 en ácido nucleico extraído. Este protocolo se basa en kits de extracción disponibles en el mercado y plataformas semi-automatizadas que pueden ayudar a minimizar la variabilidad entre lotes de preparación de muestra. Incorpora una comunidad simulada bacteriana bien definida que es procesada junto a las muestras como un control de calidad para validar cada paso en el protocolo y proporcionar una métrica independiente de robustez de la tubería. Aunque el protocolo como se describe es específico para las muestras de leche humana, es fácilmente adaptable a otros tipos de muestras como heces, rectal, vaginal, piel, frotis oral y areolar10,17y puede servir como punto de partida para investigadores que deseen realizar análisis de microbioma.

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Protocol

Para todos los pasos de protocolo, debe llevarse equipo de protección personal apropiado (PPE) y estrategias de prevención de contaminación estrictas deben tomarse. Observar el flujo de trabajo de pre-amplificación áreas para las áreas de trabajo de la amplificación para minimizar la contaminación de las muestras de trabajo. Todos los materiales utilizados son estériles, libres de Rnasa, DNasa, ADN y pirógenos. Se filtran todas las puntas de pipeta. Un diagrama de flujo de los pasos del Protocolo se proporciona (figura 1).

1. lisis de la muestra

Nota: Lisis de la muestra y la extracción de ácidos nucleicos se realizan utilizando un kit de extracción de ADN/ARN en un ambiente de sala limpia donde son controles de ingeniería y procedimientos para minimizar la introducción de bacterias ambientales a las muestras.

  1. Preparación del área de trabajo
    1. Limpia el área con limpiador apropiado para eliminar cualquier contaminación del ácido nucleic de trabajo el gabinete de seguridad biológica (BSC).
    2. Encienda el Vortex control de temperatura y establecer a 37 ° C.
  2. Preparar el tampón de lisis de tiocianato de guanidinio (véase tabla de materiales)
    1. Comprobar el búfer de lisis para precipitados. Volver a disolver precipitados por el calentamiento a 37 ° C.
    2. Preparar 600 μl de tampón de lisis con 6 μl de β-mercaptoetanol (β-ME) para cada muestra. Considerar un volumen adicional de 20% por muestra.
  3. Preparación de la muestra
    1. Si la leche está congelada, descongelar el hielo. Alícuota 5 mL de toda la leche en un 15-mL o en un tubo estéril de 5 mL en BSC y mantenerlo en hielo.
    2. Girar la leche 5 mL alícuota durante 10 min a 5.000 x g a 4 ° C para que sedimenten las células.
    3. Quitar la capa de grasa, ahora la capa superior del tubo, con una espátula de plástico o grandes diámetro punta de pipeta.
    4. Sin perturbar el pellet, quite todo el sobrenadante excepto 100 μl.
    5. Lavar el precipitado a resuspender en 1 mL de tampón de fosfato estéril salino (PBS).
    6. Preparar 1 control negativo añadiendo 1 mL de PBS estéril en un tubo de 5 mL.
    7. Transferir la suspensión a un tubo de centrífuga limpio de 1,5 mL y centrifugar en una microcentrífuga durante 1 minuto (5.000 x g a temperatura ambiente (RT)).
    8. Utilice una punta de pipeta estéril filtrada de 1000 μL para eliminar toda la capa sobrenadante graso.
    9. Si no extraer el mismo día, broche de presión congela la célula pellets poniendo en una mezcla de hielo seco/etanol y transferirlo inmediatamente en el congelador de-80 ° C.
  4. Alteración de la muestra y la homogeneización (grano-paliza)
    1. Añadir 600 μl de tampón de lisis que contienen β-ME a la pelotilla y transferir la suspensión a un tubo de bolas.
    2. Cada lote de extracción de 12 contiene 10 muestras y 1 control negativo (preparado en el paso 3.7 anterior) 1 control positivo (preparado en el paso siguiente).
      1. Preparar 1 control positivo con tampón de lisis y 20 μl de la muestra simulada bacteriana (la falsa comunidad utilizada tiene una concentración, una vez extraída, de aproximadamente 0,2 ng/μl de ADN).
    3. Vortex todo grano tubos vigorosamente durante 15 s.
    4. Calentar las muestras en el Vortex de temperatura controlada a 37 ° C durante 10 min, con agitación a 700-800 rpm.
    5. Cargar tubos en el conjunto de adaptadores de disruptor automatizada de la muestra.
    6. Grano de batir durante 1 min a 30 Hz.
    7. Desmontar el conjunto del adaptador y cambiar manualmente el adaptador establece con las placas de muestra de la robótica del brazo izquierda en el brazo robótico derecho del instrumento.
    8. Grano de batir durante otro 1 min a 30 Hz.
    9. Tubos de centrífuga a 17.200 x g, durante 3 min a 25 ° C.
    10. Quite todo el sobrenadante con una pipeta de 200 μL, teniendo cuidado de no conseguir cualquiera de la capa de grasa en la parte superior de la muestra o el reborde residual en la parte inferior de la muestra y se aplican a una columna de homogeneizador.
    11. Columnas de homogeneizador de centrifugar a máxima velocidad, 17.200 x g, durante 3 min a 25 ° C.
    12. Transferencia 350 μl de elución al tubo de microcentrífuga de fabricante de 2 mL para uso con el instrumento automatizado para la purificación de DNA y RNA (no use cualquier otro tubo). Tenga cuidado de no transferir cualquier capa de grasa residual.
    13. Si el volumen de flujo es inferior a 350 μl, añadir tampón de lisis con β-ME a un volumen final de 350 μl.
    14. Dejar las muestras en RT por hasta 2 h antes de proceder al aislamiento de ácidos nucleicos mediante el instrumento automatizado de purificación de ADN, o congelar a-80 ° C.
  5. Limpiar área de trabajo
    1. Limpie todas las superficies en utilizan con una solución de descontaminación no enzimática, dejan durante 10 minutos, entonces rocíe con etanol al 70% y limpie la superficie.

2. aislar el ADN/ARN

  1. Preparación del área de trabajo
    1. Activar el bloque de calor y la temperatura a 70 ° C.
    2. Encienda el Vortex control de temperatura y ajuste la temperatura a 37 ° C.
    3. Caliente el tampón de elución (EB) que contiene 10 mM Tris-Cl, pH 8,5, en un tubo de 50 mL a 70 ° C.
    4. Calentamiento de 350 μl de lisados de muestra congelada en tubos de 2 mL a 37 ° C hasta completamente descongelado sin cualquier precipitado (aproximadamente 10 min).
  2. Purificación de DNA
    1. Vortex y centrifugar los tubos de 2 mL con la muestra brevemente (3000 x g durante 10 s).
    2. Inserte los tubos de 2 mL en la coctelera siguiendo el diagrama de carga del instrumento automatizado de purificación de ADN/ARN, según instrucciones del fabricante.
    3. Conseguir los adaptadores de rotor y configurar en la bandeja de base en el número de muestras.
    4. Etiqueta cada adaptador rotor basado en la identificación de la muestra (ID).
    5. Cortó los párpados y alisa los bordes de las columnas individuales de vuelta para ADN y ARN.
    6. Inserte la columna de la vuelta de ADN sin el tubo de la colección en el adaptador de rotor. Deseche el tubo de la colección.
    7. Etiqueta 1.5 mL tubos e inserte adaptadores de rotor.
    8. Conjunto adaptadores de rotor en la centrifugadora siguiendo la tabla de carga del instrumento automatizado de purificación de ADN/ARN.
    9. Insertar 1.000 μl puntas del fabricante de filtro racks de punta.
    10. Añadir agua libre de ARNasa a tubo de microcentrífuga de fabricante 2 mL basada en el número de muestras (instrucciones de máquina específico protocolo).
    11. Inserte el tubo en la ranura del tubo "A" de las ranuras del tubo de microcentrífuga.
    12. Deseche cualquier reactivo que queda en botellas de reactivo y se llenan de un volumen mínimo de 10 mL.
    13. Introduzca botellas de reactivo en el botellero de reactivo (excepto botellas EB).
    14. Añadir tibia EB de un tubo de 50 mL a la posición de la botella de Reactivo 6.
    15. Verificar tubos de 1.5 mL se colocan firmemente en los adaptadores de rotor.
    16. Cierre la tapa del instrumento y seleccione: "RNA" → "kit de extracción" → "Animal, tejidos y células" → "del kit nombre 350 μl parte A Custom ADN" → editar el volumen de elución de 100 μl (por defecto) o 50 μL para muestras de baja biomasa → "empezar".
    17. Cuando termine, retire los adaptadores de rotor de la centrífuga y colocarlos en la bandeja.
    18. Deseche el columna de vuelta ADN de rotor adaptador posición 3.
    19. No se deshaga de adaptadores de rotor, ARN es en la posición 2.
    20. Retirar tubos de 1,5 mL conteniendo ADN eluída en la posición 3 y almacenar en −20 ° C.
    21. Recoger los tubos que contiene la muestra de la coctelera y tienda de −20 ° C, si cualquier muestra queda, descartar lo contrario.
    22. Continuar con el protocolo "del kit nombre 350 μl parte B RNA" para la posterior purificación del ARN.
    23. Purificación del ARN se realizará desde los aproximadamente 350 μl fluir-por que está en la posición media de los adaptadores de rotor.
  3. Purificación de RNA
    1. Inserte la columna de spin de RNA sin su tubo de la colección y la tapa en el adaptador de rotor.
    2. Etiqueta nueva 1.5 mL tubos e insertarlos en adaptador rotor como se indica en el manual.
    3. Configurar los adaptadores de rotor en la centrifugadora siguiendo la tabla de carga del instrumento automatizado de purificación de ADN/ARN.
    4. Cierre la tapa del instrumento y seleccione: "RNA" → "Kit del fabricante" → "Animal, tejidos y células" → "Estándar parte B ARN" → "Start."
    5. Cuando termine, quitar adaptadores de rotor de la centrífuga y colocarlos en la bandeja.
    6. Deseche el columna de RNA spin desde la posición 3.
    7. Retirar tubos de 1,5 mL conteniendo 30 μL eluyó RNA en la posición 3 y tienda a −80 ° C.
    8. Sacar botellas de reactivo.
    9. Disponer de contenidos de adaptador de rotor a través de canales apropiados de residuos peligrosos.
  4. Estación de trabajo limpia
    1. Spray de accesorios todo automatizado DNA/RNA purificación del instrumento, tales como estantes el reactivo, bandeja y cualquier otra superficie en utilizan con una solución de descontaminación no enzimática, dejan durante 10 minutos y enjuague con desionizada (DI), luego deje secar.
    2. Spray el instrumento automatizado con sólo fabricantes había aprobado solución de descontaminación no enzimáticos, para limpiar el interior de la centrífuga junto con todas las superficies de uso, dejar durante 10 minutos y luego limpiar con etanol al 70%. No utilice otros tipos de soluciones de descontaminación ya que pueden dañar el instrumento.

3. objetivo 16S PCR configuración

Nota: La configuración para la PCR 16S se lleva a cabo en un área de pre-amplificación designado situado dentro de la sala limpia. Los reactivos y las muestras son preparadas y luego cargadas en un líquido controlador para realizar la PCR para cada muestra por triplicado (30 muestras, que incluyen muestras de verdadera y controles positivos y negativos de la extracción, además de 2 controles de agua PCR por triplicado, para un total de 96 combinado de las muestras y controles). Una vez que las reacciones de PCR se ensamblan y selladas, la placa de la muestra se transfiere a un termociclador situado en una zona de la amplificación para el ciclismo.

  1. Preparación del área de trabajo
    1. Limpiar la estación de trabajo PCR. Rocíe que todas las superficies en uso con un ADN de Rnasa, DNasa, decontaminant, seguido por agua desionizada dos veces, y finalmente etanol al 70%.
    2. Preparar la hoja de trabajo de PCR 16S (ver hoja de trabajo PCR 16S de Targeted) con una lista precisa de la muestra y asignar código de barras diferentes cartillas para cada muestra9. Imprima la hoja de cálculo y los mapas de placa (ver placa de 1).
  2. Preparación del master mix PCR
    Nota: 16S primer selección se basa en la región de interés para el estudio en particular y puede cambiar de tipo de estudio o muestra. Por lo tanto, antes de ordenar cartillas, es importante confirmar qué área del rRNA 16S mejor amplifica los microbios de interés para el estudio en particular. Este protocolo como escrito es para la amplificación de la región V4 de 16S. Si se seleccionan diferentes imprimaciones o región, la temperatura de recocido en los ciclos térmicos puede requerir ajuste.
    1. Trabajo en la estación de trabajo PCR para preparar todo.
    2. Tomar 50-100 μl de muestras de ADN de-20 ° C, y todos los reactivos necesitados y descongelar el hielo. Vortex y centrifugar brevemente abajo.
    3. Los iniciadores son previamente diluidos a la concentración de trabajo de 5 μm en un mínimo volumen de 20 μl.
    4. Preparar la mezcla principal de PCR en el tubo de 5 mL específico con sólo el primer avance según el cálculo en la hoja de cálculo.
  3. Preparando el controlador robótico de líquido para configuración automatizada de la polimerización en cadena
    1. Para las muestras, sacar el adaptador de muestra del instrumento de un pozo de 32 y carga 50-100 μl de las muestras de ADN según el mapa de la placa de 96 pocillos según las instrucciones del fabricante.
      1. Para cada placa PCR, configurar 2 controles negativos colocando 30 μl de agua PCR en un tubo de muestra limpia.
      2. Colocar todas las muestras en el adaptador de muestra del instrumento de 32 bien con tapas bloqueados en posición abierta.
    2. Para imprimaciones inversa9
      1. Quite la tapa de cada cartilla reversa con código de barras específico números de uno a la vez (cambio de guantes en el medio para evitar la contaminación cruzada).
      2. Colocar un máximo de 32 iniciadores en el adaptador de reactivos del instrumento.
    3. Tomar una placa de PCR de 96 pocillos y etiqueta con nombre del estudio, número de muestra, fecha y las iniciales del técnico.
    4. Carga el controlador robótico de líquido
      1. Coloque el adaptador de reactivo B1. Para evitar un efecto de borde, con cuidado, coloque un extremo del adaptador contra el lado del asidero y bajar lentamente el otro borde. Asegúrese de que en todos los rincones de los adaptadores.
      2. Coloque el adaptador muestra en la posición C1. Asegúrese de que en todos los rincones de los adaptadores.
      3. Vórtice la mezcla principal de 5 mL, abra la tapa y colóquela en la posición A en el bloque de mezcla y reactivo principal del instrumento.
      4. Coloque la placa PCR en adaptador del instrumento 96-bien que se pretende sostener medio bordeó las placas PCR.
      5. Iniciar la carrera y guardar como un archivo nuevo.
      6. Siga las instrucciones y compruebe cada indicador: uno, consejos están disponibles, dos, caja de residuos está disponible, y tres, empezar.
    5. Una vez finalizado el plazo, verificar había no hay errores de comprobación de la máquina para mensajes de error.
    6. Sellar la placa con la 12 o tira 8 casquillos, vortex vigorosamente, desactivación durante 1 min, utilizando una ruleta de placa de 96 pocillos y coloque en hielo o en el refrigerador.
    7. Quitar los tubos que contiene cebadores inversas y muestras.
    8. Llevar la placa de 96 pocillos a la sala de la amplificación y la carga de la placa en el termociclador y el ciclo según la tabla de condiciones de ciclos térmicos (ver tabla 1).

4. objetivo de Control de calidad de Post-PCR 16S utilizando la plataforma de cinta para electroforesis en Gel de

Nota: Post-PCR control de calidad (QC) y todos los pasos posteriores se llevan a cabo en un área designada de la amplificación del laboratorio. El ADN se analiza en un analizador automatizado del fragmento de ADN/ARN.

  1. Preparación del área de trabajo
    1. Pulverizar que todas las superficies en uso con Rnasa, DNasa, DNA decontaminant, seguido por agua desionizada dos veces, y finalmente etanol al 70% para limpiar la estación de trabajo.
    2. Reúna todos los suministros y equipo necesario.
  2. Preparar los reactivos
    1. Colocar el tampón de muestra y la escala en el Vortex de temperatura controlada a 25 ° C durante un mínimo de 30 minutos.
  3. Mientras que los reactivos son calentamiento, preparar muestras PCR poniendo en común las 3 repeticiones PCR para cada muestra en un solo tubo
  4. Cargar las muestras en el instrumento.
  5. Brevemente vortex y giro de los tubos con los productos PCR.
  6. Coloque la placa de 96 pocillos del instrumento en una parrilla a temperatura ambiente y etiqueta.
  7. Brevemente vortex y vuelta por el tampón y la escala.
  8. Agregar 3 μl de tampón de muestra a cada pocillo de la placa de la pozo 96 (necesidad de al menos 53 μl/pantalla cinta).
  9. Ejecutar un número de muestras; Si hay número impar de muestras, añadir 4 μL del tampón de muestra a un pozo vacío.
  10. Añadir 1 μl de escalera a escalera bien.
  11. Siguiendo el mapa, añadir 1 μl del producto PCR combinada a su designado bien.
  12. Placa de cubierta con papel de aluminio
  13. Vórtice de la placa utilizando el instrumento Vortex y adaptador a 2.000 rpm durante 1 minuto.
  14. Girar hasta la posición de la muestra en la parte inferior del tubo, si hay burbujas spin hacia abajo otra vez.
  15. Ejecute el software.
  16. Cargar la cinta con puntas de carga de pantalla en el instrumento.
  17. Cargar las muestras en el analizador de fragmento con un adaptador de 96 pocillos.
  18. Establecer una gestión con el software de controlador.
  19. Asegúrese de que seleccionar pares de pozos.
  20. Escriba el ID de muestra.
  21. Compruebe que todos los pozos de la cinta de la pantalla están resaltados en gris.
  22. Asegúrese de que el analizador reconoce todas las puntas de pipetas.
  23. Seleccione Inicio y especifique un nombre de archivo para guardar los resultados (nombre, número de muestra y fecha de estudio).
  24. Consulte las instrucciones del fabricante para más detalles.
  25. Una vez finalizado el plazo, deseche la punta, cinta de la pantalla y tubos.
  26. Analizar los datos para 16S pico nM (entre 315-450 bp para V4). Este pico variará dependiendo de los iniciadores seleccionados.

5. Biblioteca cálculo, agrupación, limpieza y control de calidad

  1. Después de determinar el tamaño del amplicón y molaridad de todas las muestras, las bibliotecas para conseguir el volumen final deseado y nM para la biblioteca combinada de la piscina (véase el cálculo de la muestra).
  2. Protocolo de limpieza y concentrado la biblioteca combinada con una purificación basado en la membrana de silicona kit para productos PCR, según el fabricante (véase Tabla de materiales).
    1. Eluir el ADN con un volumen final de 50 μl.
  3. Medida de la concentración de la biblioteca limpia inmediatamente mediante el uso de un doble había trenzado DNA kit de alta sensibilidad para un fluorómetro, según protocolo del fabricante.
    1. Diluir 2 μl de la biblioteca combinada y limpiada con 198 μl del tampón de dilución más tinte (dilución 1: 100).
    2. Anote el valor medido desde el dispositivo fluorométrico y convertirlo según el factor de dilución.
  4. La concentración (ng/μL) de la lectura para la biblioteca agrupada, calcular la molaridad de la biblioteca en nM. Utilice la biblioteca sin diluir de 1 μL para medir la OD260/280 en un espectrofotómetro de microvolume.
    Nota: Un valor de 1.8-2.0 indica pureza adecuada de la biblioteca.
  5. Almacenar la biblioteca final a-20 ° C hasta que esté listo para la siguiente secuencia de generación.

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Representative Results

El protocolo que presentamos incluye pasos importante control de calidad (QC) para asegurar que la reunión de datos generados puntos de referencia para el control de sensibilidad, especificidad y la contaminación de protocolo. Primer paso de control de calidad del protocolo sigue la amplificación por PCR de la región 16S de V4 (figura 2). Un μl del producto de PCR de cada muestra se analizó por electroforesis para confirmar que estaba dentro del rango de tamaño esperado de 315-450 bp (figura 2, flecha roja). Algunas muestras de leche materna generaron menos cantidad de producto específico (figura 2A, comparar los carriles 3 y 9-11 con carriles de 4-8), lo que sugiere cualquiera de los dos niveles bajos de extraído ADN microbiano en las muestras o remanente de los inhibidores de la PCR durante la extracción. Para las muestras que producen menos de 2.0 nM de producto en la gama de bp 315-450 (figura 2A, carril 7), limpieza de inhibidor de la polimerización en cadena es realizados con el equipo de solo paso y la muestra es nuevamente ampliada. Tasas de éxito para la recuperación de la amplificación de la muestra después de limpieza es aproximadamente 40%. Cuantificación de productos específicos para cada muestra (figura 2B) es esencial para determinar su volumen requerido para el agrupamiento molar igual de muestras para la secuencia. Una biblioteca combinada para secuenciación específica generalmente está dominada por un determinado producto PCR (figura 3). Si hay una cantidad importante de productos no específicos en la biblioteca, un paso de purificación del gel se debe agregar al flujo de trabajo.

En el ejemplo presentado en la figura 2A, se observan bandas débiles controles de búfer (BC; carriles 2 y 12) y la PCR control negativo (PC; carril 1), el agua que indica posible contaminación ambiental o reactivo. Estas bandas no son infrecuentes y generalmente representan cantidades bajas del producto de PCR (es decir, < 1 nM) y produce pocas cuentas leerlas durante la secuenciación (< 1.000). Resultados representativos de la secuencia (figura 4) confirman que estas muestras tener muy baja secuencia leer cuentas (Figura 4A, carriles 1 y 11; Figura 4B, Buffer y agua PCR carriles) y, sobre todo, la composición de taxones para las muestras de control difiere de las muestras de leche humana (Figura 4A; compare los carriles 1 y 11 con carriles 2-10). Recuentos altos de lectura en los controles negativos, con traslapo significativo en la composición de taxones entre los controles y las muestras, sugiere la contaminación cruzada y la necesidad de control de la contaminación mejor.

Resultados de la secuencia (figura 4) demuestran alta diversidad en los taxa asociados a la leche humana microbioma y variabilidad en el número de la secuencia Lee cuentas para cada muestra (Figura 4A, carriles 2-10). Por el contrario, los resultados de secuenciación para el bacteriano simulacro que fue procesado junto con las muestras de leche humana demostraron la composición de taxones y leer cuentas que eran comparables a los resultados obtenidos para la mofa en anteriores series de flujo de trabajo (Comparar con Figura 4A , carril 12 con Figura 4B, carriles de simulacros). Los resultados consistentes para los carriles falso sugieren que la variabilidad observada para las muestras de leche humana es un resultado experimental auténtico y no una función de la variabilidad intrínseca del flujo de trabajo.

Figure 1
Figura 1: Diagrama de flujo de la tubería de secuenciación de 16S Targeted. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Análisis de control de calidad de amplicones de 16S V4. (A) imagen de Gel de amplicones de 16S V4 resueltos mediante electroforesis usando un analizador automatizado del fragmento de ADN/ARN. Amplicones de 16S V4 se generaron según Caporaso et al. 9y un μl de cada producto PCR se analizó ADN de alta sensibilidad de reactivos según las instrucciones del fabricante. Muestras de leche más humano (carriles 3-6 y 8-11) y la mofa bacteriana (carril 13) producen un producto primario de la PCR en el tamaño esperado de aproximadamente 400 bp (flecha roja). La muestra de leche humana en el carril 7 no producen una cantidad significativa de producto específico y fue objeto de limpieza y re-amplificación. Se detectó producto mínima para el control negativo de PCR (PC, carril 1) y controles negativos de buffer de lisis (BC, carriles 2 y 12) indicaron la mínima contaminación presente en las muestras analizadas. MW, marcadores de peso molecular: superior inferior y roja barras verdes identifican los 1.500 bp y marcadores de tamaño bp 25, respectivamente, en cada carril. (B) tapa electroferograma del carril 3 de gel en (A). El principal producto PCR se enmarca dentro de la región de pico definida por las barras verticales rojas y se compone de fragmentos que van desde 299 497 bp dando como resultado un tamaño de producto PCR promedio de 396 obispo Gating se realiza en un rango ligeramente más amplio que el tamaño de amplicón esperado (i n este caso 315-450 bp) que incluya el pico muestra todo. Los picos superiores e inferiores se correlacionan con tamaños de fragmento de 25 bp y 1.500 bp, respectivamente. Parte inferior: Tabla Resumen de los parámetros de tamaño para la región del pico, la concentración en ng/μl del producto PCR dentro de la región del pico y la molaridad en nM para el producto específico de la polimerización en cadena. Esta información entonces se utiliza para calcular cuánto de cada muestra se combinaron en una biblioteca molar igual de secuenciación (véase cálculo de ejemplo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: electroferograma de una biblioteca de secuencia combinada y concentrada. Cantidades molares iguales de muestras individuales para ser secuenciados fueron combinados en una biblioteca combinada. La biblioteca fue limpiado y concentrado hasta un volumen total de 50 μL usando un PCR basado en la membrana de sílice limpiar kit. Preparación final de la biblioteca para la secuencia en el secuenciador de generación siguiente se realizó según protocolo del fabricante. Esta biblioteca fue secuenciada con éxito a pesar de la presencia de bandas adicionales. Si hay una preocupación acerca de los productos PCR fuera del rango de tamaño esperado, protocolo del fabricante sugiere la adición de un paso de selección de tamaño de gel. Generalmente no se realiza este paso de control de calidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: evaluación de los controles positivos y negativos de. (A) abundancia relativa de los taxones bacterianos de un lote de extracción con los controles y las muestras de leche humana. Como medida de control de calidad, composiciones de cada lote de extracción como en el instrumento automatizado de purificación de ADN/ARN se generan inmediatamente después de un funcionamiento de la secuencia. Números debajo de cada barra muestra indican el número de Lee filtrado de la muestra respectiva. Las composiciones de los controles de buffer son distintas de la de las muestras de leche humana. (B) abundancia relativa de taxones bacterianos en tampón, mock y controles PCR. Número de lecturas y composición es evaluado para todas negativas (buffer y agua de polimerización en cadena) y controles positivos (bacteriano simulacro). Las composiciones del almacenador intermediario y del agua varían, pero la falsa comunidad permanece bastante estable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Objetivo generación secuenciación de 16S rRNA es una técnica ampliamente utilizada, rápida para microbioma caracterización18. Sin embargo, muchos factores, incluyendo efectos de lote, contaminación ambiental, contaminación de la muestra, sensibilidad y reproducibilidad pueden adversamente afectar resultados experimentales y confundir su interpretación7,19 , 20. para mejor facilitar el análisis de 16S robusta, deben incorporar flujos de trabajo de microbioma buen diseño experimental, el uso de controles adecuados, la segregación espacial de los pasos de flujo de trabajo y la aplicación de mejores prácticas. El protocolo descrito aquí incorpora cada uno de estos parámetros y proporciona importantes herramientas experimentales para los desafíos arriba e implementar un flujo de trabajo de 16S para diversas muestras.

Buen diseño experimental es fundamental para el análisis de 16S microbioma. Esto incluye la adecuada colección y almacenamiento de muestras, así como selección de primers 16S apropiados para la región de interés. Por ejemplo, la región V4 (515F/806R) es seleccionada para leche humana, ya que cuenta con buena amplificación de Bifidobacterium, que juega un papel importante en el desarrollo del microbioma intestinal neonatal21. Otros conjuntos de cartilla (por ejemplo, 27F/338R, 515F/926R) pueden ser más apropiados para estudios de otras comunidades microbianas. Una nota importante es que el recocido temperatura para la 16S específica PCR y el tamaño de amplicón esperado pueden variar basado en la selección de la cartilla.

Otros lugares de que puede ser modificado el protocolo se basan en los resultados de las medidas de control de calidad incorporadas en el flujo de trabajo. Algunas opciones existen para solucionar problemas cuando no o poco ADN se detecta tras el paso de amplificación de PCR 16S específica. 1) la muestra puede colocarse a través de un paso de eliminación de inhibidor de la polimerización en cadena. Amplificación siguiente retiro de inhibidor de la polimerización en cadena usando el kit de un solo paso se realiza según el protocolo del fabricante tiene éxito aproximadamente el cuarenta por ciento del tiempo, 2) más extraído ADN puede agregarse a la 16S específica PCR, o 3) un nuevo y potencialmente más grande alícuota de leche puede ser procesada si está disponible. Si hay una preocupación acerca de los productos PCR fuera del rango de tamaño esperado después de la purificación de sílice-membrana a base de la biblioteca, puede añadirse un paso de purificación del gel. Por último, las medidas de control de calidad son críticas para determinar si existe evidencia de contaminación, que se discute en detalle más adelante. Si se detecta contaminación significativa, entonces dependiendo de donde se introduce la contaminación, ya sea la PCR puede repetirse o si es necesario, la muestra puede ser extraída nuevamente. Afortunadamente, con buenas prácticas de laboratorio, estos son eventos raros. Finalmente, mientras que este protocolo es escrito para destacar advertencias en la amplificación de las muestras de baja biomasa y específicamente de la leche humana, el protocolo puede fácilmente modificarse para la amplificación de los hisopos orales, rectales, vaginales y de la piel o esponjas como taburete. Si se eligen otros tipos de muestras, cuenta se da que kits de extracción son óptimos para el tipo de muestra específico.

Efectos por lotes debido a los kits, reactivos o ejecuta la secuencia son fuente importante de variabilidad en los estudios de microbioma. Kits de extracción de ADN, junto con otros reactivos, poseen bajos niveles de ADN bacteriano, que puede variar sustancialmente según el lote20,22,23,24. Para un gran proyecto, utilizando un solo lote de kits, reactivos, selección de kits diseñados para minimizar la contaminación kit puede simplificar el análisis7. Muestras de sujetos y controles se procesan en paralelo. Lo mejor es si todas las muestras de un solo estudio, ambos sujetos y controlar, pueden ser incorporados en una sola secuencia ejecutar. Si un gran número de muestras deben procesarse por lotes, muestras representativas de sujetos y controles están incluidas en cada lote y procesadas juntos. También es importante organizar por lotes de procesamiento para minimizar la contaminación de las muestras de baja biomasa (es decir, leche materna) por muestras que son de alta biomasa (es decir, heces). En tales casos, proceso de baja biomasa muestra tipos primero y luego alta biomasa las muestras para el estudio mismo.

Muestras de biomasa baja presentan desafíos únicos para estudios de microbioma, como contaminación del medio ambiente, reactivos, instrumentos, y el investigador puede hacer difícil distinguir entre miembros de la comunidad auténtica presentes en abundancia baja7 , 25 , 26 y los que se introducen artificialmente a la muestra a través del proceso experimental19. El flujo de trabajo descrito aquí incorpora controles negativos experimentales importantes en el paso de preparación de muestra (control sólo tampón de lisis) y el paso de la polimerización en cadena (control del agua de la polimerización en cadena) (ver figura 4). Estos controles ayudan a identificar las fuentes de contaminación y facilitar medidas correctivas eficaces en el Banco o en silico27,28,29,30. Controles negativos son cuidadosamente evaluados y registrados con el estudio de resultados7.

Para minimizar la contaminación, segregación espacial de las actividades experimentales en un área de amplificación limpia pre-PCR y amplificación de la zona es importante. Óptimo, la habitación tiene una superficie de ambos para PCR master mix preparación y una preparación de muestra/adición de master mix zona y pueden incorporar una caja de aire muerto o un gabinete de seguridad biológica vivienda consumibles dedicados y pequeños equipos necesarios para la preparación de la mezcla principal. El limpio diseño incorpora un sistema de flujo de aire positivo con la filtración de partículas de aire (HEPA) de alta eficiencia. Uso de equipo de protección personal es esencial para mantener un ambiente controlado, bajo microbiana e incluye redecillas para el cabello, batas de laboratorio, guantes, y Cubrezapatos. Kits/reactivos y las muestras se almacenan idealmente en refrigeradores y congeladores dedicados separados. Configuración PCR también se lleva a cabo en la sala limpia en estaciones de trabajo designadas; separación clara de las acciones de la cartilla y reactivos del ADN extraído se mantiene hasta que las muestras se cargan en la plataforma de pipeteo automatizada. Una vez que una configuración PCR, la placa es transferida al área de amplificación posterior y cargan en un termociclador.

Es importante restringir el flujo de actividad de trabajo de áreas limpias a las zonas de amplificación posterior; no hay ningún movimiento retrógrado de los reactivos, instrumentos o fuentes de las zonas de amplificación posterior a la zona limpia. Personal que ha entrado en alguna de las áreas de la amplificación se impide entrada al área limpiado durante 24 horas (hasta el día siguiente). Además de las anteriores consideraciones de flujo de trabajo, protocolos de limpieza se debe implementar en áreas limpias y amplificación posterior para minimizar contaminación de ácidos nucleicos de las superficies de trabajo e instrumentación. Si no son posibles barreras físicas o habitaciones separadas, todos los esfuerzos se debe establecer el trabajo en zonas tan distantes como sea posible.

Además de la contaminación, estudios de microbioma se enfrentan por sensibilidad, variabilidad y reproducibilidad31. Esta dirección estos temas mediante la incorporación de una comunidad simulada bacteriana definida que se extrae, amplificado y secuenciado junto con cada lote de muestras (véase Figura 4b). Este control proporciona una referencia interna constante que evalúa la reproducibilidad de los resultados experimentales generados y se puede utilizar para solucionar los problemas que se presentan. Por ejemplo, la calidad de la maqueta ADN extraído puede prever una métrica muestra efectiva lisis y extracción de ADN, que controla de ADN genómico se pierda. Control de calidad de amplicones de PCR de la muestra simulada también puede indicar la especificidad y la eficiencia de la PCR. Además, porque la mofa compone de varios tipos de bacterias, la sensibilidad relativa de un lote procesado de las muestras puede ser deducida por la representación de los taxones en los resultados de la secuencia de la muestra simulada. Una comunidad ideal de simulacro evaluará la capacidad para detectar principales especies bacterianas en el compartimiento de análisis, y por lo tanto la composición de la comunidad simulacro deba variar según el estudio. Como se muestra en la figura 4a, hay considerable variabilidad entre los resultados de la secuencia de la muestra, pero los resultados de la secuencia de la comunidad bacteriana de simulacro es altamente reproducible (véase Figura 4b).

Mientras que la comunidad simulada en la figura 4 es una mezcla única de 33 cepas de una combinación de cepas clínicas comercialmente disponibles y locales, una comunidad simulada disponible comercialmente ha sido recientemente desarrollado32.

Aunque el flujo de trabajo descrito aquí se limita en su capacidad de reproducibilidad de dirección general a través de microbioma diferentes estudios, proporciona un importante enfoque experimental que permite a los investigadores a incorporar adecuada experimental controles y monitor reproducibilidad dentro de sus propios resultados.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a Helty Adisetiyo, PhD y Shangxin Yang, PhD para el desarrollo del protocolo. Apoyo total para el internacional materno pediátrico adolescentes SIDA clínico ensayos grupo (IMPAACT) fue proporcionada por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (NIAID) de los institutos nacionales de salud (NIH) números de premio UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) y UM1AI106716 (IMPAACT LC), con cofinanciación de Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano (NICHD) y el Instituto Nacional de Salud Mental (NIMH). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de los NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AllPrep RNA/DNA Mini Kit Qiagen 80204 DNA/RNA extraction kit
Eliminase Fisher Scientific 435532 RNase, DNase, DNA decontaminant
Thermo Mixer Fisher Scientific temperature-controlled vortexer
Buffer RLT plus Qiagen 1053393 guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689-25ML-F ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME Beads MP Biomedicals 116914050 bead tube
QIAgen TissueLyzer Qiagen 85300 automated sample disruptor adapter set
QIAshredder column Qiagen 79654
QIAgen RB tube manufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticware Qiagen 9001292 automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plus Applichem A7089 non-enzymatic decontamination solution
EB Buffer Qiagen 19086 elution buffer
QIAgility and related plasticware Qiagen 9001532 robotic liquid handler
PCR water MO BIO 17000-
5PRIME HotMasterMix Quantabio 2200400
Barcoded reverse primers Eurofin No Catalog #'s designed and ordered
96 well PCR plate USA scientific 1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticware Agilent G2964AA automated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation Agilent 5067-5585 Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit Zymo Research 50444470 PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32854 dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216
NanoDrop Thermo Fisher microvolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kit Illumina 15033624/15033626
MiSeq Illumina No Catalog #'s next generation sequencer

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References

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Inmunología e infección número 133 16S del ARN ribosómico microbioma secuenciación de próxima generación la leche materna leche materna baja biomasa
Un método de secuenciación de 16S específica de las muestras de leche humana
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Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih, S., Lee, D. J., Li, F., Aldrovandi, G. M. A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples. J. Vis. Exp. (133), e56974, doi:10.3791/56974 (2018).

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