Summary
Este método consiste en introducir un transgen en el endotelio de las arterias carótidas de conejo. Introducción del transgén permite la evaluación de la función biológica del producto transgen en arterias normales o modelos de la enfermedad. El método también es útil para medir actividad de secuencias reguladoras del ADN.
Abstract
El objetivo de este método es introducir un transgen en el endotelio de segmentos aislados de ambas arterias carótidas comunes del conejo. El método logra focal transgénesis endotelial selectiva, lo que permite a un investigador determinar los roles biológicos de endoteliales expresan transgenes y cuantificar la actividad transcripcional in vivo de secuencias de ADN en arterias grandes células endoteliales. El método utiliza aislamiento quirúrgico de arterias carótidas comunes de conejo y una arteriotomía para entregar un vector viral expresar transgenes en la luz arterial. Un período de incubación corto del vector en el lumen, con posterior aspiración de los contenidos de la luz, es suficiente para alcanzar eficiente y duradera expresión del transgén en el endotelio, sin transducción detectable o expresión fuera de la segmento arterial aislada. El método permite la evaluación de las actividades biológicas de los productos transgénicos en arterias normales y en modelos de enfermedad vascular humana, evitando efectos sistémicos que podrían ser causados ya sea apuntando a la entrega de genes a otros sitios (por ej. el hígado) o por la alternativa de entregar construcciones genéticas al endotelio por transgénesis de línea del germen. Aplicación del método está limitada por la necesidad de un experto cirujano y anestesista, una bien equipada sala de operaciones, los costos de compra y vivienda conejos y la necesidad de experiencia en la construcción de vectores de transferencia génica y uso. Resultados obtenidos con este método incluyen: alteraciones relacionadas con el transgén en la estructura arterial, celularidad, matriz extracelular o función vasomotora; aumentos o reducciones en la inflamación arterial; alteraciones en la apoptosis de las células vasculares; y progresión, retraso o regresión de enfermedades como la hiperplasia intimal o ateroesclerosis. El método también permite la medición de la capacidad de secuencias reguladoras de ADN natural y sintético para alterar la expresión del transgén en las células endoteliales, proporcionando resultados que incluyen: niveles de transgen mRNA, los niveles de la proteína transgénica y niveles del transgén actividad enzimática.
Introduction
El objetivo de este método es introducir un transgen en el endotelio de las arterias carótidas común conejo. Introducción del transgén permite la evaluación de la función biológica del producto transgénico tanto en modelos de conejo de la humana enfermedad arterial en las arterias normales. La sobreexpresión del transgen en modelos de la enfermedad puede revelar si el transgén (y su producto de la proteína) prometen como agentes terapéuticos1,2,3,4. Inserción de elementos reguladores cis-acting en el casete de expresión del transgén permite la evaluación de la actividad de estos elementos en el endotelio arterial en vivo5,6. Conocimiento de la actividad de determinados elementos reguladores cis-acting puede utilizarse para diseñar casetes de expresión más activa y sondear los mecanismos de regulación génica en el endotelio de la arteria grande en vivo7.
Los conejos son un modelo valioso para diversos aspectos de la fisiología vascular humana y enfermedad. Los conejos comparten muchas características vasculares con los seres humanos. Por ejemplo, valores hematológicos basales, la regulación hemostática y tensión longitudinal vascular son similares entre los conejos y los seres humanos8. Modelos de conejo de enfermedades vasculares replican las características clave de muchas enfermedades humanas incluyendo: aneurismas (similares geométricas y características del flujo)9, vasoespasmo (similar respuesta a tratamiento endovascular)10,11, y aterosclerosis (placas íntima con similares características, incluyendo un núcleo rico en lípidos, macrófagos y músculo liso células en una cubierta fibrosa)12,13. En consecuencia, han desarrollado modelos de conejo para muchas enfermedades vasculares como trombosis, vasoespasmo, aneurisma, diabetes, estenosis de injerto vascular y ateroesclerosis8,13,14, 15,16.
Para elegir entre los modelos animales de la fisiología vascular y enfermedad de los investigadores, el conejo tiene varias ventajas. En comparación con los roedores, los vasos más grandes de los conejos permiten más fácil manipulación quirúrgica, uso de dispositivos endovasculares y una mayor cantidad de tejido para mediciones cuantitativas. Los conejos son mucho más cercanos filogenéticamente a los primates que son roedores17, y la mayor diversidad genética de conejos exogámica aproxima mejor la variabilidad genética de los seres humanos. La diversidad genética es particularmente importante para los estudios preclínicos, que-por naturaleza-pretenden desarrollar terapias que pueden aplicarse a la población humana genéticamente diversa. Como con muchas si no todas las demás especies modelo, genes de conejo son fácilmente clonados o sintetizados ya se ha secuenciado el genoma de conejo con alta cobertura (7.48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. En comparación con otros modelos animales grandes (como perros, cerdos u ovejas), los conejos son relativamente baratos de comprar y casa y son fáciles de criar y manejar. Modelos específicos de enfermedad vascular en conejos cada uno tienen sus ventajas y deficiencias como modelos de enfermedades humanas que están más allá del alcance de este manuscrito8,12,18. Un investigador debe revisar estas ventajas y deficiencias para determinar si el conejo es el mejor modelo para contestar una pregunta experimental específica.
Introducción de secuencias reguladoras del ácido desoxirribonucleico (ADN) en células endoteliales en vivo permite la investigación de la actividad de estas secuencias en un complejo entorno fisiológico. Estudios in vitro en las células transfected endoteliales pueden ser útiles para la evaluación inicial de secuencias reguladoras del ADN; sin embargo, los niveles de expresión en modelos de cultivo de tejidos a veces se reproducen no cuando los estudios son repetidos en vivo5,19,20. Sistemas in vitro también pueden ser útiles para explorar vías básicas de proteína de señalización y fisiología endotelial, así como comunicación entre las células vasculares cultivadas; sin embargo, más complejas vías o redes de regulación que están influenciadas por las poblaciones complejas de células vasculares vecinas o el sistema inmune se estudian mejor en un en vivo sistema6,20. El método descrito en este documento ofrece una plataforma para explorar la regulación de la expresión de transgenes en el endotelio en el contexto de un recipiente intacto, con o sin enfermedad. En vivo el sistema también permite la investigación de interferencia celular fisiológica y patológica y la identificación de las contribuciones del sistema inmune a la regulación de la expresión de gen6.
Transgénesis germinal (especialmente en los ratones) es un enfoque alternativo para dirigir la expresión del transgen a las células endoteliales. Este enfoque puede proporcionar expresión del transgen durante toda la vida, con objetivos endotelial mediada por promotor específica o regiones reguladoras21,22. Sin embargo, la generación de ratones transgénicos es costoso y desperdiciador de tiempo, varias líneas transgénicas deben probarse frecuentemente para garantizar la focalización del transgén en el tipo celular deseado y el logro de niveles de expresión del transgen adecuada y experimental resultados en sistemas murinos pueden ser dependiente de la cepa. Modelos murinos transgénicos con transgenes endotelial dirigidos tienen muchas ventajas: no es necesario realizar la cirugía en todos los animales experimentales con el fin de lograr la transgénesis, ratones experimentales pueden ser criados con numerosos otros ratones transgénicos disponibles en para probar las interacciones genéticas y fenotípicas, y hay una gran variedad de anticuerpos que reaccionan con proteínas murinas, facilitando la caracterización de fenotipos. Sin embargo, targeting de transgenes al endotelio a través de la línea germinal típicamente resulta en la expresión de transgenes a través de la vasculatura,22 lo que es difícil determinar el sitio en que está actuando el producto del transgen. Esto es especialmente cierto cuando el producto del transgen es secretado, porque un producto transgénico secretado por las células endoteliales a través de la vasculatura podría tener actividad biológica en cualquier número de sitios dentro de un animal. Aunque el método descrito en este manuscrito requiere conocimientos técnicos y servicios especializados, puede ser mucho menos tiempo y menos costosa que el desarrollo de una línea de ratón transgénico endoteliales específicos. Permite la evaluación de la función de una proteína selectivamente en las células endoteliales de un segmento de arteria grande, y permite el uso de la carótida común contralateral como control emparejado (eliminando factores sistémicos que pueden variar entre experimental animales-por ejemplo, la presión arterial o los niveles de colesterol-como variables incontroladas).
La terapia génica es un enfoque prometedor para el tratamiento de enfermedades vasculares, enfermedades crónicas especialmente, porque una sola aplicación puede ser sostenida o posiblemente toda la vida la expresión de un gene terapéutico23. Se ha explorado la promesa terapéutica de la terapia génica en modelos animales de transferencia génica somática, a menudo el hígado24,25, que es un objetivo relativamente fácil porque muchos vectores virales transmitidas por la sangre son hepatotrópicos. Sin embargo, para tener un efecto sobre la enfermedad vascular, la terapia génica dirigida al hígado debe alcanzar sistémica sobreexpresión de las proteínas. En general, esto requiere grandes dosis de vectores, que pueden ser tóxicas o incluso mortales26. Por otra parte, aumento de los niveles sistémicos de un aumento de la proteína el riesgo de efectos secundarios fuera del objetivo, que podría complicar o incluso oscurecer la interpretación de resultados experimentales. Terapia del gene locales dirigidos a endotelio vascular como se describe en este manuscrito podría evitar efectos secundarios sistémicos porque el vector infundido no se difundió más allá del segmento arterial transduced y efectos vasculares locales pueden lograrse sin cambios en niveles plasmáticos sistémicos de la proteína. 27 además, se necesita una cantidad mucho menor de vector a transducir un segmento arterial que es necesario para lograr la transducción hepática sólida. Expresión transgénica del hígado se ha divulgado a declinar con el tiempo, probablemente debido al recambio celular, que requiere dosis repetidas si la expresión transgénica de alto nivel debe ser mantenido. 28 en cambio, la tasa de rotación baja del endotelio proporciona expresión estable durante al menos 48 semanas en conejos alimentados con chow y durante al menos 24 semanas en las lesiones ateroscleróticas de conejos alimentados con colesterol. 1 , 27
Para determinar si este método de transferencia de genes al endotelio carótida común conejo es apropiado, las ventajas y desventajas (tabla 1) deben considerarse en el contexto de los objetivos específicos de investigación. Las ventajas de este método incluyen: exogámica los conejos son el mejor representante de la diversidad genética humana que son ratones endogámicos (importantes para el trabajo preclínico); conejos proporcionan recipientes más grandes para un manejo más fácil y más tejido para el análisis; el método puede lograr expresión transgen orientada a endotelio mucho más rápidamente de lo que hace la línea germinal endotelial en ratones transgénicos; dosis del vector se pueden ajustar fácilmente a niveles variables de modelo de expresión del transgen; procesos específicos de endotelio de arterias grandes pueden ser investigados; y transgénesis vascular local permiten la carótida opuesta en el mismo animal para ser utilizado como un control, eliminar los factores sistémicos como variables incontroladas. Desventajas incluyen: instalaciones especiales y conocimientos son necesarios; menos fondos modificados genéticamente en el que experimentar están disponibles en los conejos que en los ratones; y hay una selección menos extensa de anticuerpos de conejo frente a proteínas de ratón (para la inmunodetección de proteínas transgénicas y otros antígenos que pueden ser importantes en la interpretación de resultados experimentales).
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos fueron aprobados por la Universidad de Washington, oficina de bienestar de animales asociado institucional Animal atención y Comité uso (IACUC) y se completaron en conformidad y cumplimiento de todos los pertinentes reglamentario e institucional directrices.
Nota: Transferencia de genes a arterias carótidas comunes del conejo se realiza en conejos por un cirujano con la ayuda de un anestesiólogo o un asistente.
1. transferencia de gen arterias carótidas común conejo: antes de la operación
- Anestesiar al conejo. Peso del conejo. Combinar 30 mg/kg ketamina y 2 mg/kg xilacina en una jeringa. Inyectar ketamina/xilacina intramuscular (IM) en los músculos paraspinous para inducir anestesia.
- Espera de conejo para ser anestesiados, preparar la sala de preparación y mesas de sala de operaciones (OR).
- En la sala de preparación de OR: Coloque el ungüento oftálmico y el parche de fentanilo al alcance de la tabla de preparación; configurar cortar el pelo y un vacío para depilar el conejo cuello y oido; dejar de lado una almohadilla de preparación de alcohol, un catéter 24 x ¾", un puerto de inyección y esparadrapo para fijar la línea intravenosa (IV) en la vena de la oreja del conejo.
- En el quirófano: configurar el equipo de monitoreo y sondeos [Electrocardiograma (ECG), saturación de oxígeno (SpO2), temperatura] la posición en la tabla OR; preparar oxígeno y el isoflurano; atar la tira de Gasa a la mascarilla para asegurar que el conejo y coloque la máscara sobre la cabecera de la mesa.
Nota: Las tiras de Gasa atadas en la mascarilla facial deben tener 2 colas de unos 45 cm. - Encienda la manta de agua sobre la mesa OR. Encima de la manta de agua, coloque una toalla enrollada para ayuda del cuello y una placa de electrodo dispersivo (más adelante colocado en la parte posterior del conejo).
- Configurar la bomba o IV con 100 mL de una solución salina bolsa IV con una aguja de 18-19G adjunto y fijar el caudal a 10 mL/h por kg.
- Combinar 1 mL de lidocaína HCl (solución stock al 2%) y 1 mL de bupivicaine HCl (solución stock de 0,5%) en una jeringa, para ser utilizado como un analgésico local.
- Cuando el conejo está totalmente anestesiado, preparar el conejo para la cirugía.
Nota: Verifique que la falta de un reflejo pedal (pellizco un dedo del pie; busca retiro de miembro) para garantizar la profundidad anestésica y seguir vigilando el reflejo pedal a lo largo de la cirugía.- Aplique ungüento oftálmico para ojos. Eliminar heces del recto del conejo presionando con los dedos enguantados en la parte inferior del abdomen anterior (sobre el recto) y moviendo los dedos hacia el ano. Esto permitirá para posterior colocación de una sonda de temperatura rectal.
- Afeitarse el cuello anterior de la fosa esternal hasta el borde de la mandíbula durante el uso de una aspiradora para mantener limpia el área. También afeitarse las orejas para la colocación de la IV y la fijación del parche de fentanilo y afeitarse un trasero medio dedo del pie izquierdo de la punta de prueba de oximetría de pulso.
Nota: El protocolo asume que el cirujano es lado derecho del conejo durante todo el procedimiento. Si la configuración OR coloca al cirujano en el lado opuesto, inverso lados en este paso para guardar los cables y IV enfrente del cirujano. Los lados de los pasos futuros también deben cambiarse según sea necesario. - Limpie la oreja izquierda con una almohadilla de preparación de alcohol, colocar un catéter IV de 24G en la vena de la oreja izquierda, la tapa con el puerto de inyección y cinta en la oreja del conejo para asegurarlo al puerto y al catéter. Aplique un parche de fentanilo (25 μg/h) en la oreja derecha del conejo.
- Transporte el conejo en la o y colocar decúbito supino en la mesa de operaciones con una toalla de apoyo cuello enrollada bajo el cuello del conejo justo debajo de la cabeza. Extender suavemente cuello de conejo hasta que quede aproximadamente horizontal y recta.
- Gancho al conejo hasta la mascarilla facial con O2 sobre en 1 L/min y comenzar la administración de isoflurano. Fijar la mascarilla envolviendo los extremos de la tira de Gasa atado a la máscara alrededor de la toalla de soporte del cuello bajo el conejo. Ajuste isoflurano (típicamente 1-2%) según sea necesario (en base a la frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria y reflejo pedal) para mantener la anestesia adecuada para el resto del procedimiento.
- Asegúrese de que la placa del electrodo dispersivo se centra en la parte posterior del conejo. Coloque las sondas de temperatura y Pulso-Oxímetro y aplique los cables EKG a los conejos.
- Gancho de solución salina IV para el puerto del catéter en la oreja del conejo, a partir de la bomba de solución salina a 10 mL/h por kg.
Nota: Después de 1 h, la bomba de solución salina puede reducirse a 5 mL/h por kg. - Sujetar las patas delanteras del conejo atando libremente les a la mesa. Opcionalmente, colocar una pequeña mesa de plástico sobre el conejo para proteger al conejo estén sometidos a presión abdominal pecho por el cirujano apoyándose, pecho, abdomen del conejo.
Nota: La mesa puede ayudar a prevenir regurgitación forzada del contenido abdominal. - Inyectar 2 mL de lidocaína previamente preparada (2% de acciones) / bupivacaína (0,5% de acciones) (mezcla 50/50) por vía subcutánea a lo largo de la línea de incisión de cuello previsto para la anestesia local.
- Deje que el Asistente de preparar el sitio quirúrgico con 3 alternando peelings de clorhexidina isopropanol y luego un rocío con betadine. Matorral, vestido y guantes, siguiendo una técnica aséptica adecuada.
Nota: El cirujano debe usar 2 x lupas quirúrgicas para ayudar con la primera mitad de la cirugía. Durante la cirugía la supervivencia es vital para mantener la esterilidad del cirujano y el campo quirúrgico. Sólo el ayudante debe manejar objetos no estériles y materiales esterilizados deben pasar al cirujano asépticamente o colocados en la tabla del instrumento cubierto. Toallas estériles pueden utilizarse por el cirujano para mantener la esterilidad mientras manipula equipos no estériles tales como el microscopio.
2. supervivencia cirugía (transferencia del Gene)
- Preparar instrumentos y campo estéril.
- Deje que el asistente abrir el paquete del paño estéril que contiene un paño de tabla, un paño de papel para el conejo y varias toallas. Transferir asépticamente los elementos al cirujano.
- Cubra la mesa de instrumentos. Toallas estériles lugar el 6 y el papel cuelgue sobre la mesa de gala.
- Con 4 toallas, cubra el cuello del conejo, dejando sólo el campo quirúrgico expuesto (aproximadamente 4 cm x 10 cm). Coloque el cobertor de papel sobre el conejo.
- Deje que el asistente abrir el paquete de instrumentos esterilizados y colocar asépticamente sobre la mesa de instrumentos.
- Deje que el asistente abrir el siguiente equipo y colocar asépticamente sobre la tabla del instrumento o de la mano al cirujano: tres jeringas de 1 mL y una aguja si las jeringuillas no se cargan ya con agujas, una jeringa de 20 mL, una aguja de 21G, una aguja de 19G, 3-0 poliglicólico suturas de ácido (PGA), sutura de PGA de 5-0, sutura del polipropileno 7-0 y dos 24 G IV-catéteres.
- Fije el cable de electrocauterio para el cobertor de conejo utilizando el 7,25" pinza Kantrowitz y luego soltar el tapón fin de la tabla. Deje que el asistente Conecte el cable a la unidad de electrocirugía y conecte la alimentación.
- Llene una jeringa de 20 mL con solución salina estéril, de una bolsa de IV o vial llevó a cabo por el asistente. Utilice esta solución salina según sea necesario para mantener la humedad de los tejidos expuestos durante el procedimiento.
- Preparar una jeringa de 1 mL con 1 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, para el lavado de la arteria). Para cada uno de la arteria carótida que se transduced 0,35 mL de virus diluido son necesarios. Si el mismo virus se utiliza para ambos lados, preparar una jeringa de 1 mL con virus diluido en DMEM a un volumen de 0,7 mL. Si diferentes partes están recibiendo diferentes virus [por ejemplo un "Nulo" control de virus en un lado], preparar dos jeringas de 1 mL, cada una con 0,35 mL de solución de antivirus. Para el ayudante dependiente adenovirus, la concentración del virus es 2 x 1011 partículas virales (vp) / mL.
Nota: Deje que el asistente prepare el virus. El cirujano elabora suspensión DMEM y virus en jeringas estériles. - Corte un agujero en la cortina. El tamaño del agujero debe ser del mismo tamaño que el sitio quirúrgico en el cuello del conejo que está enmarcada por las toallas en el paso 2.1.3. Fije las esquinas del agujero en el paño de papel a las toallas subyacentes que están cubiertos con las abrazaderas de la toalla sobre el cuello del conejo.
- Aislar las arterias carótidas comunes.
Nota: 2 x lupas quirúrgicas debe utilizarse para esta parte.- Cortar la piel con un electrocauterio a lo largo de la línea media que se extiende aproximadamente 7-9 cm cranially hacia la mandíbula y sujete la piel abierta con abrazaderas de toalla.
- Hacer un corte lateral corto a través de la fascia con el electrocauterio en el extremo caudal. Luego inserte las grandes tijeras en el corte y sin rodeos, disecar la fascia a lo largo de toda de la línea media. Cortar la fascia disecada hacia abajo de la línea media con la electrocauterización.
- Con pequeñas tijeras de disección, disecar entre los músculos en forma de V (músculo sternocephalic) y el músculo esternocleidohioideo sobre la tráquea, para exponer las arterias carótidas comunes, empezando por el lado derecho.
- Disecar la arteria carótida común derecha libre de los tejidos, dividiendo todas las ramas, desde la base del cuello caudalmente hasta el cruce del nervio faríngeo cranially circundantes. Uso silicona quirúrgica lazos para ayudar en la contracción de la arteria durante la disección.
Nota: Se debe tener cuidado para no perturbar el nervio vago que corre paralelo a la carótida común, o los pequeños nervios que cruzan la carótida común. - Ligar las sucursales grandes viene de la arteria carótida común (1-2 por lado) con las suturas de seda 5-0 antes de cortar la rama distal para un segmento de 4-5 cm de la carótida. Cortar ramas ligados 1-2 mm de la corbata para que no se salga el empate.
- Repita la disección en el lado izquierdo (pasos 2.2.3 - 2.2.5).
- Incorporar vectores en arterias carótidas comunes.
Nota: Se utiliza un microscopio quirúrgico (16 X) según sea necesario para la realización de la arteriotomía, la infusión de solución de control de vectores y la reparación de la arteriotomía.- Deje que el asistente Retire las lupas quirúrgicas del cirujano y mover el microscopio quirúrgico en su posición. Cuelgue una toalla estéril y al microscopio para permitir la manipulación del microscopio sin contaminar el campo estéril.
- Inyectar heparina [150 unidades internacionales (UI) /kg] en el catéter IV y enjuague con 10 mL de solución salina.
- Volviendo a la carótida común derecha aislada, poner dos lazos de seda alrededor de la porción media del segmento movilizado carótida y ate un nudo simple en cada uno - sin apretarlos.
- Doblar la aguja 19G sobre el bisel hasta aproximadamente 80° utilizando el controlador de aguja grande (no doble el bisel; Figura 1).
- Abrazadera de la arteria en cada extremo del segmento aislado con clips vasculares, colocando el clip craneal primero para permitir el llenado de la arteria y luego colocando la pinza caudal.
- Punción en la arteria carótida común con la aguja de 19G doblada justo craneal a caudal clip vascular, teniendo mucho cuidado de no perforar las paredes posterior o laterales. Haga avanzar la punta de la aguja en el lumen y retirar dos veces para asegurarse de arteriotomía atraviesa completamente la pared arterial. Luego con cuidado retirar la aguja.
Notas: Es importante crear una arteriotomía que penetra todas las capas de la pared arterial limpiamente y no disecar la pared arterial (aprobando axialmente por medio de la adventicia y la media). Para lograr esto, la carótida se debe pinchar con la punta de la aguja colocada lo más cerca posible a un ángulo de 90° contra la pared de la arteria (figura 1). Punción carotídea en un ángulo de 90° es ayudada por el acaparamiento de la arteria por la adventicia con pinzas finas y levantar suavemente la superficie de la arteria mientras se presiona la punta de la aguja justo caudal al punto de elevación. Esta maniobra también reduce el riesgo de golpear la pared posterior (figura 1). - Despliegue y de racimo varias gasas en un nido en el que se pone la jeringa utilizada para las infusiones. Coloque el nido en el pecho del conejo caudal a la incisión.
- Poner un catéter IV en la jeringa que contiene sólo DMEM (no demasiado apretado) y doblar el catéter ~ 4 mm desde la punta para que la curva tiene a unos 75° después se libera.
- Inserte el catéter IV en la arteria hasta el punto de la curva y lavar toda la sangre de la arteria con DMEM (~ 0,25 mL x 2). Para cada lavado, llenar la arteria con DMEM y luego retire DMEM residual desde el lumen del recipiente presionando suavemente sobre la arteria con un dedo enguantado, comenzando justo caudal a la pinza vascular craneal. Manteniendo una presión suave, deslice el dedo de craneal a caudal. El contenido luminal se lave por la arteriotomía.
- Mantener el catéter en la arteria e intercambio de la jeringuilla DMEM para la jeringa que contiene la solución de antivirus. Asegúrese de que no el aire entra en el catéter.
- Deslice los seda lazos abajo de la arteria para que rodean la arteria en la localización de la punta del catéter, pero no los apriete.
- Infunda 0,03 mL de la solución antivirus para empujar el DMEM restantes por el catéter y luego vaciar la arteria. Colapso por otra vez quitando todo el líquido de la luz con un dedo, craneal a caudal (como en el paso 2.3.9).
- Apriete los dos lazos alrededor de punta de catéter para sellar el lumen. Infundir la solución de virus (~ 0,25 mL; 2 x 1011 vp/mL para el adenovirus) presionando suavemente el émbolo de la jeringa hasta que la arteria se dilata a calibre fisiológica.
Nota: Es importante que la arteria se expande a calibre fisiológica y permanece dilatada durante la infusión de virus. Si no es así, el grado de transferencia de genes se reducirá significativamente. - Suavemente Coloque la jeringa sobre el nido de la gasa.
- Colocar una sutura de polipropileno 7-0 en la adventicia carotídea común sólo caudal del clip vascular craneal para marcar el límite craneal de la transducción de genes
- Después de la solución que contiene el virus en el lumen de la arteria durante 20 min., retire la jeringa que contiene el virus y reemplazarlo con una jeringuilla vacía. Aspirar la solución que contiene el virus suavemente hasta que el vaso se colapsa y retire la jeringa. Cortar o deshacer los lazos de seda y retirar suavemente el catéter.
Nota: Cortando los lazos SIDA muy corto en quitarlas. Retire el catéter cuidadosamente para evitar dañar el endotelio carótido. - Utilizando el microscopio quirúrgico, cierre de la arteriotomía con polipropileno 7-0 usando un patrón de X (figura 2).
- Efectuar una primera entrada en la parte inferior derecha de la arteriotomía y salida de la nave en la parte inferior izquierda. Luego cruzar la abertura y hacer un segundo pase de la parte superior derecha de arriba a la izquierda.
- Antes de atar abajo de la sutura, lave la arteria soltando muy brevemente el clip vascular craneal. Sangre fluirá de la arteriotomía cuando el clip se suelta, eliminación de aire y virus residual de la luz.
- Tirar de la sutura para cerrar la arteriotomía y atar una sutura con nudos cuadrados 2.
Nota: Tirar de la sutura muy apretada hará que agrupar del tejido que alterará el flujo, aumenta el riesgo de trombosis y alteración de flujo que puede ser una importante variable incontrolada en modelos de la enfermedad.
- Suelte el clip vascular craneal y el caudal clip vascular ejerciendo una ligera presión con una gasa para detener cualquier sangrado. Si el sangrado persiste, continúe la presión durante 1-2 minutos. Si la arteriotomía se cierra correctamente, el sangrado se detiene siempre dentro de este marco de tiempo.
- Deje que el asistente inyectar buprenorfina [0.02 mg/kg, subcutánea (SQ)] en este tiempo para proporcionar analgesia postoperatoria hasta que los niveles plasmáticos de fentanilo se convierten en terapéuticos.
Nota: Una segunda buprenorfina inyectable (0.02 mg/kg; SQ) necesite 6 h después de la primera inyección para mantener la analgesia hasta que los niveles plasmáticos de fentanilo se convierten en terapéuticos. - Repita el protocolo de infusión de virus en lado izquierdo siguiendo pasos 2.3.2 - 2.3.19.
- Encierro de la herida
- Utilizar una sutura de PGA de 5-0 para cerrar la fascia de la línea media con una sutura continua.
- Con una sutura de PGA de 3-0, cerca de la piel con un patrón intradérmico utilizando un nudo enterrado en ambos extremos.
- Recuperación postoperatoria y la limpieza.
Nota: El conejo debe vigilarse continuamente para adecuada oxigenación y la temperatura corporal mientras se recupera de la anestesia. La recuperación debe tomar lugar en un ambiente tranquilo y silencioso.- Cierre flujo isoflurano y oxígeno y quitar la careta de conejo.
- Desenganche de líquidos intravenosos pero deje el puerto IV en lugar de acceso de emergencia IV.
- Tomar el conejo para el área de recuperación y ponga a su lado en una jaula con una manta de agua activada (u opcionalmente un calentador Bair Hugger).
- Dar O2 máscara hasta que la SpO2 es estable.
- Permiten que recupera el conejo en una jaula, los bancos al otro lado cada 15 minutos, hasta que el conejo pueda sentarse sobre sus patas traseras y moverse.
- Cuando el conejo es móvil, retire el IV su oído antes de volver a la jaula.
Nota: No devuelva el conejo a la compañía de otros animales hasta que es recuperado de la anestesia.
- Deshágase de todo lo que tenía contacto con el vector o en el campo operativo, residuos de objetos punzantes y biológico apropiado siguiente protocolos.
3. transferencia de gen arterias carótidas común conejo: cuidados postoperatorios
- Evaluar el estado general del conejo diariamente después de la cirugía, comprobar la cicatrización de heridas, evidencia de infección, apetito, respiración y signos de dolor.
- Verifique la posición de oreja de conejo (orejas hacia abajo pueden ser un signo de dolor o angustia, especialmente cuando se combina con un aspecto descuidado). Compruebe que el conejo sigue siendo móvil y activo. Compruebe el conejo para la respiración normal sin estridor. Comprobar que la herida está limpia, seca e intacta. Compruebe el conejo para una temperatura normal del cuerpo. Consultar servicios veterinarios si el conejo no es móvil y activa, con un aspecto ordenado, temperatura normal del cuerpo, una herida limpia y normal la respiración.
- Compruebe la ingesta normal de alimentos y pruebas de heces frescas y orina.
Nota: La ingestión de alimentos puede disminuir después de la cirugía, pero debe volver a la normalidad dentro de 2 días; proporcionar alimento suplementario según sea necesario.
- Retire el parche de fentanilo en día postoperatorio 3.
Nota: La buprenorfina puede ser administrada según sea necesario para el dolor postoperatorio que no se gestiona por el parche de fentanilo, o en caso de que el parche de fentanilo se retira temprano.
4. terminal cosecha cirugía: antes de la operación
- Anestesiar al conejo. Vea las secciones 1.3 y 1.3.5 en relación con el logro y mantenimiento de la anestesia.
- Peso del conejo. Combinar 30 mg/kg ketamina y 2 mg/kg xilacina en una jeringa. Inyectar ketamina/xilacina IM en los músculos paraspinous para inducir anestesia.
- Preparar la sala de preparación y o mesas esperando el conejo a ser anestesiados.
- En la sala de preparación de OR: configuración del cortar el pelo y un vacío para depilar el conejo cuello y oido.
- En la sala de operaciones: configuración de equipo de control y posición de las sondas (SpO2, temperatura) en la tabla OR; preparar oxígeno y el isoflurano; atar una tira de Gasa a la mascarilla para asegurar que el conejo y coloque la máscara sobre la cabecera de la mesa.
Nota: Las tiras de Gasa atadas en la mascarilla deben tener 2 colas de unos 45 cm. - Encienda la manta de agua sobre la mesa OR. Encima de la manta de agua, coloque una toalla enrollada para ayuda del cuello y una placa de electrodo dispersivo (más adelante colocado en la parte posterior del conejo).
- Combinar 1 mL de lidocaína HCl (2% de acciones) y 1 mL de bupivicaine HCl (0.5% de acciones) (mezcla 50/50) en una jeringa como un analgésico local.
- Cuando el conejo está totalmente anestesiado, preparar el conejo para la cirugía.
- Eliminar materia fecal del recto, como se describe en 1.3.1, para permitir la posterior colocación de una sonda de temperatura.
- Afeitarse el conejo de la fosa esternal al ángulo de la mandíbula durante el uso de una aspiradora para mantener limpia el área. Afeitarse el trasero medio dedo del pie izquierdo de la punta de prueba de oximetría de pulso.
Nota: El protocolo asume que el cirujano será lado derecho del conejo. Si la configuración OR pondrá a cirujano en el lado opuesto, invierta las partes en este paso para guardar los cables enfrente del cirujano. Los lados de los pasos futuros también deben cambiarse según sea necesario. - Transporte el conejo en la o y colocar decúbito supino en la mesa de operaciones con una toalla de apoyo cuello enrollada bajo el cuello del conejo justo debajo de la cabeza. Extender suavemente cuello de conejo hasta que quede aproximadamente horizontal y recta.
- Gancho el conejo hasta mascarilla con O2 sobre en 1 L/min y comenzar la administración de isoflurano. Fijar la mascarilla envolviendo los extremos de la tira de Gasa atado a la máscara alrededor de la toalla de soporte del cuello bajo el conejo. Ajuste isoflurano (típicamente 1-2%) según sea necesario para mantener la anestesia adecuada para el resto del procedimiento.
- Asegúrese de que la placa del electrodo dispersivo se centra en la parte posterior del conejo. Colocar sondas de temperatura y Pulso-Oxímetro.
- Sujetar las patas delanteras del conejo atando libremente les a la mesa.
Nota: Opcionalmente, colocar una pequeña mesa de plástico sobre conejo para proteger al conejo estén sometidos a presión abdominal pecho por el cirujano apoyándose, pecho, abdomen del conejo. El objetivo aquí es prevenir la regurgitación forzada del contenido abdominal. - Inyectar 2 mL de lidocaína (2% de solución stock) / bupivacaína (0,5% solución stock) (50/50 mezcla; de paso 2.4) por vía subcutánea a lo largo de la línea de incisión de cuello previsto para la anestesia local.
- Aerosol del sitio quirúrgico con betadine. Colóquese guantes limpios para procedimiento quirúrgico.
5. terminal cirugía (cosecha de buque)
- Preparar instrumentos y campo quirúrgico.
- Abrir un pack de paño limpio con un paño de mesa y cubre un papel para el conejo. Cubra la mesa de instrumentos.
- Abra el paquete de instrumentos, coloque sobre la tabla y arreglar instrumentos. Coloque los siguientes equipos en la tabla de instrumento: una jeringa de 20 mL y una aguja de 21G.
- Fije el cable de electrocauterio para el cobertor de conejo utilizando la pinza Kantrowitz 7,25". Conecte el enchufe a la unidad de electrocirugía y enciéndala.
- Llene una jeringa de 20 mL con solución salina estéril. Utilice esta solución salina según sea necesario para mantener la humedad de los tejidos expuestos durante el procedimiento.
- Coloque el cobertor de papel sobre el conejo y cortar un agujero en el paño sobre el sitio quirúrgico en el cuello del conejo. Fije las esquinas del agujero en lugar de piel de conejo con las abrazaderas de la toalla.
- Aislar las arterias carótidas comunes.
Nota: 2 x lupas quirúrgicas debe utilizarse para esta parte.- Cortar la piel con un electrocauterio a lo largo de la línea media que se extiende aproximadamente 7-9 cm cranially hacia la piel mandíbula y abrazadera abierta con abrazaderas de toalla.
Nota: Si la cosecha es sólo unos días después de la cirugía anterior, electrocauterio no es necesaria. Sólo se cortan las suturas y suavemente Abra la incisión de la cirugía anterior. - Hacer un corte lateral corto a través de la fascia con una electrocauterización en el extremo caudal. Luego inserte el corte tijeras grandes y sin rodeos disecar la fascia a lo largo de la línea media entera. Cortar la fascia disecada hacia abajo de la línea media con la electrocauterización.
- Con pequeñas tijeras de disección, disecar entre los músculos en forma de V (músculo sternocephalic) y el músculo esternocleidohioideo sobre la tráquea, para aislar las arterias carótidas comunes, empezando por el lado derecho.
- Disecar la arteria derecha libre de los tejidos de la base del cuello caudalmente hasta el cruce del nervio faríngeo cranially. Uso silicona quirúrgica lazos para ayudar en la contracción de la arteria durante la disección.
- Repita la disección en el lado izquierdo (pasos 5.2.3 - 5.2.4).
- Con una sutura de seda 3-0, ligar la arteria carótida común craneal al segmento que fue infundido con el vector (uso adventitial sutura colocada en la primera cirugía para localizar la medida craneal de la infusión de vector. Entonces ligar la carótida caudal a la arteriotomía reparada.
- Suprimir el segmento carotídeo entre las trompas e Irrigue el lumen con la solución salina. Recortar tejido adventitial exceso lejos del recipiente y cortar el segmento carotídeo en trozos más pequeños para los diferentes análisis de punto final (histología, ADN, ácido ribonucleico (ARN), proteínas, explante cultura, etcetera.).
- Inyectar 1 mL de Beuthanasia IV a eutanasia y confirmar la eutanasia del conejo.
- Cortar la piel con un electrocauterio a lo largo de la línea media que se extiende aproximadamente 7-9 cm cranially hacia la piel mandíbula y abrazadera abierta con abrazaderas de toalla.
- Deshágase de todo lo que tenía contacto con el vector o en el campo operativo, residuos de objetos punzantes y biológico apropiado siguiente protocolos.
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Representative Results
Para implementar este método con confianza, experimentos preliminares son necesarios para establecer que el operador logra a transferencia de genes eficientes y reproducibles, con expresión del transgen principalmente en las células endoteliales luminales. En nuestra experiencia, esto se calcula más fácilmente usando un vector que expresa la β-galactosidasa. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) tinción de segmentos de la carótida común quita 3 días después de la infusión del vector, así como medición de la β-galactosidasa mRNA (ARN mensajero) con cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa reacción (qRT-PCR), revelará la eficiencia, la reproducibilidad y la ubicación de las células transduced. Para los experimentos que investigar los efectos de la expresión del transgen o medir la actividad de elementos transcripcionales cis-acting, medimos normalmente transgénica mRNA como una indicación inicial del nivel y la reproducibilidad de la transferencia génica.
Un nuevo operador en nuestro laboratorio intentó establecer competencia con este método por transducción de conejo arterias carótidas comunes con un vector adenoviral (2 x 1011 vp/mL) expresan un transgen de β-galactosidasa, impulsado por un citomegalovirus (CMV) promotor. Las arterias transduced fueron cosechadas 3 días más tarde y se cortaron transversalmente en segmentos. Segmentos individuales eran entonces abierto corte axial o dejaron como anillos intactos. Todos los segmentos fueron manchada en tubos de microcentrífuga de X-gal. Segmentos que habían sido corte axial se colocaron sobre una superficie horizontal y la superficie luminal máximo expuesto, utilizando pernos según sea necesario para evitar que el segmento que se encrespa para arriba. Imágenes de la cara en las superficies luminales demostraron la coloración endotelial robusto con X-gal (figuras 3A y 3B). Imágenes axiales de las superficies luminales de anillos carótidas intactos demostraron la coloración sólo en la superficie luminal (figuras 3 y 3D) de X-gal. Los segmentos que se habían abiertos axialmente fueron procesados en parafina, seccionados y en teñidos con hematoxilina y eosina o rojo rápido nuclear. Imágenes de show gal X tinción principalmente en el endotelio, aunque existe una pequeña cantidad de coloración en la capa adventicial (Figuras 3E y 3F). Transducción de células adventitial podría ocurrir a través de fugas del vector a través del sitio de arteriotomía o por fuga a través de pequeñas ramas proximales a los sitios de ligadura de la rama de lado. 29
En un experimento separado, un nuevo operador intentó establecer competencia en alcanzar niveles reproducibles de transgene expresión, como un preludio a los experimentos para investigar la actividad biológica de los transgenes. Conejo, arterias carótidas comunes se transduced con adenovirus ayudante dependiente (2 x 1011 vp/mL) que contiene ya sea un apo A-I (HDAdApoAI) o transgén de la IL-10 (HDAdIL10), ambos bajo control de un promotor del CMV. Las arterias transduced fueron cosechadas 3 días después de transducción y cortan transversalmente en segmentos. Se extrajo RNA de los segmentos de vasos y apo-yo y expresiones de mRNA de IL-10 fueron cuantificadas por qRT-PCR, con la normalización a la deshidrogenasa de gliceraldehído 3-fosfato (GAPDH) mRNA en los mismos extractos (figura 4). En las arterias HDAdIL10-transduced, sólo 1 de cada 6 arterias tenían un apo muy bajos, pero detectable A-I señal de mRNA. Significa la expresión de apo A-I mRNA fue 700-fold mayor en los vasos transduced con HDAdApoAI que en los vasos transduced con HDAdIL10. Bajos niveles de ARNm endógeno de IL-10 fueron detectados en las arterias HDAdApoAI-transduced, con media expresión aumentada de 6-fold en HDAdIL10-transduced arterias. De la nota, hay intra y inter artery una variabilidad considerable en la eficiencia de la transducción de señales y expresión del transgén, tal como se muestra en las figuras 3 y 4, respectivamente. Nos encontramos con esta variabilidad incluso con operadores experimentados.
Figura 1 . Arteriotomía de la arteria carótida común. Pinzas finas se utilizan para sujetar la adventicia de la arteria carótida y aplique tracción ascendente a la arteria. Esta maniobra expande la luz del vaso y genera una superficie vertical en el cual se inserta la aguja de 19G doblada, reduciendo así el riesgo de perforar la pared posterior de la arteria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Cierre de la arteriotomía carótida común. La arteriotomía se cierra con una sutura de polipropileno 7-0, usando un patrón de X. El primer paso de la aguja y la sutura entra la luz de la arteria en la parte inferior derecha de la arteriotomía (sitio 1) y sale la luz en la parte inferior izquierda (sitio 2). La aguja y la sutura entonces cruzan la arteriotomía y volver a entrar la luz en la parte superior derecha (sitio 3). La aguja entonces sale a la luz en la parte superior izquierda (sitio 4). Tracción suave en ambos extremos de la sutura cierra la arteriotomía. Los extremos de la sutura (saliendo del sitio 1 y 4) se atan con nudos cuadrados 2. Los círculos grises representan sitios de suturas pasan a través de la pared del vaso. Rayas azules indican las áreas donde la sutura es fuera de la pared del vaso. Líneas azules punteadas indican las zonas donde la sutura es dentro de la luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Expresión del transgén endotelial eficiente. Arterias carótidas comunes del conejo fueron transduced con un vector adenoviral que expresan un transgen de β-galactosidasa y cosechados 3 días más tarde. Segmentos de arteria transduced fueron manchado como anillos intactos o después de ser abierto con un corte axial X-gal. (A-B) Imágenes de la cara en las superficies luminales de anillos carótidos que se cortaban axial. (C-D) Vista axial en el espacio luminal de anillos carótidos intactos. (E-F) X-gal manchado, parafina-encajado los carótida segmentos fueron seccionados y manchados en con (E) hematoxilina y eosina o rojo rápido nuclear (F). Barra de escala = 100 μm. I = intima; M = media; y = adventicia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Cuantificación de la expresión del mRNA del transgén. Arterias carótidas comunes del conejo fueron transduced con ayudante dependiente adenovirus expresa cualquier apo A-I (HDAdApoAI) o IL-10 (HDAdIL10) bajo control de un promotor del CMV. Las arterias se cosecharon 3 días más tarde. la expresión del mRNA del Apo (A)-I (B) IL-10 fuimos cuantificado por qRT-PCR, normalizado al mRNA de la GAPDH en la misma arteria y expresado en unidades arbitrarias (UA). Barra indica el valor medio; Valor de P es de rank-sum test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Ventajas | Desventajas | |
| En comparación con modelos de roedores | Más cercano filogenéticamente a los primates | Más caros de comprar y casa |
| Mayor diversidad genética, facilitando la traducción clínica | Más difícil de criar y manejar | |
| Los buques más grandes permite más fácil la manipulación quirúrgica y proporciona más tejido para el análisis cuantitativo | Requisitos reglamentarios más extensos | |
| Permite el uso de dispositivos endovasculares para los seres humanos | Menos fondos modificados genéticamente | |
| Menos amplia selección de anticuerpos frente a proteínas de conejo | ||
| En comparación con los modelos animales más grandes | Relativamente barato comprar y casa | Posiblemente menos clínicamente relevante que otros modelos animales grandes para algunas enfermedades vasculares |
| Fáciles de criar y manejar | ||
| En comparación con línea germinal transgénesis | Transgen expresado sólo en arterias grandes; efecto del transgen específicamente en el sitio de interés puede ser determinado | Aplicación del método a las células que no sean de endotelio es difícil |
| Puede utilizar la carótida contralateral como control pareado; elimina parámetros sistémicos (ej., presión arterial, nivel de colesterol) como variables incontroladas | Sala de operaciones y conocimientos quirúrgicos requeridos; probable que las instalaciones de la base no está disponible | |
| Un mayor rendimiento para las pruebas de actividad de secuencia reguladora de DNA en el endotelio de grandes vasos | No se puede expresar transgenes en lechos vasculares más | |
| Potencialmente más rápida y menos costosa | ||
| La exposición sistémica a la proteína transgénica improbable — minimiza los efectos off-target | ||
| En comparación con los enfoques de la terapia génica sistémica (por ejemplo. Transducción hepática mediante inyección en la vena periférica) |
Expresión transgénica más estable que la terapia sistémica gene (hígado) | Entrega de vectores requiere intervención quirúrgica |
| Transgén en la pared arterial, permitiendo la entrega local de altos niveles de la proteína transgénica | Sala de operaciones y experiencia quirúrgica necesaria | |
| La exposición sistémica a la proteína transgénica improbable — minimiza los efectos off-target | Tratamiento que se limita a las arterias que son específicamente para la intervención; no tratar factores sistémicos (e.g., lípidos) | |
| Puede utilizar la carótida contralateral como control pareado; elimina parámetros sistémicos (por ejemplo, la presión arterial, nivel de colesterol) como variables incontroladas | ||
| Mucho menor dosis del vector requeridas |
Tabla 1. Ventajas y desventajas de modelo de transferencia de conejo común de la arteria carótida genes endoteliales selectiva.
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Discussion
Ciertos aspectos de la técnica quirúrgica merecen especial atención. Exposición completa y movilización de la arteria carótida común mediante disección cuidadosa voluntad de facilitar la transferencia y arteriotomía reparación de gen. Sin embargo, durante la disección, debe reducirse la manipulación directa de la arteria carótida para prevenir el vasoespasmo. Además, cualquier hemorragia adyacente a la arteria debe ser detenido mediante la aplicación de ligera presión con una gasa y sangre extravasada debe ser limpiada inmediatamente enjuagando el área con solución salina normal. También es importante evitar dañar el nervio vago, que corre paralelo a la arteria carótida común. Recorte de la adventicia en la zona de la arteriotomía prevista ayudará al operador realizar una arteriotomía limpio y funcional y a la reparación de la arteriotomía. Finalmente, ramas de la arteria carótida común deben ser identificados y bien ligadas para evitar la fuga del vector desde el lumen de la carótida.
También son aspectos críticos de la infusión de vector y la reparación de la arteriotomía. Durante la infusión del vector, es importante la carótida común calibre fisiológica o levemente superior para lograr eficiente transducción se dilatan. Cuando la reparación de la arteriotomía, la sutura debe penetrar la pared del vaso lo más cerca posible de los bordes de la arteriotomía y debe limpiamente entrar y salir a la luz en lugar de pasa axialmente a través de la pared del vaso. Si sólo las capas externas de la pared del vaso se tiraron juntos porque la sutura pasa axialmente a través de la pared del vaso en lugar de pasar radialmente a través de la pared y entrar la luz, seguirá siendo una brecha en la íntima y la aumentará el riesgo de trombosis. Si las penetraciones de sutura son también ampliamente espaciadas, o si la sutura se aprietan cuando está atado, pliegues de tejido se creará en el sitio de arteriotomía. Estos pliegues interrumpen el flujo sanguíneo laminar normal, también aumenta el riesgo de trombosis. Manteniendo las características de flujo constante es importante para los experimentos realizados en modelos animales de enfermedades (por ej., ateroesclerosis) porque flujo alterado puede contribuir a la enfermedad proceso30.
Nuevos operadores a menudo encontrarán arterias trombosadas en la cosecha. Trombosis luminal es una complicación devastadora, representación la arteria inutilizable como una muestra experimental. Para prevenir la trombosis, habitualmente administrar heparina IV antes de la transferencia de genes. Trombosis es también prevenida por cuidado de cierre de la arteriotomía, como se describe anteriormente. Podría aumentar la dosis de heparina para prevenir la trombosis, o aspirina podría darse después de la operación. Sin embargo, una dosis mayor de heparina también aumentaría las posibilidades de complicaciones hemorrágicas, y aspirina podría interferir con extremos experimentales, especialmente si la inflamación se está estudiando. Por lo tanto, es preferible centrarse en la mejora técnica quirúrgica como medio para prevenir la trombosis.
Si manipulado demasiado vigorosamente, arterias carótidas pueden sufrir espasmos, que también podrían contribuir a la trombosis por la disminución de flujo. Si se encuentra el vasoespasmo, pueden aliviarse mediante la aplicación de tópicos de la papaverina. Cuando buque cosechas están previstas para más de 2-3 días después de la transducción de señales, y la trombosis es una preocupación, puede utilizarse ultrasonido transcutáneo no invasor evaluar permeabilidad del vaso. Descubrimiento de arterias trombosadas puede conducir a la eutanasia para ahorrar en los costos de la vivienda. Animales adicionales pueden estar inscritos puntualmente, para llenar grupos experimentales. Peri y post intervention mortalidad asociada con este método debe ser < 1% (es decir., no diferentes de mortalidad asociada a otras cirugías realizadas en conejos sanos)31.
Después de que un operador se encuentre cómodo con los aspectos técnicos del protocolo quirúrgico, la capacidad de realizar transferencia eficaz de genes a las necesidades del endotelio para verificar, usando el enfoque descrito en la sección anterior en resultados representativos. Si surgen problemas con el logro de transferencia genética reproducible, el culpable es probable que en una de las dos áreas. Después de que el recipiente está aislado y se lava la sangre de la luz, es importante eliminar el tampón de lavado DMEM para que no se diluye la solución infundida vector durante la transducción de señales. El otro aspecto importante es dilatar el vaso al calibre fisiológica o ligeramente mayor durante la infusión de vector. Porque, en nuestra experiencia, una arteria carótida que no está completamente dilatada o no permanece dilatado durante la infusión de 20 minutos confiablemente tiene expresión transgen baja, es probable que la distensión de la arteria al calibre fisiológico mejora la transducción eficiencia. Sin embargo, nunca estudiamos esto sistemáticamente. Es posible que aumentando la presión de infusión por encima de los niveles fisiológicos podría aumentar la eficiencia de la transducción de señales y también permite mayores niveles de transducción de las células en los medios vasculares. Sin embargo, disrupción de la barrera endotelial probablemente dañar el barco y aumentar el riesgo de trombosis. Si el buque no permanece dilatado durante 20 minutos todo vector-incubación, es probable que el vector está goteando desde las ramas de la arteria carótida común. Tenga cuidado durante la disección para identificar y ligar las ramas para evitar la fuga del vector desde el lumen de la carótida.
Este método tiene varias limitaciones que están relacionadas con el uso de conejos. Los conejos son menos costosos albergar y alimentar a otros grandes animales (perros, cerdos, ovejas); sin embargo, los costos de compra, vivienda, alimentación y conejos son considerablemente más para ratones y ratas. Las instalaciones de sala de operaciones y los requerimientos regulatorios para cirugías de conejo también son mucho más extensos que para los roedores. Además, es necesario conocimientos técnicos considerables para realizar eficazmente el protocolo de transferencia de genes quirúrgicos. Estos conocimientos pueden ser adquiridos por los operadores que no han tenido ninguna formación quirúrgica. Por lo menos 2 personas en nuestro grupo (incluyendo al principal autor de este manuscrito) hayan aprendido las técnicas quirúrgicas y aplicado productivamente. Sin embargo, se necesitan formación meticulosa y una validación cuidadosa de la eficacia de la transferencia de genes y la reproducibilidad (como se describe en la sección de resultados representativos) de un operador antes de que el operador puede comenzar a generar datos de alta calidad.
Confinamiento de transgene expresión casi exclusivamente al endotelio con este método29,32,33,34,35,36,37 es útil ya que permite la investigación de los efectos del transgén en las células endoteliales y la medición de actividad cis-acción reguladoras de secuencias de ADN en las células endoteliales. Un pequeño número de células adventicial o intermedios puede ser transduced; sin embargo, la incapacidad de este método para transducir eficazmente las células nonendothelial impide la aplicación del método al estudio de otros tipos de células de la pared vascular (como las células musculares lisas y macrófagos). Aunque la sobreexpresión de proteínas secretadas de las células endoteliales transduced puede permitir la investigación de los efectos de estas proteínas en otras células vasculares tipo, las funciones de las proteínas no secretadas en estos otros tipos de células vasculares (ej. los receptores o proteínas implicadas en la transducción de señal) no puede ser investigada con este método.
Como un medio para probar la terapia del gene orientada en la pared de la arteria, el método difiere de otros métodos preclínicas de dos maneras principales. En primer lugar, el método utiliza un modelo de conejo para en vivo pruebas de terapia genética en lugar de más utilizados modelos de roedores8,12,15,38,39. El uso de conejos permite evaluación de la expresión del transgen y el papel biológico del producto transgen en un modelo animal exogámica, que es más representativo de la diversidad genética humana que son roedores endogámicas. El modelo puede utilizarse para evaluar la terapia génica en cualquiera de los dos arterias normal de conejo o en arterias de conejo que tienen patología arterial que es similar a ése encontrado en arterias humanas enfermas. Arterias de conejo también están más cercanos en tamaño de arterias humanas que son arterias roedores y mucho más tejido para análisis de las arterias roedores. La segunda diferencia importante es que este método utiliza un enfoque quirúrgico para ofrecer vector del transgen al endotelio vascular. Terapia génica somática a menudo entrega sistémica, más frecuentemente al atacar el hígado con el objetivo de alterar niveles del plasma del transgen proteína25,40. Al atacar el endotelio vascular, el método provee el producto del transgen terapéutico localmente, con su pico de concentración dentro de la pared de la arteria, precisamente donde es necesario para el tratamiento de la enfermedad vascular. Entregando el transgen sólo localmente, el método también elimina los efectos secundarios sistémicos del producto transgénico. Otros grupos están desarrollando métodos utilizando péptidos, anticuerpos u otras modificaciones de la cápside para apuntar vectores sistémicamente a inyectadas al endotelio sano o enfermo para proporcionar terapia de gen vascular local41,42 , 43. sin embargo, estos métodos de focalización siguen en desarrollo y todavía son complicados por transducción sistémica importante, especialmente en el hígado42,43,44. Nuestro método quirúrgico proporciona una precisa y eficiente introducción de transgenes en el endotelio vascular con mínima - si alguna - transducción de señales en otros lugares. 1 el método es también más conveniente, eficiente y mayor-a lo largo de media (en comparación con línea germinal transgénesis o inyección sistémica de vectores endoteliales dirigido) para probar la actividad de secuencias reguladoras del ADN en el vaso grande endotelio, para función de la proteína transgénica prueba en la pared arterial y para las pruebas de terapia génica orientada de pared vaso.
Este método permite la investigación de la función biológica de cualquier transgén, cuando se expresa en el endotelio de arterias grandes. Si modifica a reactivos expresa pérdida de función como dominantes negativo receptores u horquilla corto RNA, permitiría la investigación de las funciones de proteínas endógenas endoteliales y vías de señalización. El método también puede ser utilizado para medir la actividad transcripcional de cualquier secuencia de ADN de cis-acción en las células endoteliales de arteria grande5,6,7. Además, el método permite realizar pruebas de cualquier tipo de vector de transferencia génica para la eficiencia y seguridad en la entrega localmente al endotelio y revelará la capacidad del vector para lograr la expresión del transgen resistente. Por último, el método permite desarrollo y pruebas de combinaciones de vectores y los transgenes que están diseñados para ofrecer la terapia génica orientada en la pared vascular. El método podría servir como una herramienta de detección para identificar genes terapéuticos que podrían en el futuro-entregarse al endotelio de arterias grandes todas (o todas las arterias grandes enfermas) inyectado por vía percutánea vasculares vectores dirigidos a pared. Debido a inmunidad preexistente en los seres humanos a adenovirus tipo 545, va ser difícil utilizar base de 5 vectores de adenovirus tipo en aplicaciones clínicas. Ingeniería de la cápside del adenovirus 5, el uso de alternativas adenovirus serotipos46, o el uso de vectores menos inmunogénica como AAV puede requerir para hacer terapia génica vascular de la clínica. Como una herramienta experimental, sin embargo, somos inconscientes de cualquier vector que puede competir con el ayudante dependiente adenovirus 5 para lograr la expresión del transgen eficiente y durable en los vasos sanguíneos1.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a instantáneo, Inc. permiso utilizar reactivos HDAd, Julia Feyk para asistencia administrativa y los servicios veterinarios del Departamento de medicina comparada quirúrgica asesoramiento y apoyo. Este trabajo fue apoyado por HL114541 y la confianza caritativa de John L. Locke, Jr..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery |
| 1mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery |
| 20mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24G x 3/4" | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery only |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | For 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4" x 4" | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | Gene transfer surgery only |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery only |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | Gene transfer surgery only |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | Gene transfer surgery only |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | Gene transfer surgery only |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 05098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine HCl, 2% | Pfizer | 00409427702 | |
| Bupivacaine HCl, 0.5% | Pfizer | 00409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | Gene transfer surgery only |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | 2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | Gene transfer surgery only |
| Fentanyl patch, 25 mcg/hr | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Gene transfer vector | Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | Gene transfer surgery only |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | Gene transfer surgery only |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | Gene transfer surgery only |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | Gene transfer surgery only |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | 2x for gene transfer surgery only | |
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Forced air warming unit | 3M | Bair Hugger Model 505 | Gene transfer surgery only |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | Needs ~16x magnification |
References
- Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
- Falkenberg, M., et al. Increased expression of urokinase during atherosclerotic lesion development causes arterial constriction and lumen loss, and accelerates lesion growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 10665-10670 (2002).
- Schneider, D. B., et al. Expression of Fas ligand in arteries of hypercholesterolemic rabbits accelerates atherosclerotic lesion formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 298-308 (2000).
- Du, L., Dronadula, N., Tanaka, S., Dichek, D. A. Helper-dependent adenoviral vector achieves prolonged, stable expression of interleukin-10 in rabbit carotid arteries but does not limit early atherogenesis. Hum Gene Ther. 22, 959-968 (2011).
- Dronadula, N., et al. Construction of a novel expression cassette for increasing transgene expression in vivo in endothelial cells of large blood vessels. Gene Ther. 18, 501-508 (2011).
- Dronadula, N., Wacker, B. K., Van Der Kwast, R., Zhang, J., Dichek, D. A. Stable In Vivo Transgene Expression in Endothelial Cells with Helper-Dependent Adenovirus: Roles of Promoter and Interleukin-10. Hum Gene Ther. 28, 255-270 (2017).
- Dong, G., Schulick, A. H., DeYoung, M. B., Dichek, D. A. Identification of a cis-acting sequence in the human plasminogen activator inhibitor type-1 gene that mediates transforming growth factor-b1 responsiveness in endothelium in vivo. J Biol Chem. 271, 29969-29977 (1996).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
- Zeng, Z., et al. Hemodynamics and anatomy of elastase-induced rabbit aneurysm models: similarity to human cerebral aneurysms. AJNR Am J Neuroradiol. 32, 595-601 (2011).
- Macdonald, R. L., Wallace, M. C., Montanera, W. J., Glen, J. A. Pathological effects of angioplasty on vasospastic carotid arteries in a rabbit model. J Neurosurg. 83, 111-117 (1995).
- Nakai, K., Numaguchi, Y., Moritani, T. Vasospasm model of a rabbit common carotid artery for endovascular research. Acad Radiol. 9, 270-275 (2002).
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Baumgartner, C., Brandl, J., Munch, G., Ungerer, M. Rabbit models to study atherosclerosis and its complications - Transgenic vascular protein expression in vivo. Prog Biophys Mol Biol. 121 (2), 131-141 (2016).
- Wang, K., et al. Three-Layered PCL Grafts Promoted Vascular Regeneration in a Rabbit Carotid Artery Model. Macromol Biosci. 16 (4), 608-618 (2016).
- Schachner, T., Laufer, G., Bonatti, J. In vivo (animal) models of vein graft disease. Eur J Cardiothorac Surg. 30, 451-463 (2006).
- Dornas, W. C., Oliveira, T. T., Augusto, L. E., Nagem, T. J.
- Graur, D., Duret, L., Gouy, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379 (6563), 333-335 (1996).
- Yanni, A. E. The laboratory rabbit: an animal model of atherosclerosis research. Lab Anim. 38, 246-256 (2004).
- Miao, C. H., et al. Inclusion of the hepatic locus control region, an intron, and untranslated region increases and stabilizes hepatic factor IX gene expression in vivo but not in vitro. Mol. Ther. 1, 522-532 (2000).
- Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
- Schlaeger, T. M., et al. Uniform vascular-endothelial-cell-specific gene expression in both embryonic and adult transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3058-3063 (1997).
- Cowan, P. J., et al. Targeting gene expression to endothelial cells in transgenic mice using the human intercellular adhesion molecule 2 promoter. Transplantation. 62 (2), 155-160 (1996).
- Sehara, Y., et al. Persistent Expression of Dopamine-Synthesizing Enzymes 15 Years After Gene Transfer in a Primate Model of Parkinson's Disease. Hum Gene Ther Clin Dev. 28, 74-79 (2017).
- Tangirala, R. K., et al. Regression of atherosclerosis induced by liver-directed gene transfer of apolipoprotein A-I in mice. Circulation. 100, 1816-1822 (1999).
- Benoit, P., et al. Somatic gene transfer of human ApoA-I inhibits atherosclerosis progression in mouse models. Circulation. 99, 105-110 (1999).
- Raper, S. E., et al. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Mol Genet Metab. 80, 148-158 (2003).
- Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37, 316-327 (2017).
- Brunetti-Pierri, N., et al. Transgene expression up to 7 years in nonhuman primates following hepatic transduction with helper-dependent adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 24, 761-765 (2013).
- Rome, J. J., et al. Anatomic barriers influence the distribution of in vivo. gene transfer into the arterial wall. Modeling with microscopic tracer particles and verification with a recombinant adenoviral vector. Arterioscler Thromb. 14, 148-161 (1994).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Lab Invest. 85, 9-23 (2005).
- Brodbelt, D. Perioperative mortality in small animal anaesthesia. Vet J. 182, 152-161 (2009).
- Schulick, A. H., Dong, G., Newman, K. D., Virmani, R., Dichek, D. A.
- Vassalli, G., Agah, R., Qiao, R., Aguilar, C., Dichek, D. A. A mouse model of arterial gene transfer. Antigen-specific immunity is a minor determinant of the early loss of adenovirus-mediated transgene expression. Circ Res. 85, 25-32 (1999).
- Schneider, D. B., Fly, C. A., Dichek, D. A., Geary, R. L. Adenoviral gene transfer in arteries of hypercholesterolemic nonhuman primates. Hum Gene Ther. 9, 815-821 (1998).
- Newman, K. D., et al. Adenovirus-mediated gene transfer into normal rabbit arteries results in prolonged vascular cell activation, inflammation, and neointimal hyperplasia. J Clin Invest. 96, 2955-2965 (1995).
- Jiang, B., et al. Helper-dependent adenovirus is superior to first-generation adenovirus for expressing transgenes in atherosclerosis-prone arteries. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31, 1317-1325 (2011).
- Gruchala, M., et al. Gene transfer into rabbit arteries with adeno-associated virus and adenovirus vectors. J Gene Med. 6, 545-554 (2004).
- Lee, Y. T., et al. Mouse models of atherosclerosis: a historical perspective and recent advances. Lipids Health Dis. 16, 12 (2017).
- Manning, M. W., Cassi, L. A., Huang, J., Szilvassy, S. J., Daugherty, A. Abdominal aortic aneurysms: fresh insights from a novel animal model of the disease. Vasc Med. 7, 45-54 (2002).
- Lai, C. H., et al. Recombinant adeno-associated virus vector carrying the thrombomodulin lectin-like domain for the treatment of abdominal aortic aneurysm. Atherosclerosis. 262, 62-70 (2017).
- Tan, P. H., et al. Antibody targeted gene transfer to endothelium. J Gene Med. 5, 311-323 (2003).
- Nicklin, S. A., White, S. J., Nicol, C. G., Von Seggern, D. J., Baker, A. H. In vitro and in vivo characterisation of endothelial cell selective adenoviral vectors. J Gene Med. 6, 300-308 (2004).
- White, K., et al. Engineering adeno-associated virus 2 vectors for targeted gene delivery to atherosclerotic lesions. Gene Ther. 15, 443-451 (2008).
- Kaliberov, S. A., et al. Retargeting of gene expression using endothelium specific hexon modified adenoviral vector. Virology. 447, 312-325 (2013).
- Schulick, A. H., et al. Established immunity precludes adenovirus-mediated gene transfer in rat carotid arteries. Potential for immunosuppression and vector engineering to overcome barriers of immunity. J Clin Invest. 99, 209-219 (1997).
- Hollingdale, M. R., Sedegah, M., Limbach, K. Development of replication-deficient adenovirus malaria vaccines. Expert Rev Vaccines. 16, 261-271 (2017).
