Summary
Ratones representan un modelo inestimable en vivo para el estudio de la infección y las enfermedades causadas por microorganismos gastrointestinales. Aquí, describimos los métodos utilizados para estudiar la colonización bacteriana y cambios histopatológicos en modelos de ratón de Helicobacter pylori-relacionados con la enfermedad.
Abstract
Helicobacter pylori es un patógeno gástrico que está presente en la mitad de la población mundial y es una causa significativa de morbilidad y mortalidad en los seres humanos. Varios modelos de ratón de la infección gástrica por Helicobacter se han desarrollado para estudiar los mecanismos moleculares y celulares por el H. pylori bacterias colonizan el estómago de los ejércitos humanos y causan enfermedad. Adjunto, describimos protocolos: 1) preparar suspensiones bacterianas de la infección en vivo de ratones mediante sonda intragástrica; 2) determinar los niveles de colonización bacteriana en el tejido gástrico de ratón, por reacción en cadena de polimerasa (PCR) y recuento de viables; y 3) evaluar los cambios patológicos, por la histología. Establecer Helicobacter infección en ratones, animales libres de patógenos específicos de (SPF) primero son inoculados con suspensiones (contiene ≥ 105 unidades formadoras de colonias, UFC) de cepas de ratón-colonización de o Helicobacter pylori o otros gástrico Helicobacter spp. de animales, tales como Helicobacter felis. En lo puntos apropiados del tiempo post-infección, estómagos son suprimidos y disecados sagittally en dos fragmentos de tejido iguales, cada uno compuesto por las regiones de antro y cuerpo. Uno de estos fragmentos entonces se utiliza para conteo de viables o la extracción de ADN, mientras que el otro se sujeta a procesamiento histológico. Colonización bacteriana y cambios histopatológicos en el estómago pueden evaluarse rutinariamente en secciones de tejido gástrico teñidas con tintes Warthin-Starry de tinción Giemsa o hematoxilina y eosina (H & E), según corresponda. Análisis inmunológicos adicionales también podrán ser efectuados por inmunohistoquímica o inmunofluorescencia en secciones de tejido gástrico de ratón. Los protocolos se describen a continuación están diseñados para posibilitar la evaluación en los ratones de patologías gástricas en humanos relacionadas con H. pylori que se asemejan a las enfermedades, incluyendo inflamación, atrofia de la glándula y la formación del folículo linfoide. La preparación del inóculo y protocolos mediante sonda intragástrica también pueden ser adaptados para el estudio de la patogenia de otros patógenos entéricos humanos que colonizan ratones, tales como Salmonella Typhimurium o Citrobacter rodentium.
Introduction
Helicobacter pylori es un patógeno gástrico en forma de espiral, Gram-negativo, humano presente en todas las poblaciones en todo el mundo, con tasas de infección en países en desarrollo que se estima en el orden de 80%1. Aunque la mayoría H. pylori-individuos infectados son asintomáticos, algunos desarrollan enfermedades más severas, entre ulceración péptica y cáncer gástrico2. H. pylori-cánceres asociados ampliamente se caracterizan por la formación de tejidos linfoides extra nodales en el estómago, dando como resultado adenocarcinoma gástrico o asociado a mucosa linfoide o cambios malignos en las células epiteliales (GECs) linfoma de tejido (Malta), respectivamente. H. pylori está altamente adaptado para sobrevivir en el nicho ecológico áspero del estómago debido a la presencia de diversos factores de virulencia y mecanismos que facilitan su adherencia, el crecimiento y el metabolismo en este nicho. En particular, las cepas virulentas de H. pylori poseen el 40 kb cag isla de patogenicidad (cagPAI) que codifica aproximadamente 30 genes necesarios para la producción de un tipo 4 secreción sistema (T4SS)3,4 . CAG PAI-positivo las cepas de H. pylori se asociado con la inducción de niveles más altos de inflamación crónica en la hostia, que se ha implicado como un precursor esencial de adenocarcinoma gástrico5.
En vivo los modelos animales, especialmente ratones, han sido altamente informativos por permitiendo a los investigadores a investigar las contribuciones relativas de host, factores bacterianos y ambientales en la infección por H. pylori y enfermedad resultado6. Los estudios han demostrado previamente que prolongada H. pylori infección de ratones en los resultados de genética de C57BL/6 en el desarrollo de gastritis crónica y de las glándulas se atrofian, ambas características distintivas del H. pylori infección7. Además, la infección con la especie bacteriana relacionada canino/felino, H. felis, se ha demostrado para inducir la formación de Malta en ratones con patología similar y progresión de la enfermedad en humanos MALT linfoma8,9. Los más comúnmente utilizados de H. pylori aislado en los estudios de colonización de ratón es la "cepa 1 de Sydney" (SS1) cepa10, cagPAI+ pero una T4SS no funcional (T4SS−)11. Otras cepas usadas incluyen H. pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 y X47-2AL (cagPAI–/T4SS−)13. Para las infecciones de H. felis , la cepa CS1 ("gato espiral 1, cagPAI–/T4SS−) es generalmente usado14.
Aquí proporcionamos un protocolo que describe la preparación de inóculos de Helicobacter infección en vivo , el procedimiento para sonda intragástrica de ratones, así como métodos para el procesamiento de tejidos para el estudio de los cambios histopatológicos en el estómago. En particular, este artículo se centrará en los métodos histológicos utilizados para visualizar la colonización bacteriana y evaluar cambios histopatológicos, incluyendo formación de Malta, en la mucosa gástrica de ratones infectados. Algunos de los métodos aquí descritos se pueden adaptadas al estudio de otros patógenos intestinales como S. Typhimurium o C. rodentium.
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Protocol
1. crecimiento y preparación de inóculos bacterianos
- Descongelar las existencias de glicerol de H. pylori o H. felis15 de-80 ° C y el subcultivo en placas de agar sangre (HBA) de caballo compuesto por: Base de Agar sangre No.2 (véase Tabla de materiales); la "Suplemento selectivo antibiótico de Skirrow" (compuesto por vancomicina, 10 μg/mL; polimixina B, 25 ng/mL, trimetoprim, 5 μg/mL, anfotericina B, 2.5 μg/mL); y 5 a 10% (v/v) caballo sangre15,16. Las bacterias crecen bien en condiciones de microaerobic de 2.5 o 3.5 L jarras anaeróbicas que contiene los paquetes de gas apropiada (véase Tabla de materiales), a 37 ° C.
Nota: Las cepas de H. pylori crecidas bajo estas condiciones deben subcultivadas después de 1 a 1,5 días de incubación, mientras que para H. felis, es generalmente requiere al menos 2 días de incubación. Medios de cultivo y almacenamiento apropiados se han descrito en detalle previamente15. -
Preparar inóculos bacterianos para la infección del ratón de culturas de principios a mediados la fase logarítmica. Cosecha de bacterias suavemente de las placas de agar por inundaciones cada placa con 1 – 2 mL de caldo de cerebro corazón infusión (BHI). Aspire suspensiones de placas con Pipetas Pasteur.
- Por otra parte, preparar inóculos de bacterias Helicobacter que se han propagado en caldo BHI para 16 – 18 h15. En este caso, recoger las bacterias por centrifugación a baja velocidad a 2.200 x g por 10 min a 4 ° C.
- Evaluar la viabilidad y la motilidad de las bacterias mediante el examen de preparaciones de preparación microscópica en fresco bajo microscopio de contraste de fase (objetivo de 100 X). Preparar montajes húmedos resuspender un asa llena de bacterias en una gota de 10-20 μL de BHI caldo en un portaobjetos de vidrio. En el caso de H. felis, que es una bacteria mucho más grande que H. pylori, utilizar un hemocitómetro para contar exactamente el número de bacterias viables. Confirmar la pureza de la cultura mediante la realización de una tinción de Gram.
Nota: Use solamente inóculos de H. pylori si la mayoría de las bacterias tiene forma bacilar o espiral (la morfología puede variar dependiendo de la cepa). H. felis inóculo debe contener principalmente bacterias con forma helicoidal. No utilizar inóculos si la mayoría de las bacterias tiene una morfología cocoide, como estas formas no son viables y no establecer una infección en ratones. -
Estimar el número de bacterias en el inóculo al contar bajo el microscopio de contraste de fase el número aproximado de bacterias por campo (objetivo de 100 X) y usando la siguiente guía: 1 bacteria por campo = aproximadamente 10 (unidades formadoras de colonias)6 UFC) de Helicobacter/ml; 10 bacterias por campo = aproximadamente 107 UFC/mL; 100 bacterias por campo = aproximadamente 108 UFC/mL, etc.
- Al utilizar un hemocitómetro, calcular UFC/mL con la siguiente fórmula:
UFC/mL = (promedio de bacterias en un campo de 4 x 4) x (factor de dilución) x (104).
- Al utilizar un hemocitómetro, calcular UFC/mL con la siguiente fórmula:
-
Ajustar la densidad de la célula bacteriana del inóculo a aproximadamente 107– 108 UFC/mL por dilución en caldo BHI, si es necesario.
- Para garantizar la máxima viabilidad bacteriana, utilizar inóculos para gástrico por sonda nasogástrica tan pronto como sea posible después de la preparación.
- Confirme siempre la densidad celular de H. pylori y la viabilidad realizando conteo viable del inóculo inmediatamente después del procedimiento de la sonda (véase abajo). Esto no siempre es posible para el H. felis, como no generalmente forma colonias aisladas en medios de cultivo. El número de viables s de Helicobacteren inóculos no puede determinarse por medición de densidad óptica (A600) solo que este método no discrimina entre viable (es decir, bacilar/espiral/helicoidal) y no viables ( es decir, cocoides) bacterias.
- Utilizar valores de densidad óptica como un medio para estimar el número de viables de H. pylori bacterias en los inóculos, pero en este caso, es necesario primero generar una curva de crecimiento. Para ello, los valores de600 A de cultivos de H. pylori son monitoreados en el tiempo y correlacionan directamente contra el número de bacterias viables, determinados por el recuento de placa.
Nota: Un método práctico para realizar esas determinaciones de la curva de crecimiento es para cultivar bacterias en medio líquido (sección 1.2), uso de frascos de cultivo de tejidos de fondo plano estándar colocados en una incubadora 10% CO2 . El número de UFC, determinado a partir de alícuotas de los cultivos obtenidos cada 4 – 6 h durante 2-3 días, luego se comparan con las correspondientes A valores de600 17. Lo importante, las curvas de crecimiento deben generar para cada cepa de H. pylori , como éstos pueden crecer a ritmos diferentes y, además, no todas las cepas crecen bien en 10% CO2.
2. gástrico por sonda nasogástrica de ratones con Helicobacter
Nota: Este método de sonda balon puede ser aplicado a otras especies bacterianas que colonizan el intestino por ejemplo S. TyphimuriumC. rodentium, Listeria monocytogenes.
- Use 6-8 semanas de edad, específica libre de patógenos (SPF) y Helicobacter-libre de ratones machos o hembras. Utilizar animales con un fondo genético C57BL/6 para experimentos de infección con H. pylori o H. felis. En el presente estudio, se utilizó el tipo salvaje (WT) y genéticamente ratones C57BL/6 falta un clave natural inmune del receptor (llamado knock-out o KO animales).
Nota: Pueden utilizarse también ratones en otros contextos genéticos portadores de Helicobacter infecciones, sin embargo, niveles de colonización y de la severidad de la enfermedad pueden ser afectados por el tipo de host fondo18,19. - Aspire el inóculo bacteriano (paso 1.5) en jeringas desechables de 1 mL y reemplazar las agujas suministradas con 23 agujas del calibrador sobre el cual son catéteres de polietileno desechable colocado (longitud, 6 a 8 cm; diámetro interior, 0,58 mm). Fijar los catéteres a las agujas mediante la aplicación de pequeñas tiras de plástico (véase Tabla de materiales) de la película. Alternativamente, reemplace el montaje de la aguja/catéter utilizando alimentación de tubos de plástico estéril (x 38 de calibre 20 mm).
- Físicamente restringir ratones con un agarre firme en el pescuezo del cuello y la cola.
Nota: Este procedimiento puede realizarse sin anestesia, o bien, con el uso de un anestésico inhalado, en como metoxiflurano o isoflurano15. - Inserte el catéter en el centro de la mandíbula abierta y guía en dirección caudal hacia el esófago. Extender el cuello del ratón para permitir la facilidad de acceso al estómago a través del esófago (y de la tráquea) hasta la mayor parte o todo del catéter ya no es visible y se siente una resistencia, correspondiente a la base del estómago. Entregar una alícuota específica, generalmente de 100 μL por inoculación (figura 1).
Nota: Ratones deben ser gavaged con ≥ 105 CFU para asegurar óptima colonización y enfermedad patología. - Ratones de la casa en un centro de animales SPF para la duración del experimento.
Nota: Patología severa y adenocarcinoma en ratones WT C57BL/6 sólo se observa en aproximadamente post-infección20 24 meses. Sin embargo, este efecto puede ser acelerado en algunos animales genéticamente modificados, o en ratones con otros fondos genéticos. - Sobre la terminación del procedimiento por sonda nasogástrica, realizar una modificación de la técnica de Miles y Misra a determinar el número de viables de H. pylori bacteria administrada a los ratones. Para esto, el inóculo se diluye en serie (de 10−1 a 10−5) en BHI empleando el método descrito en detalle previamente15.
Nota: Para asegurar el aislamiento de colonias individuales, placas HBA deben ser calentadas y secadas en una incubadora de gabinete o 37 ° C de seguridad biológica para 10 – 15 min antes de usar.
3. recolección de tejidos en ratones post-experimento
- Eutanasia a ratones ya sea por inhalación de dióxido de carbono o la dislocación cervical, según el Comité de ética pertinentes para la experimentación animal.
- Abrir la cavidad abdominal y suprimir el estómago con unas tijeras finas, curvas.
Nota: También se puede recoger Sera por punción cardiaca para ayudar en la investigación de las respuestas sistémicas a la infección por Helicobacter . Además, la colección de bazos y paragastric nodos de linfa son útiles en el estudio de respuestas inmunes adaptativas. - Cortar el estómago a lo largo de la curvatura mayor y retirar restos de alimentos suave lavado en tampón de fosfato estéril salina (PBS) en un tubos de 50 mL.
- Lavar el estómago otra vez en PBS estéril y luego registrar el peso húmedo de Petri plástico tarado 6 cm.
- Aplanar el estómago y diseccionar sagittally en dos fragmentos de tejido iguales, cada uno compuesto por: antro, cuerpo y regiones no glandulares forestomach (figura 2). Quitar la región no glandular y pesan una media de cada uno del estómago antes de agregar a ambos 1 mL de BHI estéril (para el recuento de viables) o complemento de congelación en nitrógeno líquido (para la extracción de ADN/ARN).
Nota: Tubos que contienen tejido en BHI deben ser conservados en hielo hasta que están listos para ser procesados. Los tejidos del estómago congelado rápido pueden utilizarse también para extraer ARN o proteínas para qPCR (PCR cuantitativa) o los análisis western blot, respectivamente. - Añadir el otro estómago a un tubo de 15 mL que contenga formol al 10%. Sumergir los tejidos en formalina al 10% durante 10 s y luego a la parte superior de los tubos. Permitir que los tejidos reparar antes de volver a sumergir en solución de formalina al 10% durante un mínimo de 24 h.
Nota: Los tejidos pueden permanecer en formalina al 10% durante varias semanas antes del procesamiento para histología. Un almacenamiento prolongado del tejido, sin embargo, afecten su arquitectura o antigenicidad dando lugar a resultados subóptimos en análisis posteriores.
4. confirmación de la colonización bacteriana en el estómago la post-infección
-
Recuento viable de H. pylori en el estómago
- Suplemento estériles placas HBA con antibióticos adicionales (200 μg/mL bacitracina y ácido nalidíxico de 10 μg/mL) antes de realizar recuentos de colonias de ratón infectado estómagos16.
- Homogeneizar las secciones del estómago ya sea manualmente, usando micropestles polipropileno autoclavables, o con un instrumento de disociación mecánica (véase Tabla de materiales).
- Preparar diluciones seriadas duplicadas (10−1 a 10−2) de los homogenados gástrica resultante en BHI estéril.
Nota: Las diluciones deben decidir basado en las cargas bacterianas típicas obtenidas para una determinada H. pylori cepa utilizada para la infección, así como la duración de la infección. También pueden utilizarse sin diluir las muestras. - Previamente secadas placas HBA (ver nota anterior) se dividen en tres o cuatro segmentos. Utilizando una adaptación de la técnica de Miles y Misra, añadir 10 – 100 mL de cada dilución en un segmento de la placa de agar y difundir con lazos de plástico estéril15.
- Permita que las placas se seque y luego colocarlos en una posición invertida (lado de la tapa hacia abajo) en frascos de gas anaerobio. Para mantener la humedad en los frascos, incluyen una placa de Petri que contiene el agua.
- Incube los frascos a 37 º C hasta colonias (normalmente 4-7 días).
- Enumerar segmentos que contienen entre 10 y 100 colonias aisladas.
Nota: Las colonias de H. pylori y el crecimiento de H. felis en las placas pueden distinguirse de los otros miembros de la microbiota gástrica murina utilizando pruebas estándar de ureasa, catalasa y oxidasa. H. pylori y H. felis son positivos para todas las tres pruebas. - Calcular cargas de la bacteriana (UFC/g de tejido), utilizando la siguiente fórmula:
[(Número promedio de colonias contadas) × (factor de dilución) x (volumen plateado)] / (peso del estómago).
-
Detección de la infección de H. felis en tejidos gástricos por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
- Extraer ADN de estómagos de ratón usando protocolos de aislamiento de ADN, o un kit disponible comercialmente.
- Determinar la concentración de ADN de las muestras usando una técnica de cuantificación fluorométrica (véase Tabla de materiales).
- Establecer las reacciones de PCR dirigidas a un fragmento de pares 325-base (PB) de la H. felis ureasa B gene (ureB)21. Cada reacción debe contener: 100 ng de ADN genómico; 1 mM de avance (5'-AAA ATC CAC GAA GAC TGG GG-3') y reversa (5'-CTT TTA TCC AAG TGG TGG CAC CAC-3') cartillas; 200 mM dNTPs; 0,5 unidades de Taq polimerasa y las cantidades apropiadas de buffer y agua libre de nucleasa.
Nota: Este par de oligonucleótidos ha sido diseñado para reconocer y unirse a secuencias homólogas en los genes de H. pylori y H. felis ureB pero cuando se someten a las condiciones PCR por debajo, no de los presentes en la ureB genes de enterohepático Helicobacter spp. - Realizar la amplificación por PCR con el siguiente perfil térmico: calefacción a 94 ° C por 5 min, seguido de 35 ciclos de 94 ° C por 30 s, 61 ° C por 30 s y 72 ° C por 1 min, antes que a 20 ° C.
- Ejecutar los productos PCR en un gel de agarosa al 2% durante 30 min a 100 V.
5. histológicos análisis de Helicobacter -infectan secciones del estómago de ratón
- Procesamiento de los tejidos del estómago
- Quitar los tejidos del estómago del formol y en platos de Petri limpios.
- Cortar los tejidos del estómago con un bisturí en varias tiras longitudinales igual tamaño (cada 2-3 mm.) y en cassettes empotrar etiquetados con relleno de espuma.
- Fijar los tejidos del estómago mediante la colocación de cassettes de inclusión en una jarra llenada con etanol al 80%.
Nota: Estómagos se procesan de inmediato o almacenados hasta 1 – 2 días antes de proceder al siguiente paso. - Proceso de estómagos en un procesador automatizado de tejido, programado con los siguientes ajustes:
Deshidratación: 70% de etanol - 1 ciclo, 20 min; 90% etanol - 1 ciclo, 20 min; 100% de etanol - 2 ciclos, 20 min + 1 ciclo, ciclo de 40 minutos + 1, 1 h.
Claro: xileno – ciclos de 2, 30 min + 1 ciclo, 45 min.
Impregnación: cera de parafina a 60 ° C - 1 ciclo, ciclo 45 min + 1, ciclo 1 h + 1, h 1,25. - Retirar las muestras procesadas de la máquina y almacenar a temperatura ambiente para inclusión en parafina.
- Inclusión en parafina de los tejidos gástricos procesados
- Coloque los moldes base de acero inoxidable en la etapa de la unidad de inclusión a las bases de los moldes.
Nota: Inclusión de la máquina debe establecerse a 60 ° C para inclusión en parafina eficiente. - Lugar encerado casetes que contienen las muestras en una cera tibia caliente baño área de la placa de la unidad de inclusión hasta que la cera se disuelva completamente.
Nota: Se recomienda que la muestra ser encajado poco después disuelve la cera. Esto asegura que no se produce endurecimiento de los tejidos. - Llene la mitad de los moldes de acero inoxidable con cera de parafina. Usando pinzas calientes, retire las tiras de tejido de estómago los casetes y suavemente empuje que el estómago las tiras a través de la parafina a la base de los moldes. Orientar cuidadosamente tiras de tejido en ángulo recto con la base de los moldes para que sus extremos en rodajas son hacia arriba.
Nota: Los pasos siguientes deben realizarse lo antes posible para evitar el endurecimiento y la separación de las capas de parafina en bloques incrustados. La orientación adecuada de los tejidos del estómago es fundamental para los posteriores análisis. - Coloque los moldes en la placa de frío de la unidad de fijación para fijar a las muestras en el lugar y reorientar los tejidos si es necesario.
Nota: Si los tejidos se descolocado y la parafina empieza a endurecerse, coloque los moldes en la placa caliente para fundir la cera y volver a embeber los tejidos en moldes. - Colocar la mitad de los cassettes empotrar etiquetados (que fueron utilizados para el procesamiento de tejido) en la parte superior de los moldes y rellenar suavemente con cera tibia. No permita que la parafina se desborde.
- Suavemente Coloque los moldes sobre una placa fría y deje que se enfríe.
- Una vez que la parafina ha puesto completamente, separar los bloques integrados de moldes. Limpiar exceso de parafina en los bordes de la cinta utilizando un plato caliente (situado por encima de 80 ° C) o un raspador. Bloques se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta de seccionamiento se realiza.
- Coloque los moldes base de acero inoxidable en la etapa de la unidad de inclusión a las bases de los moldes.
- Seccionamiento de tejidos
- Bloques de tejido parafina-encajado en el hielo de enfriar y calentar un baño de agua con agua ultrapura a 40 – 45 ° C.
- Fije la lámina en el soporte del microtomo y fijar el ángulo de separación entre 1 – 5 º para evitar el contacto entre la faceta de cara y un cuchillo de bloque, antes de insertar los bloques de parafina.
Nota: Sean bloques de parafina de exceso de la incrustación, dado que esto puede obstaculizar el ajuste del bloque. - Orientar la hoja para un corte recto a través del bloque. Con cuidado corte secciones delgadas de 2-3 para facilitar la correcta colocación del bloque.
- Cortar bloques de un espesor de aproximadamente 10-30 mm. Este paso asegura que se cortará una superficie máxima de cada tira de tejido.
- Corte 10 μm secciones y descarte cualquier que contienen agujeros causados por corte.
- Cuidadosamente levante secciones con pinzas y flotan en el baño de agua para aplanar. Utilice unas pinzas para separar cada sección.
- Recoge secciones del baño de agua y colóquelo en un portaobjetos de vidrio cargada (véase Tabla de materiales).
- Almacene verticalmente en una parrilla portaobjetos y coloque en una incubadora a 37 ° C. Secciones secas durante la noche.
- Guardar secciones a temperatura ambiente por tiempo indefinido para los análisis posteriores.
- Haematoxylin y eosina (H & E) tinción de los tejidos del estómago
- Dewax diapositivas, utilizando los 3 lavados de xileno durante 5 minutos cada uno, seguido de 3 lavados en etanol al 100%, durante 3 minutos. Garantizar soluciones frescas se utilizan en cada etapa.
- Enjuague diapositivas de agua del grifo para 30 a 60 s.
- Eliminar el exceso de agua golpeando suavemente la parte inferior de las diapositivas en una toalla de papel. Tinción con hematoxilina filtrada min 3 Asegúrese de que las secciones son suficientemente cubierto con la solución.
- Enjuague los portaobjetos con agua corriente hasta que el agua salga claro.
- Sumerja los portaobjetos en agua del grifo de Scott para 8 – 10 s. No exponga las transparencias a la solución de más de 10 s como esto tendrá como resultado las manchas más oscuras e intensas. Tinción de secciones puede verse bajo un microscopio. Coloración eficiente en esta etapa tendrá como resultado un color 'baby blue'.
Nota: Prepare agua de Scott disolviendo 2 g de Hidrogenocarbonato de sodio (NaHCO3) y 20 g de sulfato de magnesio (MgSO4) en 1 L de agua destilada. - Enjuague diapositivas de agua del grifo para 30 a 60 s.
- Eliminar el exceso de agua como se describe en el paso 3 y luego la mancha con filtrado 1% eosina acuosa durante 3 minutos.
- Enjuague los portaobjetos con agua corriente hasta que el agua salga claro.
Nota: La coloración puede ser evaluada usando un microscopio de luz. Si la coloración es demasiado oscura, diapositivas pueden ser deshidratadas en etanol al 100% por más tiempo del especificado. Si se requiere la coloración más oscura, diapositivas pueden teñirse con eosina durante 1 – 2 min más, antes de proceder a realizar los siguientes pasos. - Deshidratar diapositivas, utilizando 3 capas de 100% de etanol por 30 s cada uno, seguido por 3 lavados de xileno durante 2 minutos. Garantizar soluciones frescas se utilizan en cada etapa.
- Montaje de diapositivas con medio de montaje. Añada una gota de medio de montaje en el centro de un cubreobjetos limpio antes de colocar suavemente deslice en la parte superior con secciones hacia abajo.
Nota: No seque diapositivas antes de deslizamiento de la cubierta. - Coloque el portaobjetos sobre una superficie plana y deje secar al aire. Diapositivas también pueden ser secadas en una campana de humos para acelerar tiempo de secado.
- Giemsa, tinción de los tejidos del estómago
- Dewax diapositivas, utilizando 2 lavados de histolene de 5 minutos cada uno, seguido de 2 lavados de etanol 100% por 3 min y luego un último lavado en etanol al 70% para asegurar soluciones frescas se utilizan para cada colada de 3 minutos.
- Enjuague diapositivas de agua del grifo para 30 a 60 s.
- Preparar solución de Giemsa tinción de Giemsa de 20% de mezcla con agua destilado el 80%. Tinción de portaobjetos con solución de Giemsa durante 1 hora.
- Coloque los portaobjetos en 100 mL de agua destilada que contiene 3-4 gotas de ácido acético en 2 – 3 s.
Nota: Solución debe mezclarse bien antes del uso. En esta etapa, diapositivas deben aparecer color azul pálido. - Lavar portaobjetos en etanol al 96% durante 30 s.
- Lavar las diapositivas de 3 baños de isopropanol por 2 min cada una, seguido de 3 baños de histolene de 2 minutos cada uno. Utilizar isopropanol fresco y histolene para cada lavado.
- Cubreobjetos portaobjetos con medio de montaje, como se describió anteriormente.
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Representative Results
Este protocolo describe una técnica oral por sonda nasogástrica para lograr balon infección por H. pylori o H. felis en modelos de ratón murino (figura 1). Después de la eutanasia, estómagos se quitan, pesados y divididos en 2 mitades iguales formada por el antro, cuerpo y regiones no glandulares de los tejidos gástricos (figura 2). La región no glandular es eliminada antes de realizar cualquier análisis.
La colonización exitosa de animales se confirma típicamente realizando conteo de viables de H. pylori-infectado homogenados gástrico y posteriormente la enumeración de colonias individuales en placas HBA (figura 3). Alternativamente, la PCR se emplea para verificar la infección con H. felis usando las cartillas específicas, validados encaminadas una región de bp 325 del H. felis y H. pylori ureB genes (figura 4).
Se procesan los tejidos gástricos, encajado y seccionado para aplicaciones posteriores histológicas. La H & E tinción de técnica se utilizan para evaluar la histopatología en Helicobacter-infectado de ratones. En el ejemplo actual, WT C57BL/6 ratones muestran signos moderados de inflamación, incluyendo hiperplasia (agrandamiento mucosa) y atrofia de la glándula en la infección después de 6 meses con H. felis. La presencia de infiltrados celulares puede observarse también en la sub mucosa. Curiosamente, sin embargo, la inflamación más severa se observa en ratones KO en el mismo punto de tiempo, con la presencia adicional de los folículos linfoides situados en proximidad cercana a infiltrados celulares (figura 5). Por último, las bacterias de H. felis se observan en secciones Giemsa-manchada del estómago de ratón infectados (figura 6).
Figura 1: imagen demostrando la técnica oral por sonda nasogástrica. Una jeringa desechable de 1 mL y catéter flexible se utilizan para entregar ≥ 105 UFC de inóculos bacterianos a un ratón vía intragástrica. El ratón fue anestesiado con metoxiflurano y llevó a cabo en un agarre firme en el cuello, lo que permite el acceso del catéter hasta el estómago por el esófago.
Figura 2: cosecha de bazos de ratón y estómagos post-infección. Estómago de ratón fueron cosechadas la eutanasia y su contenido quitado raspando con un bisturí y lavado en PBS estéril. Los tejidos fueron pesados y aplanados en una hoja de algodón para revelar 2 iguales mitades, cada que el antro gástrico, cuerpo y regiones no glandulares; Barra de escala = 10 mm.
Figura 3: Recuentos viables de H. pylori -infectan estómagos de ratón. Ratones en el fondo de C57BL/6 fueron inoculados con 107 UFC de H. pylori SS1 e izquierda durante 8 semanas. (A) de diluciones de cada homogenado gástrico se platean en medio (o tercera) de una placa HBA y cargas bacterianas evaluadas mediante la enumeración de colonias individuales de 10-100. La mitad izquierda de la placa muestra un cultivo puro de la bacteria H. pylori . (B) la presencia de bacterias contaminantes de la ratón gástrico microbiota (izquierda) o gran número de colonias de H. pylori (derecha) puede complicar la enumeración de unidades formadoras de colonias de H. pylori . (C) los ejemplos más comunes de bacterias contaminantes en muestras de homogeneizado gástrico. Barra de escala = 1,7 cm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Detección de PCR de la infección de H. felis en biopsias gástricas mediante oligonucleótidos dirigidos al gen de la ureB . Un par de oligonucleótidos específicos fue diseñado para reconocer y unirse a secuencias homólogas en los genes de H. felis y H. pylori ureB . Estos iniciadores se validaron usando la DNA genomic de H. pylori SS1 (carril 2) o H. felis (carril 3). Agua desionizada se incluyó como control negativo (carril 1).
Figura 5: Secciones representativas imágenes de H & estómago E manchado de los ratones WT y KO en la infección después de 6 meses con H. felis. Las secciones de tejido embebido en parafina fueron teñidas con H & E. WT ratones recibir caldo BHI solo (control) tenían un epitelio gástrico normal y no hay inflamación significativa. En contraste, animales WT con crónica H. felis infección muestra niveles moderados de inflamación y engrosamiento de mucosa que era más exacerbado en H. felis-KO animales infectados. Las secciones de tejido de H. felis-ratones KO infectados exhibieron la presencia de folículos linfoides mucosa (*), infiltrados celulares (→), atrofia de la glándula (▶) y la hiperplasia. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imágenes representativas de Giemsa-manchada secciones gástricas en ratones C57BL/6 WT en infección después de 3 meses con H. felis. Las secciones de tejido embebido en parafina fueron teñidas con Giemsa. Las flechas indican la presencia de H. felis en las glándulas gástricas. Barra de escala = 200 μm.
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Discussion
Este protocolo describe el uso de un modelo de ratón en vivo para la infección por Helicobacter . Los pasos críticos del procedimiento son el: 1) preparación de los inóculos de Helicobacter que contiene bacterias viables y móviles; 2) la entrega de los números apropiados de bacterias para el ratón mediante sonda intragástrica; 3) detección de infección bacteriana por recuento de colonias o PCR; y 4) procesamiento de los tejidos gástricos para permitir la evaluación de la histopatología en infectados estómagos. Más sugerencias para modificaciones, consideraciones técnicas y solución de problemas se discuten a continuación.
El método de cultivo de Helicobacter spp utilizando Agar sangre Base nº 2 suplementado con sangre de caballo se ha establecido en nuestro laboratorio. Sin embargo, alternativa agar bases tales como agar Brucella y agar de sangre de Colombia también pueden ser usados22. Es importante garantizar que la cristalería sólo estéril libre de detergente se utiliza para preparar el medio de crecimiento. Además, para obtener un crecimiento óptimo, las bacterias H. pylori deben ser rutinariamente subcultivadas en placas de agar que tienen restos de humedad y no están secas. Al preparar Helicobacter spp. inóculo para la infección, es vital para subcultivo H. pylori y H. felis cepas cada 1 a 1,5 o 2 días, respectivamente, para asegurar la viabilidad bacteriana. En cada subcultura, las bacterias deben ser evaluadas para su viabilidad y motilidad por microscopía de contraste de fase. Una prueba de la ureasa también puede emplearse rutinariamente para discriminar entre gástrico Helicobacter spp y otras bacterias23, sin embargo, es importante tener en cuenta que este ensayo detecta bacteria Helicobacter viable y no viables. Después de la inoculación de los animales, deben realizarse recuentos viables en suspensiones de Helicobacter para cuantificar el número de bacterias viables que se utiliza para la infección. Como H. felis no reproducible de forma colonias aisladas en medio de agar15, estimación de números bacterianos se realiza mediante microscopía de contraste de fase. Cuantificación de números bacterianas por la medida de la densidad óptica (A600) solamente es inexacta como este método no discrimina entre bacterias viables y no viables. Este método no debe utilizarse en la investigación de Helicobacter sin optimización rigurosa, como se describe anteriormente (sección 1.5).
Cuando se realiza estudios de infección de Helicobacter , es crucial considerar el ratón óptima y cepa de Helicobacter , así como la duración de la infección, para satisfacer el propósito del experimento. También es esencial para confirmar periódicamente que los animales utilizados para experimentación son Helicobacter-libre usando género-específicas PCR primers24. La presencia de otras especies entéricas de Helicobacter , como Helicobacter bilis, Helicobacter hepaticus o Helicobacter muridarum, puede alterar la susceptibilidad de la enfermedad de los ratones e introducir factores de confusión en en vivo estudios25,26. También es recomendable incluir un grupo de control tratamiento simulado de los animales (es decir, caldo alimentado solamente) en experimentos de prueba inicial para investigar los efectos de la microbiota normal en colonización de Helicobacter y patogenesia.
La eutanasia, colonización de H. pylori en estómago murino puede medirse contando viable. Placas HBA utilizadas para recuentos de colonias deben complementarse con bacitracina y nalidíxico ácido además de Suplemento selectivo de Skirrow modificado, a restringir el crecimiento de la especie bacteriana de la microbiota gástrica normal y por lo tanto, prevenir la contaminación 27. H. felis siempre no forman colonias, pero en cambio tiende a formar enjambre crecimiento en placas de agar15,28. Por lo tanto, PCR y qPCR son normalmente empleados para determinar la presencia y niveles de H. felis, respectivamente29,30. En la sección 4.2, presentamos un método simple y rápido de PCR para confirmar la colonización por H. felis en el estómago de ratón utilizando un par de cebadores, que se han validado a una región de bp 325 de H. felis y H. pylori ureB genes. Usando las condiciones PCR descritas anteriormente, es posible discriminar entre la infección por estos spp Helicobacter gástricos y producción de ureasa enterohepática Helicobacters. Otros genes que han sido validados para la detección de PCR de infección gástrica por Helicobacter son el 16s rRNA y flagelina B (flaB) genes15,29,30.
Por último, hemos descrito el uso de dos técnicas de tinción de gran alcance: H & E tinción, para evaluar los cambios histopatológicos de la infección después del estómago; y tinción Giemsa, para detectar la infección H. felis . Para obtener una coloración óptima, es esencial para garantizar que los tejidos han sido conservados, procesados y encajado en la orientación correcta. Además, sólo recién elaborado soluciones y filtra las manchas deben usarse durante este proceso. Las secciones de tejido pueden almacenarse indefinidamente y utilizadas para análisis más específicos de patología gástrica mediante inmunofluorescencia o inmunohistoquímica. Algunas otras medidas comunes de la inflamación gástrica y la enfermedad incluyen: reclutamiento de células inmunes (anti-CD45 tinción). engrosamiento de mucosa o destrucción (tinción de ácido peryódico Schiff/Azul Alcian). proliferación de células epiteliales (antígeno nuclear de proliferación celular, PCNA/bromodeoxiuridina, BrDU coloración); o apoptosis celular (tinción TUNEL). Los folículos linfoides en el H & tejidos teñidos E de H. felis -infectadas ratones pueden confirmarse por inmunohistoquímica, utilizando anticuerpos dirigidos contra B (B220+) y células T (CD3+) antígenos31.
En Resumen, los modelos animales de enfermedad bacteriana proporcionan herramientas valiosas en el campo de la biología de la infección. Los protocolos de sonda balon y procesamiento de los tejidos del estómago proporcionan aquí puede adaptarse a modelos de ratón infección con otros patógenos entéricos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a la Sra. A. De Paoli y la Sra. Georgie Wray-McCann para asistencia técnica. Los autores reconocen el uso de las instalaciones y asistencia técnica de Monash plataforma de histología, Departamento de anatomía y Biología del desarrollo, Universidad de Monash. El laboratorio es apoyado por el financiamiento de la salud nacional y el Consejo de investigación médica (NHMRC) a RLF (APP1079930, APP1107930). RLF es apoyado por una beca de investigación Senior de la NHMRC (APP1079904). KD y MC son apoyados por becas de postgrado de Monash. KD también es apoyado por el centro para la inmunidad innata y la infecciosa enfermedades, del Instituto Hudson de investigación médica, mientras que MC tiene una beca de Postgrado Internacional de la Facultad de medicina, enfermería y Ciencias de la salud, Universidad de Monash. Investigación en el Instituto de investigación médica de Hudson es apoyado por el programa de apoyo a infraestructura operacional del gobierno victoriano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61 °C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10x PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10 mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4 °C | ||
| 23 g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 mL tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 - 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
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